合成的生物缀合物
阅读说明：本技术 合成的生物缀合物 (Synthetic bioconjugates ) 是由 约翰·埃里克·帕代里 茱莉娅·陈 萨曼莎·萨哈 于 2018-07-09 设计创作，主要内容包括：本发明提供了生物缀合物及其使用方法,该生物缀合物包含骨架和至少一个支链或非支链的肽,该肽具有至少一个通过间隔物共价结合至其的胶原结合单元。(The present invention provides bioconjugates comprising a scaffold and at least one branched or unbranched peptide having at least one collagen binding unit covalently bound thereto by a spacer, and methods of use thereof.)
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求2017年07月07日提交的美国临时专利申请号62/530,047的利益，其公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明提供包含骨架和至少一个支链肽或非支链肽的生物缀合物，该肽具有至少一个通过间隔物共价结合至其的胶原结合单元。
背景技术
在组织中，细胞被包含各种大分子的细胞外基质(ECM)包围，所述大分子例如是生物缀合物、胶原、透明质酸、层粘连蛋白、纤连蛋白等。在哺乳动物中，生物缀合物是细胞外基质的主要成分，在此它们与其他生物缀合物、透明质酸、以及纤维基质蛋白质(例如胶原)形成大的复合物。随着哺乳动物年龄增长和在某些疾病状态中，身体的某些部位(例如滑膜关节、玻璃体液、脊椎盘、皮肤等)中的细胞外基质会降解，引起不良的症状，例如各种形式的关节炎、视力丧失等。另外，诸如血管损伤、角膜损伤和皮肤伤口的一些组织损伤导致细胞外基质和/或其组分(包括胶原)的暴露。
发明概述
令人惊讶地发现，在聚糖和肽之间具有某些键的生物缀合物导致某些肽与它们的靶标结合增加。还发现具有支链肽会导致结合改善。具体地，具有某些间隔物的生物缀合物提供了增强的胶原结合活性。
本发明提供生物缀合物，其包含聚糖和至少一个共价结合至其的式(I)的结合单元：
((X1)mX2)nX3-L
(I)
其中：
X1是包含胶原结合单元的氨基酸序列；
X2和X3独立地为不存在的；具有1至15个氨基酸的氨基酸序列；或基团
L是5至20个氨基酸的间隔物，该氨基酸选自甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)、或基团
m为1或2；并且
n为1或2。
在一个实施方式中，L不是GSGKRRGSG(SEQ ID NO:)。
在一个实施方式中，X1为肽的N端，并且X3在肽的C端。
在一个实施方式中，式(I)不是RRRKKIQGRSKR(SEQ ID NO:)或RRGGRKWGSFEG(SEQID NO:)。
在一个实施方式中，所述连接基团是-NHNH-。
在一个实施方式中，本发明提供了下式的官能化的肽：
L-NHNH2
其中L是5至20个氨基酸的间隔物，该氨基酸选自甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)、或基团
在一个实施方式中，L是-GSGSGSRR-NHNH-(SEQ ID NO:)。本发明还提供包含GSGSGSRR(SEQ ID NO:)的肽。
本发明还提供式(II)的结合单元：
((X1)mX2)nX3-L
(II)
其中：
X1是包含胶原结合单元的氨基酸序列；
X2和X3独立地为不存在的；具有1至15个氨基酸的氨基酸序列；或基团
L是5至20个氨基酸的间隔物，该氨基酸选自甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)、或基团
m为1或2；并且
n为1或2；
条件是式(II)不是RRRKKIQGRSKR(SEQ ID NO:)或RRGGRKWGSFEG(SEQ ID NO:)。
