阅读说明：本技术 工程化抗原递呈细胞及其在用于活化cd3+免疫细胞中的应用 (Engineered antigen presenting cells and their use for activating CD3+ immune cells ) 是由 蒋俊 文高柳 林鑫 于 2019-11-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开工程化抗原递呈细胞及其在用于活化CD3+免疫细胞中的应用。本发明的工程化抗原递呈细胞通过工程化手段在野生型抗原递呈细胞内引入外源基因从而过表达重组白介素-12和可溶性CD80而得到。本发明通过重组白介素-12和可溶性CD80的组合协同作用促进CD3+免疫细胞的活化。(The invention discloses an engineered antigen presenting cell and application thereof in activating CD3+ immune cells. The engineered antigen presenting cell is obtained by introducing exogenous genes into a wild-type antigen presenting cell through an engineering means so as to over-express recombinant interleukin-12 and soluble CD 80. The invention promotes the activation of CD3+ immune cells through the combined synergistic effect of recombinant interleukin-12 and soluble CD 80.)

工程化抗原递呈细胞及其在用于活化CD3+免疫细胞中的应用

技术领域

本发明涉及免疫学以及医药领域，具体地涉及工程化抗原递呈细胞及其在用于活化CD3+免疫细胞中的应用。

背景技术

白细胞介素-12(interleukin-12，IL-12)由抗原提呈细胞和B细胞产生，是一种异源二聚体形式的前炎症细胞因子，并以这种形式分泌到细胞外。IL-12能诱导IFN-γ产生，在体内免疫应答中(特别是在细菌或寄生虫感染中)它也是IFN-γ产生所必需。

DC细胞是合成IL-12的第一个细胞，并发现它依赖于IFN-γ和来自T细胞的信号。和其他的炎症细胞因子相似，IL-12的生成受正性和负性调节机制严格控制。不同的细胞因子如IFN-γ、TNF-β、GM-CSF能增强细胞产生IL-12的能力，IFN-γ能增强编码p40和p35的基因的转录，它对异源二聚体的产生具有特别明显的效应，在炎症和Th1应答中，IFN-γ与IL-12生成的能力形成正反馈机制。

在机体抗肿瘤免疫中，肿瘤可以通过免疫耐受、抗原调变和免疫抑制因子等方式进行免疫逃避。研究发现，肿瘤患者存在DC数量减少及功能缺陷的特点，肿瘤组织及其周围浸润DC的数量、功能与肿瘤的发生、发展、转移、预后有着密切的关系。DC密集浸润的肿瘤分化程度高，预后较好；而DC轻度浸润的肿瘤常伴有分化程度低和恶性进展。肿瘤细胞具有较高水平的Fas表达，能诱导FasL表达的淋巴细胞凋亡，并能分泌TGF-β、IL-10等免疫抑制性细胞因子，导致抗原提呈能力下降，从而逃避免疫攻击。

近年来，已经清楚了免疫系统确实识别肿瘤抗原，但是尽管存在肿瘤抗原，T细胞确保持静止状态。有假说认为：患者体内的抗原呈递细胞，不能正确识别肿瘤抗原，将之呈递给T淋巴细胞，引起肿瘤特异的免疫应答。因此，如何活化免疫耐受的免疫细胞，引起肿瘤特异的免疫应答成为目前肿瘤免疫研究中的一个重点。

发明内容

本发明提供一种工程化免疫细胞，用于解决现有技术中的至少部分技术问题。本发明发现通过工程化手段改造抗原递呈细胞使其在过量表达重组的白介素-12的同时分泌可溶性的CD80片段可以大大提高其活化CD3+免疫细胞的能力。至少部分地基于该发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供一种工程化抗原递呈细胞，其通过工程化手段在野生型抗原递呈细胞内引入外源基因从而过表达重组白介素-12和可溶性CD80而得到。

根据本发明的工程化抗原递呈细胞，其中，所述外源基因包含编码重组白介素-12的基因和编码可溶性CD80的基因。

根据本发明的工程化抗原递呈细胞，其中，所述重组白介素-12为p40和p35两个亚基的融合蛋白，且编码所述重组白介素-12的基因序列如SEQ ID No.1所示或与其同源性为95％以上且来源于同一物种。

根据本发明的工程化抗原递呈细胞，其中，所述可溶性CD80包含CD80的胞外区，编码所述可溶性CD80的基因序列如SEQ ID No.2所示或与其同源性为95％以上且来源于同一物种。