在某些实施方式中，m为1及n为2。在某些实施方式中，m为2及n为1。在某些实施方式中，m为2及n为2。
在某些实施方式中，X2和X3独立地是不存在的；具有1至15个氨基酸的氨基酸序列，该氨基酸选自甘氨酸(G)、丝氨酸(S)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)；或基团
在某些实施方式中，当m和/或n不是1时，X2和X3中的至少一个包含至少一个精氨酸(R)或赖氨酸(K)。在某些实施方式中，其中当m和/或n不是1时，X2和X3不包含精氨酸(R)或赖氨酸(K)。
在某些实施方式中，L包含酰肼。
具体实施方式
包括但不限于KRR、KKK、(K)nGSG、和(KRR)n-KGSG，其中n是0至5、或1、2、3、4、或5。
在下表中显示了X2和/或X3的示意图。
在一些实施方案中，酰肼基团键合至肽N末端。在一些实施方案中，酰肼基团键合至肽C末端。在一些实施方案中，酰肼基团键合至肽中的氨基酸的侧链，例如谷氨酸和/或天冬氨酸。
在本文描述的实施方案的任一个中，每个聚糖的肽的数量是平均数，其中组合物中的某些生物缀合物可能每个聚糖具有更多的肽，并且某些生物缀合物每个聚糖具有更少的肽。相应地，在一些实施方案中，如本文所述的肽的数量是生物缀合物的组合物中的平均数。例如，在一些实施方案中，生物缀合物是这样的组合物，其中每个聚糖的肽的平均数为约5。在其他实施方案中，每个聚糖的肽的平均数为约6、或约7、或约8、或约9、或约10、或约11、或约12、或约13、或约14、或约15、或约16、或约17、或约18、或约19、或约20、或约25、或约30。
在一些实施方案中，根据用聚糖骨架上的被肽官能化的二糖单元的百分比，可以将每个聚糖的肽的数目描述为“官能化百分比(％)”。例如，可以通过将聚糖的分子量(或平均分子量)(例如约25kDa高至约70kDa、或甚至约100kDa)除以单个二糖单元的分子量(例如约550-800Da、或约650-750Da)，计算存在于聚糖上的可用的二糖单元的总数。在聚糖不含有常规的“二糖单元”(例如海藻酸)的实施方案中，可以通过将聚糖的分子量(或平均分子量)除以单个糖单元的分子量，并乘以2，计算用于本文所示的计算中的聚糖上存在的可用的二糖单元的总数。
在一些实施方案中，存在于聚糖上的可用的二糖单元的数量为约10至约80、或约10至约70、或约15至约70、或约20至约70、或约30至约70、或约35至约70、或约40至约70、或约10至约75、或约15至约75、或约20至约75、或约30至约75、或约35至约75、或约40至约75、或约10至约50、或约20至约50、或约25至约50、或约10至约35、或约15至约35、或约20至约35、或约10至约30、或约15至约30、或约20至约30、或约15、或约20、或约25、或约30、或约35、或约40、或约45、或约50、或约55、或约60、或约65、或约70。
因此，在一些实施方案中，所述聚糖含有约1至约50、或约5至约40％的官能化、或约5至约30％的官能化、或约1至约15％的官能化、或约1至约5％的官能化、或约5至约15％的官能化、或约10至约25％的官能化、或约25至约40％的官能化、或约32％的官能化、或约25％的官能化、或约16％的官能化、或约10％的官能化、或约8％的官能化、或约5％的官能化、或约2.5％的官能化，其中由聚糖上被肽官能化的二糖单元的百分比确定官能化的百分比(％)。在一些实施方案中，聚糖的官能化的百分比(％)是约1％至约50％、或约3％至约40％、或约5％至约30％、或约10％至约20％、或约1％、或约2％、或约5％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％、或约100％。
在某些实施方式中，聚糖用支链肽官能化。在一些实施方式中，该肽具有2-4个支链。因此，在某些实施方式中，聚糖包含约1至约50％的官能化、或约5至约40％的官能化、或约5至约30％的官能化、或约1至约15％的官能化、或约1至约5％的官能化、或约5至约15％的官能化、或约10至约25％的官能化、或约25至约40％的官能化、或约2.5％的官能化、或约5％的官能化、或约8％的官能化、或约10％的官能化或约16％的官能化、或约32％的官能化，其中官能化百分比(％)由被该肽官能化的聚糖上的二糖单元的百分比确定。
在一些实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含如本文所述的生物缀合物和肽，其中所述肽与生物缀合物紧密相关(例如通过离子键)。在一些实施方案中，由此可以形成生物缀合物聚集体。预期的是，生物缀合物聚集体(包含生物缀合物和非共价结合的肽)可以包含1％至200％官能化(由聚糖上被肽官能化的二糖单元的百分比确定)。在一些实施方案中，所述生物缀合物的官能化的百分比(％)是约1％至约50％、或约3％至约40％、或约5％至约30％、或约10％至约20％、或约1％、或约2％、或约5％、或约10％、或约15％、或约20％、或约25％、或约30％、或约35％、或约40％、或约45％、或约50％、或约55％、或约60％、或约65％、或约70％、或约75％、或约80％、或约85％、或约90％、或约95％、或约100％。
预期的是，任何聚糖都可用于本文所述的各种实施方案中，包括但不限于藻酸盐、琼脂糖、葡聚糖、硫酸葡聚糖、软骨素、硫酸软骨素(CS)、皮肤素、硫酸皮肤素(DS)、硫酸乙酰肝素、肝素(Hep)、角蛋白、硫酸角质素和透明质酸(HA)。所述聚糖可以是天然存在的或化学衍生的，例如但不限于部分N-脱硫酸衍生物、部分O-脱硫酸衍生物、和/或部分O-羧甲基化衍生物。
在一些实施方案中，所述聚糖是未经修饰的。在一些实施方案中，所述聚糖不含有氧化裂解的糖环，因此不含有醛官能团。预期的是，本文公开的生物缀合物表现出的有益效果可以至少部分归因于所述聚糖不包含氧化切割的糖环。
这样的连接可以来源于将肽上的酰肼基团与聚糖上的羰基基团(例如羧酸基团或其活化的衍生物)结合，或替代地将聚糖上的酰肼基团与肽上的羰基基团(例如羧酸基团或其活化的衍生物)结合。在一些实施方案中，酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。
在一个实施方案中，所述聚糖是肝素，其中肝素可以包括肝素衍生物，例如但不限于部分N-和/或部分O-脱硫酸化的肝素衍生物、部分O-羧甲基化的肝素衍生物、或其组合。在一些实施方案中，所述肝素是非氧化的肝素(即不含氧化裂解的糖环)并且不含醛官能团。肝素衍生物和/或提供肝素衍生物(例如部分N-脱硫酸肝素和/或部分O-脱硫酸肝素(即2-O和/或6-O-脱硫酸肝素))的方法，在本领域中是已知的(参见例如Kariya et al.,J.Biol.Chem.,2000,275:25949-5958；Lapierre,et al.Glycobiology,1996,6(3):355-366)。还考虑的是，部分O-羧甲基化肝素(或任何聚糖)衍生物，例如可以根据Prestwich等人(US 2012/0142907；US 2010/0330143)制备的，可用于提供本文公开的生物缀合物。
在一些实施方案中，改变聚糖的分子量以调节生物缀合物的作用(参见例如Radek,K.A.,et al.,Wound Repair Regen.,2009,17:118-126；和Taylor,K.R.,et al.,J.Biol.Chem.,2005,280:5300-5306)。在另一个实施方案中，通过氧化和碱性消除将聚糖降解(参见例如Fransson,L.A.,et al.,Eur.J.Biochem.,1980,106:59-69)以提供具有较低分子量(例如约10kDa至约50kDa)的降解聚糖。
在一个实施方案中，所述聚糖是硫酸皮肤素(DS)。DS的生物功能是广泛的，包括生长因子FGF-2、FGF-7和FGF-10的结合和活化，其促进内皮细胞和角质形成细胞增殖和迁移。在一些实施方案中，硫酸皮肤素的重量范围为约10kDa至约70kDa。在一个实施方案中，硫酸皮肤素的分子量约为46kDa。在另一个实施方案中，通过氧化和碱性消除将硫酸皮肤素降解(参见例如Fransson,L.A.,et al.,Eur.J.Biochem.,1980,106:59-69)以提供具有较低分子量(例如约10kDa)的降解的硫酸皮肤素。