根据本发明的工程化抗原递呈细胞，其进一步包含抗原或编码所述抗原的核酸。

根据本发明的工程化抗原递呈细胞，其中，所述抗原为GPC3抗原。

根据本发明的工程化抗原递呈细胞，其中，其为树突细胞。

本发明的第二方面，提供一种免疫调节组合物，其包含第一方面所述的工程化抗原递呈细胞和/或其分泌物。

本发明的第三方面，提供一种用于活化CD3+免疫细胞的方法，其包括使第一方面所述的工程化免疫细胞或第二方面所述的免疫调节组合物与免疫耐受的CD3+免疫细胞接触的步骤。

根据用于活化CD3+免疫细胞的方法，其中，所述CD3+免疫细胞为体外细胞。

本发明在大量筛选实验的基础上发现可溶性CD80可大大增强IL-12活化CD3+细胞的能力，两者可发挥协同作用，可促进CD3+免疫细胞例如T细胞的持续扩增，产生更多的有抗肿瘤活性的淋巴细胞，提高***。

附图说明

图1为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD8 T细胞免疫应答结果。图1的各组柱中，从左到右分别为CD8 IFN-γ+、CD8 IFN-γ+,TNF-α+、CD8 TNF-α+细胞占总CD8 T细胞的比例。

图2为使用编码本发明组合物各组分蛋白的mRNA以及GPC3抗原mRNA转染DC细胞后，在体外致敏T细胞的实验中CD4 T细胞免疫应答结果。图2的各组柱中，从左到右分别为CD4 IFN-γ+、CD4 IFN-γ+,TNF-α+、CD4 TNF-α+细胞占总CD4 T细胞的比例。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[工程化免疫细胞]

本发明的第一方面，提供一种工程化抗原递呈细胞，其可作为免疫调节组合物与相应抗原一起活化免疫细胞。本发明的工程化抗原递呈细胞通过工程化手段在野生型抗原递呈细胞内引入外源基因从而过表达重组白介素-12和可溶性CD80而得到。

本发明中，野生型抗原递呈细胞一般是指从受试者机体分离得到的天然抗原递呈细胞。受试者一般为哺乳动物，其实例包括大鼠、小鼠、猪、兔和灵长类动物。受试者还优选为人类。

本发明中，外源基因是指来源于野生型抗原递呈细胞外的基因，包括与野生型抗原递呈细胞不同受试者来源或相同来源的基因，优选地，野生型抗原递呈细胞与外源基因为同一来源，例如均来源于人类。

本发明中，外源基因包含编码重组白介素-12的基因和编码可溶性CD80的基因。已知IL-12是一由p35和p40两条链组成的异源二聚体p70，两个亚单位通过二硫键连接在一起。在天然情况下，p40的量远超出p70。过量的p40可形成p40同源二聚体，其没有生物学活性，但它能和IL-12Rβ结合，与p70竞争性争夺IL-12受体(IL-12R)而拮抗其生物学作用。基于此，本发明优选使用p40和p35两个亚基的融合蛋白。通过该融合蛋白避免了天然情况下多余p40产生，产生了预料不到的有益效果。

本发明中，重组白介素-12具有天然IL-12类似的功能，能使活化的T细胞增殖并增加其细胞毒活性，诱导NK细胞和T细胞产生γ-干扰素(IFN-γ)，调节Th1/Th2细胞发育，促使其向Th1细胞分化。本发明中，重组IL-12还能诱生CTL免疫应答的细胞因子，启动细胞介导的免疫反应。重组IL-12不但能活化先天性免疫细胞，促使APC功能，特别是促使DC成熟，提高抗原提呈的效率。另外，重组IL-12还协同IL-18促进记忆性T细胞的活化作用，使其能迅速消除被感染的细胞，同时促进其它细胞因子的分泌，抑制病毒复制，调节其它细胞免疫功能。

在某些实施方案中，本发明的重组IL-12由SEQ ID No.1所示序列的基因编码得到，由此产生的重组IL-12中缺少IL-12p35的信号肽序列。本领域技术人员容易理解，SEQID No.1所示的序列仅为示例性的，在该序列的基础上可进行改造而不影响本发明目的的实现。此类改造包括使用偏好性密码子对SEQ ID No.1进行优化。因此，本发明还可以使用与SEQ ID No.1的同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。

本发明中，重组IL-12的氨基酸序列不特别限定，其实例包括SEQ ID No.3所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。