在另一个实施方案中，所述聚糖是肝素。肝素的各种分子量可以用于本文所述的生物缀合物中，例如从约650-700Da的单个二糖单元至约50kDa。在一些实施方案中，所述肝素为约10至约20kDa。在一些实施方案中，所述肝素高达约15、或约16、或约17、或约18、或约19、或约20kDa。在一些实施方案中，肝素可以在不切割一个或多个糖环的条件下被氧化(参见例如Wang,et al.Biomacromolecules 2013,14(7):2427-2432)。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10、或约5个结合单元，其中所述结合单元包括RRANAALKAGELYKSILY(SEQ ID NO:)或RRANAALKAGELYKSILYGSG(SEQID NO:)中的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。结合单位可以在相同或不同的肽内。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于肽上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是肝素。在一些实施方案中，所述肝素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10、或约8、或约5个结合单元，其中所述结合单元包括GQLYKSILY(SEQ ID NO:)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10、或约8、或约5个结合单元，其中所述结合单元包括GQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ ID NO:)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一个实施方案中，所述生物缀合物包括聚糖和约5至约10、或约8、或约5个结合单元，其中所述结合单元包括GQLYKSILYGSGSGSRR-NHNH-(SEQ ID NO:)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键被结合至所述聚糖。在一些实施方案中，所述酰肼-羰基键位于结合单元上的末端酰肼基团和聚糖上的羰基基团之间。在一个实施方案中，所述聚糖是肝素。在一些实施方案中，所述肝素不含有氧化裂解的糖环，因此不含醛官能团。
已经发现的是，向胶原结合单元GQLYKSILY的C-末端加入氨基酸与结合亲和力的增加正相关(图17)。可以预期的是，增加聚糖和结合位点之间的距离可以减少结合的复合物的区域之间的空间位阻。一旦间隔物达到减少结合的复合物的区域之间的空间排斥的足够的长度，则对进一步增加间隔物可存在递减效果。将间隔物长度增加到超过此阈值甚至可能会降低亲和力。
如图15所示，在间隔物序列中的精氨酸残基的位置也影响结合亲和力。将第一个精氨酸定位在更靠近聚糖骨架的位置使结合亲和力增加。这可能是由于正电荷将结合位点从带负电荷的骨架中屏蔽了。
在一些实施方式中，胶原结合单元包含序列GQLYKSILY(SEQ ID NO:)，其中一个氨基酸由合成或天然存在的D-或L-氨基酸残基取代。在一些实施方式中，胶原结合单元包含序列XQLYKSILY(SEQ ID NO:)、GXLYKSILY(SEQ ID NO:)、GQXYKSILY(SEQ ID NO:)、GQLXKSILY、GQLYXSILY、GQLYKXILY(SEQ ID NO:)、GQLYKSXLY(SEQ ID NO:)、GQLYKSIXY(SEQID NO:)、或GQLYKSILX(SEQ ID NO:)，其中X可以是任何氨基酸残基(D或L)。这些序列中的每一个都可以紧跟着本文所列出的任何实施方式的间隔物。在一些实施方式中，X是L-丙氨酸。在一些实施方式中，间隔物是GSGSGSRR(SEQ ID NO:)。
在一些实施方式中，结合单元和间隔物包含序列LKAGQLYKSILYHHLHSGSGSGSRR(SEQ IN NO:)、KAGQLYKSILYHHLHSYGSGSGSRR(SEQ IN NO:)、GQLYKSILYHHLHSYQNSKPGSGSGSRR(SEQ IN NO:)。
在一些实施方式中，结合单元和间隔物包含序列GQLYKSILYGQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ IN NO:)、GQLYKSILYGSGQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ IN NO:)、GQLYKSILY-Ahx-GQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ IN NO:)、或(GQLYKSILY)2KGSGSGSRR(SEQ IN NO:)。
2.生物缀合物的合成
本文使用的肽可以从商业来源购买或者使用本领域公知的方法(例如化学和/或生物技术方法)部分或完全合成。在一些实施方案中，根据本领域公知的固相肽合成方案合成肽。在另一个实施方案中，根据熟知的Fmoc方案在固体支持物上合成肽，按照本领域技术人员已知的方法，用三氟乙酸从支持物上切下并通过色谱法纯化。在其他实施方案中，利用本领域技术人员熟知的生物技术方法合成肽。在一个实施方案中，通过本领域技术人员已知的重组DNA技术，将编码所需肽的氨基酸序列信息的DNA序列连接进表达质粒(例如结合用于肽的亲和纯化的亲和标签的质粒)，将质粒转染进宿主生物体中进行表达，然后从宿主生物体或生长培养基中分离肽，例如通过亲和纯化。重组DNA技术方法被描述于Sambrooket al.,“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”,3rd Edition,Cold Spring HarborLaboratory Press,(2001)(其通过引用合并入本文中)，并且对于本领域技术人员来说是熟知的。
如方案1所示，本文所述的肽可以通过羧酸部分共价结合至聚糖(例如肝素)1A以提供如本文所公开的生物缀合物1B。如在肽偶联反应中通常那样，可以使用活化剂来促进反应。合适的偶联剂(或活化剂)是本领域已知的，包括例如碳化二亚胺(例如N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N,N'-二环戊基碳化二亚胺、N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)、N-叔丁基-N-甲基碳化二亚胺(BMC)、N-叔丁基-N-乙基碳化二亚胺(BEC)、1,3-双(2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-基甲基)碳化二亚胺(BDDC)等)、酸酐(例如对称的、混合的、或环状的酸酐)、活性酯(例如苯基活化的酯衍生物、对异羟肟酸活化酯、六氟丙酮(HFA)等)、酰基唑(使用CDI的酰基咪唑、酰基苯并***等)、酰基叠氮化物、酰基卤化物、磷盐(HOBt、PyBOP、HOAt等)、铵盐/脲盐(例如四甲基铵盐、双吡咯烷基铵盐、双哌啶铵盐、咪唑脲盐、嘧啶脲盐、衍生自N,N,N’-三甲基-N’-苯基脲的脲盐、基于吗啉代的铵/脲偶联剂、锑酸盐脲盐等)、有机磷试剂(例如膦酸和磷酸衍生物)、有机硫试剂(例如磺酸衍生物)、三嗪偶联剂(例如2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓四氟硼酸盐等)、吡啶鎓偶联剂(例如Mukaiyama试剂、四氟硼酸吡啶鎓偶联剂等)、聚合物支撑的试剂(例如聚合物结合的碳化二亚胺、聚合物结合的TBTU、聚合物结合的2,4,6-三氯-1,3,5-三嗪、聚合物结合的HOBt、聚合物结合的HOSu、聚合物结合的IIDQ、聚合物结合的EEDQ等)，等等(参见例如El-Faham,et al.Chem.Rev.,2011,111(11):6557–6602；Han,et al.Tetrahedron,2004,60:2447-2467)。