本发明的CD80属免疫球蛋白超家族(immunogloblin superfamily，IgSF)，以寡聚体形式存在于多数的抗原呈递细胞，如树突状细胞、活化的T细胞、B细胞以及巨噬细胞等。已知CD80是表达APC上的重要协同刺激分子，与T细胞CD28结合后，对于抗原诱导初始T细胞活化、增殖及效应功能的产生具有重要的始动调节作用，是一个正性因子。在野生条件下，CD80作为膜蛋白结合于细胞的表面。本发明发现与此不同的是可溶性CD80能够分泌于细胞外部，并且作为可溶性片段能够协同促进IL-12活化免疫细胞的能力。其原因可能在于一方面可溶性CD80因其可溶性可自由度增加，而使与更容易与其受体例如CD28结合，从而增强了下游信号的转导。另一方面CD80作为IL-12下游的因子，当其过量产生时会产生反馈性抑制从而负性调节IL-12的产生或活化，而本发明通过同时过表达重组IL-12和可溶性CD80而不受负性调节的影响，因此能够大大增强其活化免疫细胞的能力。

本发明中，可溶性CD80为包含CD80胞外结构域的片段。优选地，进一步包含其他片段。其他片段的实例包括但不限于Fc片段，其有利于延长蛋白的半衰期和提高稳定性。优选使用较长的Fc片段以增大分子体积。但是如果分子体积过大，则可能影响可溶性CD80的活性。因此，Fc片段的长度或大小影响本发明目的实现。对于本发明而言，Fc片段的长度一般为105-315AA，优选120-315AA。本发明的Fc片段可包含免疫球蛋白中天然存在的片段，还可包括通过已知的基因工程手段对天然存在的Fc片段进行改造，以获得更优性能的突变型Fc片段。例如，Fc段包含“YTE”3个突变的片段，即252、254和256的蛋氨酸(Met，M)、丝氨酸(Ser，S)和苏氨酸(Thr，T)分别被酪氨酸(Tyr，Y)、T和谷氨酸(Glu，E)替换，由此获得半衰期更长的可溶性蛋白。再例如，通过对Fc片段的二硫键的基因工程改造和修饰，可以使Fc蛋白聚集成多聚体的复合物，由此获得稳定性更优的可溶性蛋白。

在某些实施方案中，本发明的可溶性CD80由SEQ ID No.2所示的序列或与其同源性为95％以上，优选96％以上，更优选98％以上，进一步优选99％以上的序列编码得到。本发明中，可溶性CD80的氨基酸序列不特别限定，其实例包括SEQ ID No.4所示的序列，或与其同源性为95％以上，优选97％以上，更优选99％以上且来源于同一物种的序列。

本发明中，工程化细胞是指人为改造的细胞。本文中，抗原递呈细胞是指机体内具有摄取、处理和传递抗原信息，并将抗原递呈给免疫细胞并辅助和调节T细胞、B细胞识别抗原并诱发免疫应答作用的细胞。其实例包括但不限于巨噬细胞、树突状细胞、并指状细胞、郎罕细胞和B细胞。优选地，本发明的免疫细胞为树突状细胞，更优选为人源树突细胞。本发明的树突细胞可以是成熟的树突细胞，也可以是未成熟的树突细胞。需要注意的是，这里的树突状细胞为通过体外诱导培养获得，即，通过外周血单核细胞(PBMC)，在不同类型培养基和各类细胞因子的刺激下诱导PBMC成为DC细胞。在具体实施方案中，进行体外培养所使用的培养基包括AIM-V培养基、iDC培养基和mDC培养基，进行体外诱导培养的使用的细胞因子其实例包括但不限于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4。

优选地，本发明的抗原递呈细胞还包含抗原或能够产生抗原的前体，和第一方面所述的组合物。“抗原”指可以被免疫系统识别，并能够通过形成抗体或/和抗原特异性T细胞而引起抗原特异的免疫应答的物质。一般地，抗原可以是包含至少一个抗原表位，由APC捕获并且可以被呈递到T细胞表面的蛋白或者多肽。在本发明中，抗原可以是mRNA翻译的产物，也可以是DNA转录翻译后的产物。在某些实施方案中，本发明的抗原为与原发性肝癌发生和发展密切相关的GPC3抗原。

[免疫调节组合物]

本发明的第二方面，提供一种免疫调节组合物，其包含第一方面所述的工程化细胞和/或其分泌物，其能够为有需要的受试者提供一种或多种抗原(优选肿瘤原)，并调节(特别是增强)该抗原的免疫性，进而减轻、缓解、延缓或治愈受试者所患病况或病症。与单独提供抗原的药物相比，或提供抗原和IL-12或CD80的组合物相比，本发明的药物组合物具有增强、提高或加强的免疫能力。本发明的免疫调节组合物可选地还可包含其他成分，例如药物学可接受载体。合适的药物学可接受载体的实例包括但不限于：1)Dulbecco磷酸缓冲盐溶液，pH约7.4，包含或不包含大约1mg/ml到25mg/ml人血清白蛋白；2)0.9％盐水(0.9％w/v氯化钠)，和3)5％(w/v)葡萄糖；也可以包含抗氧化剂例如色胺和稳定剂例如Tween20。