在一个实施方案中，肽偶联反应通过活化的聚糖中间体进行，其通过将聚糖的羧酸部分与偶联剂(例如碳化二亚胺试剂，例如但不限于N,N'-二环己基碳化二亚胺(DCC)、N,N'-二异丙基碳化二亚胺(DIC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)等)反应，以形成O-酰基异脲中间体。这种碳化二亚胺化学在本领域中是公知的，并且合适的偶联剂可以从商业来源购买。将O-酰基异脲中间体与所需的肽接触产生生物缀合物。在肽之前或存在肽的情况下，可以将聚糖与活化剂接触。在一些实施方案中，在N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)或其衍生物的存在下进行反应。在一些实施方案中，肽序列可以被修饰来包含反应性部分(例如酰肼官能团)以帮助与聚糖或其O-酰基异脲中间体进行偶联反应。另外，在肽中的一个或多个氨基酸含有反应性官能团(例如羧酸侧链)的某些情况下，可以使用标准的保护基团化学来保护一个或多个侧链以促进偶联反应。另外，也可以单独使用非氨基酸间隔物、或与氨基酸间隔物(例如氨基己酸)组合使用。
方案1.生物缀合物的合成
在一些实施方案中，生物缀合物衍生自修饰的聚糖衍生物(例如肝素)(方案2)。适用于本文所述生物缀合物的各种聚糖衍生物是本领域已知的，例如部分N-脱硫酸肝素和部分O-脱硫酸肝素(即2-O和/或6-O-脱硫酸肝素，参见例如Kariya et al.,J.Biol.Chem.,2000,275:25949-5958；Lapierre,et al.Glycobiology,1996,6(3):355-366)。在以下方案2中示出了示例性的方法。如方案2中所示，聚糖(例如肝素)1A可以与合适的脱硫剂反应，以提供一个或多个脱硫聚糖衍生物2A，所述脱硫剂例如是碱(例如NaOH)或甲硅烷基化剂(例如N,O-双(三甲基甲硅烷基)乙酰胺(BTSA)、N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(MTSTFA)等)。如本领域技术人员显而易见的，可以根据所使用的试剂和反应条件，调整聚糖衍生物2A，使得可以获得脱硫的聚糖衍生物2A的部分、完全或混合物。然后，在典型的肽偶联反应条件下，如上文方案1所述，任选地在偶联剂的存在下，使脱硫酸化的聚糖衍生物2A与肽反应，以提供生物缀合物2B。另外，如方案2所示，可以将具有至少一个羟基基团的聚糖衍生物(例如6-O-脱硫酸化肝素)转化成O-羧甲基化聚糖衍生物(例如6-O-羧甲基化肝素)2C(参见例如Prestwich等在US 2012/0142907和US 2010/0330143中)。在典型的肽偶联反应条件下，任选地如上文针对方案1所述在偶联剂的存在下，2C与肽的反应，可以提供生物缀合物2D和/或2E。
方案2.替代的生物缀合物的合成
在某些实施方案中，可以根据方案3制备生物缀合物。如方案3中所示，使用高碘酸盐试剂(例如高碘酸钠)将聚糖(例如硫酸软骨素“CS”)氧化，以在聚糖上提供醛官能团(例如“ox-CS”)以将肽共价键合至聚糖。然后通过使氧化聚糖的醛官能团(例如“ox-CS”)与N-[β-马来酰亚胺丙酸]酰肼(BMPH)反应，以形成聚糖中间体(例如“BMPH-CS”)，并使聚糖中间体与含有至少一个游离巯基(即-SH基团)的肽进一步反应以产生合成的肽聚糖，使肽共价结合至聚糖(例如硫酸软骨素“CS”)。
方案3.CS-BMPH-肽n的合成
3.使用方法
3.1移植失败
本公开的一个实例提供了用于改善手术性搭桥手术的成功率和/或减少失败的方法和相关的组合物。搭桥移植物被用作冠状动脉疾病(CAD)和外周动脉疾病(PAD)中的动脉阻塞的一种治疗形式。如本文所用，术语“治疗”是指预防、治愈、逆转、减弱、减轻、最小化、抑制、压制和/或中止疾病或病症的一种或多种临床症状。在美国每年大约进行500,000例冠状动脉搭桥移植术(CABG)和超过70,000例外周搭桥移植术。最常见的是，通常从隐静脉收获自体血管移植物。
尽管使盛行使用自体静脉移植物进行手术性搭桥来恢复血流，但在CAD和PAD中都有大量的静脉移植失败(VGF)。仅在外周，5年内静脉移植失败率就达到50％的失败率。由于技术因素和急性血栓形成，5％至10％的静脉移植物在植入后不久即失败，另外20％至30％的病例可能出现中期失败(3至24个月)，并可能导致昂贵的监测、再次介入程序和截肢。在布里格姆妇女医院的二十年经验中，CLI患者(n＝1219)的12个月的静脉移植失败发生率为29％。静脉移植失败的后果通常对患者来说是严重的，包括复发性缺血症状、使手术衰弱和肢体丧失。迄今为止，药物治疗和技术创新对减少静脉移植失败的影响甚微。
预期的是，无论是由静脉移植物采集、保存介质、制备搭桥的过度操作还是由局部缺血和再灌注损伤引起的静脉移植导管的脆性内皮层的损伤，都导致植入之后在血管壁之内的血小板介导的炎症反应。这种内皮损伤和ECM-血小板活化级联可以通过急性炎症和血栓形成早期的VGF，或通过新生内膜增生形成延迟的VGF。因此，限制静脉移植物内皮下基质在植入后暴露至循环的血小板，可以帮助减少急性血管壁炎症，改善再上皮化并限制可能导致血管闭塞和VGF的过度新生内膜增生。如本文所述的生物缀合物可以被用作具有自体静脉移植物的手术搭桥的患有心血管疾病的患者的静脉移植物保存液。如本文所述的生物缀合物和包含其的组合物可以被用来在有需要的患者中治疗和/或预防的冠状动脉疾病和/或外周动脉疾病。
因此，根据本公开的一个实例，提供了一种制备血管移植物(例如静脉移植物)的方法，该方法将血管的区段的内壁与含有本发明的合成的生物缀合物的溶液相接触。实现所述接触的一种方法是将该区段浸泡在所述溶液中。这种接触的条件可以变化，但是可以根据合成的生物缀合物的浓度和血管的特性，容易地确定所述条件，使得合适的量的合成生物缀合物结合到内壁。用这种方法制备的血管移植物也在本公开的范围内。
一旦制备了移植物，就可以将其植入至有此需要的患者。可以容易地由医疗专业人员进行外科搭桥手术。一旦植入，则结合至移植物内壁的合成的生物缀合物可以帮助减少急性血管壁炎症，改善移植物的再上皮化并限制移植物的过度新生内膜增生，从而减少移植失败。
在一个实施方案中，当已经如上所述使用合成的生物缀合物处理移植物时，在搭桥手术过程期间或之后，可以将合成生物缀合物的溶液注射进移植物的内腔中，使得合成的生物缀合物将会结合移植物的内壁。在一个方面，在血流恢复或开始通过移植物之前完成注射。在另一个方面，在血流恢复或开始之后不久(例如在10分钟内、在5分钟内、或在1分钟内)完成注射。
在一些实施方案中，所述方法有效地抑制血管的负向重塑。冠状动脉疾病，也被称为缺血性或冠状性心脏病，发生在冠状动脉(向心肌提供血液的动脉)之内的一部分光滑的弹性衬里发生动脉粥样硬化时，有效地限制血液流向心脏。外周动脉疾病，也被称为动脉粥样硬化或动脉硬化，是在循环系统的动脉中发生的一种疾病。负性重塑包括血管对刺激的生理或病理反应，导致血管直径和管腔直径的减小。这种刺激可以通过例如血流改变或血管成形术过程来提供。在一些实施方案中，本文所述的生物缀合物和包含其的组合物的注射，与没有注射的血管的直径相比，导致血管直径增加约10％、20％、30％、40％、60％、70％、80％、95％、或以上的任一种。可以例如通过血管造影将负性重塑量化为在病变部位(或疾病部位)的直径狭窄百分比。确定重塑程度的另一种方法涉及使用血管内超声(IVUS)测量病变内外部弹性薄层区域。IVUS是一种可以对外部弹性薄层以及血管腔进行成像的技术。在一些实施方案中，负向重构与血管介入手术相关，例如血管成形术、支架术或经皮腔内斑块旋切术。因此，可以在血管介入手术之前、期间和/或之后注射如本文所述的生物缀合物和包含其的组合物。在一些实施方案中，提供了一种在有需要的患者中治疗股腘动脉之内的狭窄、或闭塞的方法，所述方法包括在球囊血管成形术之前、期间和/或之后将溶液施加至腔的内壁，其中所述溶液包含有效量的如本文所述的生物缀合物或包含其的组合物。