[用于活化CD3+免疫细胞的方法]

本发明的第三方面，提供一种用于活化CD3+免疫细胞的方法，其包括使第一方面所述的工程化免疫细胞或第二方面所述的免疫调节组合物与CD3+免疫细胞接触的步骤。其中CD3+免疫细胞优选为免疫耐受的CD3+免疫细胞。本文中，CD3+免疫细胞是指表面包含CD3的细胞，优选CD3+T细胞

在示例性活化CD3+免疫细胞的方法中，其包括以下步骤：

(1)制备核酸构建体，其中核酸构建体可以是一种，也可以是多种，其包括表达重组白介素-12的核酸、表达可溶性CD80的核酸以及可选地表达抗原的核酸；

(2)进行体外转录以获得相应的核糖核酸分子；

(3)进行体外诱导培养以获得用于表达步骤(2)的核糖核酸分子的抗原递呈细胞；

(4)通过转染使步骤(2)的核糖核酸分子导入步骤(3)的抗原递呈细胞并进行表达，从而得到工程化免疫细胞；和

(5)使工程化免疫细胞与CD3+免疫细胞进行接触或共培养。

制备例1

本制备例用于制备编码抗原以及作为白介素复合物前体的DNA和mRNA

1.制备DNA和mRNA构建体

分别构建用于产生编码IL12 p70以及可溶性CD80 mRNA的DNA序列，并且用于后续的体外转录反应。在编码序列之后是一段多聚腺苷片段。这些DNA序列信息如下表1所示。

另外，构建用于体外致敏的人肿瘤抗原GPC3的编码序列，本发明GPC3的编码序列由SEQ ID No.5所示的序列组成，氨基酸序列由SEQ ID No.6所示的序列组成。GPC3的序列可通过Genebank数据库获得。本实施例中使用CN107583042A中公开的抗原。

表-1基因序列表

名称	序列号
		IL-12	SEQ ID No.1
CD80	SEQ ID No.2
		GPC3	SEQ ID No.5

2.体外转录

首先使用限制性内切酶将制备得到的相应DNA质粒线性化，以线性化的质粒为模板，使用T7 RNA聚合酶体外转录制备mRNA。然后用氯化锂沉淀法纯化制备的mRNA。

实施例1

1.DC细胞的体外诱导培养

无菌抽取肝细胞癌患者静脉血50ml，在超净工作台内用淋巴细胞分离液分离外周血单核细胞，将单核细胞加入AIM-V培养基中，放入37℃，5％CO₂培养箱中温育，使单核细胞贴壁。2h后，去掉未贴壁细胞，贴壁细胞加入iDC培养基(AIM-V培养基中加入终浓度为800U/mL的GM-CSF，500U/mL的IL-4)，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养6天。将一半细胞培养基转移到离心管中，500g离心收集细胞，去掉上清，加入等体积的新鲜mDC培养基(mDC新鲜培养基的配置：AIM-V培养基中加入终浓度为1600U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4，TNF-α(5ng/ml)，IL-1β(5ng/ml)，IL-6(150ng/ml)和prostaglandin E2(PGE2)(1μg/ml)，重悬细胞后，加入到培养瓶中，培养8-18个小时，诱导DC细胞成熟。

2.转染DC细胞

转染当天，用非酶类的细胞消化试剂把DC细胞消化成细胞悬液，离心后以PBS洗细胞两次，以PBS重悬细胞，调整细胞密度在25-30×10⁶DCs/ml。按照每10⁶DC细胞转染10μgmRNA的比例，混合DC细胞和抗原mRNA与不同的蛋白IL12和CD80的mRNA组合，将细胞-mRNA混合物加入电转杯，使用ECM630电转仪，将抗原mRNA转染到DC细胞中。电转后的细胞，用无细胞因子的1640培养基中重悬，调整细胞密度到2×10⁵DCs/ml，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱中继续培养6小时。本实验中，使用的mRNA组合如下所述：

1)不加任何mRNA的对照(mDC对照组)

2)只加编码GPC3抗原的mRNA(GPC3对照组)

3)编码GPC3抗原的mRNA与IL-12p70的mRNA(IL12组)

4)编码GPC3抗原的mRNA与CD80的mRNA(CD80组)

5)编码GPC3抗原的mRNA与IL-12p70和CD80的mRNA(实验组)

3.将复苏过夜的外周血单核细胞PBMC以2×10⁶/ml的浓度接种到96孔板中，每个孔接种100μl细胞，进行T淋巴细胞的激活。测试分组情况为：不加DC细胞的PBMC对照组，分别用上一步骤中所述六个分组的DC细胞与PBMC细胞共培养的组；根据分组情况在不同孔中加入负载有相应mRNA的DC细胞，PBMC:DC＝10:1；将细胞于37℃培养10-12天。

4.在共培养的10-12天，进行胞内细胞因子检测。

在收集细胞前5-8h，将培养的T细胞混匀，调整细胞密度到2×10⁶/ml,按照每个孔100μl的体积分别种到96孔板中，于37℃培养箱中孵育。阳性对照为PMA(50ng/ml)+ionomycin(1μg/ml)，阴性对照仅含悬浮细胞。

准备负载抗原的DC细胞作为靶细胞。复苏已经制备的负载抗原的冻存的DC细胞，并用台盼蓝染色计数细胞，用含IL-7及IL-2细胞因子的RPMI完全培养基重悬细胞，并调整细胞浓度为2×10⁵/ml，每孔加入100μl细胞。

在细胞培养液中加入终浓度为2μM Monensin或3μg/ml Brefeldin A，充分混匀。Monensin和Brefeldin A作为蛋白运输的阻断剂，在细胞液中的时间不应超过12h，4-6小时后，进行胞内染色检测。

5.取出细胞，将细胞转移到相应的流式管中，以荧光标记的CD3、CD4、CD8抗体染色细胞后，固定并通透细胞，以荧光标记的TNF-α和IFN-γ抗体进行胞内染色。

6.用流式细胞仪检测淋巴细胞中TNF-α+和IFN-γ+细胞的比例。

结果如图1和图2所示，使用本发明提供的组合物能够显著提高CD8 T细胞亚群中IFN-γ阳性细比例和TNF-α阳性细胞比例，以及CD4 T细胞亚群中TNF-α阳性细胞比例，尤其是与单独使用IL-12和CD80相比，本发明组合物具有协同的免疫细胞活化效果。

与只转染了GPC3抗原的组比，TNF-α阳性的CD4 T细胞比例为0.44％，而在实验组中，TNF-α阳性的CD4 T细胞比例为1.08％，提高了1.45倍。同样的，GPC3组中IFN-γ阳性的CD8 T细胞的比例为0.062％，TNF-α阳性的CD8 T细胞为0.372％，在实验组中，该比例分别为0.266％和1.016％，分别提高了3.29倍和1.73倍，表现出了更好的初始CD4以及CD8 T细胞活化能力。

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

序列表

<110> 启辰生生物科技（珠海）有限公司

<120> 工程化抗原递呈细胞及其在用于活化CD3+免疫细胞中的应用

<141> 2019-11-21

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1812

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 1

atgtggcccc ctgggtcagc ctcccagcca ccgccctcac ctgccgcggc cacaggtctg 60

catccagcgg ctcgccctgt gtccctgcag tgccggctca gcatgtgtcc agcgcgcagc 120

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ccctgcagtt ag 1812

<210> 2

<211> 1425

<212> DNA

<213> 人(Homo sapiens)

<400> 2

atgggccaca cacggaggca gggaacatca ccatccaagt gtccatacct caatttcttt 60

cagctcttgg tgctggctgg tctttctcac ttctgttcag gtgttatcca cgtgaccaag 120

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<210> 3

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ccugugggug cugggccucu gcugcguccu gcugaccuuc gggucgguca gagcugacga 120

ugaaguugau gugcagccuc cuccuccucc uccagacgcu acaugucacc agguccgcuc 180

cuucuuccag aggcugcagc caggacucaa gugggugcca gagacaccag ugccaggaag 240

cgaucugcag gucugucugc cuaagggccc uaccuguugc ucccggaaga uggaggagaa 300

guaccagcug accgccaggc ugaacaugga acagcugcug cagagcgcca gcauggagcu 360

gaaguuccug aucauccaga acgccgccgu guuccaggag gccuucgaga ucgucgugcg 420

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ggccuuugag uucguggggg aguucuucac cgacgugucu cuguacaucc ugggcagcga 540

caucaacgug gacgacaugg ugaacgagcu guucgacagc cuguuccccg ugaucuacac 600

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