因此，本发明提供了一种在有需要的个体中抑制血管(例如动脉)中的负性重塑的方法，所述方法包括将有效量的本文所述的生物缀合物或包含其的组合物注射进血管壁或血管壁周围的组织中。在一些实施方案中，所述生物缀合物或组合物被注射在潜在的或实际的负性重塑部位处或其附近(例如离该部位不超过约2、1或0.5cm)。在一些实施方案中，将纳米颗粒组合物远离潜在的或实际的负性重塑部位注射(例如离该部位至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10cm中的任何一个)。在一些实施方案中，所述注射是通过带有针头的导管。在一些实施方案中，所述部位是冠状动脉或外周动脉。在一些实施方案中，所述动脉选自由肾动脉、脑动脉、肺动脉和腿部动脉。在一些实施方案中，所述动脉是球囊受伤的动脉。进一步的实例包括但不限于腹主动脉、胫前动脉、主动脉弓、弓形动脉、腋动脉、肱动脉、颈动脉、腹腔动脉、旋腓动脉、肝总动脉、髂总动脉、深股动脉(deep femoral artery)、掌深动脉弓、指背动脉、跖背动脉、颈外动脉、髂外动脉、面动脉、股动脉、肠系膜下动脉、髂内动脉、肠动脉、膝下外侧动脉、膝上外侧动脉、掌指动脉、腓动脉、腘动脉、胫后动脉、股深动脉(profunda femoris artery)、肺动脉、桡动脉、肾动脉、脾动脉、锁骨下动脉、掌浅动脉弓、肠系膜上动脉、尺侧上副动脉、和/或尺动脉。在一些实施方案中，所述动脉是冠脉血管的一部分。
在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含肝素和约5至约10、或约5个肽，其中所述肽包含GQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ ID NO:)的至少一个序列。在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含肝素和约5至约10、或约5个肽，其中所述肽包含GQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ ID NO:)的至少一个序列，并且通过酰肼-羰基键结合至所述肝素。
3.2纤维化
在一个实施方案中，本文提供了用于预防和/或治疗纤维化的生物缀合物和方法。纤维化是一种炎症性疾病，其中炎症细胞迁移到组织和器官中，导致会导致瘢痕形成的细胞反应。纤维化通常可以由于发炎或损伤而发生在体内的许多组织中。通过防止炎性细胞外渗，可以减轻或预防纤维化。
在一个实施方案中，本文提供的生物缀合物和方法可以用来预防和/或治疗肺纤维化。在肺中，纤维化的类型包括肺纤维化，例如囊性纤维化和特发性肺纤维化。肺纤维化是一种呼吸系统疾病，其中在肺组织中形成疤痕，导致严重的呼吸问题。疤痕的形成导致壁的增厚，并导致血液中氧气供应的减少。结果，患者患有永久性的呼吸急促。
在一个实施方案中，本文提供的生物缀合物和方法可以用来治疗肝纤维化。肝纤维化可能由多种情况引起，包括慢性酒精暴露、乙型肝炎病毒(HBV)感染、非酒精性脂肪肝疾病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、丙型肝炎病毒(HCV)感染、威尔逊氏(Wilson's)病、α-1-抗胰蛋白酶缺乏症、血色素沉着症、原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、以及自身免疫性肝炎。慢性HCV是导致慢性肝病的主要因素，肝脏引起持续的炎症和纤维化，其特征是肝上纤维组织和瘢痕的形成。NAFLD和NASH也可以引起肝脏炎症和纤维化。
肝硬化是肝脏中的纤维化，其中肝由于长期损害而无法正常运行。通常，这种疾病会在数月或数年内缓慢发作。早期，通常没有任何症状。随着疾病的恶化，人可能会变得疲倦、虚弱、发痒、小腿肿胀、皮肤发黄、容易瘀伤、腹部积水、或在皮肤上形成蜘蛛状血管。腹部积聚的液体可能会自发感染。其他并发症包括肝性脑病、食道扩张静脉或胃静脉扩张出血、以及肝癌。肝性脑病会导致混乱，甚至可能导致意识丧失。肝硬化可以导致肝功能障碍。以下症状或特征是肝功能障碍的直接后果，因此也可以通过本公开的组合物和方法治疗或改善。
已经表明，肝星状细胞(HSC)和肿瘤细胞之间的直接相互作用通过多种机制促进了肿瘤的生长。因此，靶向HSC以减轻或消除其肿瘤支持作用提出了预防、抑制或治疗肝细胞癌(HCC)的潜在治疗策略。在某些实施方案中，提供了在有需要的患者中预防或抑制肝细胞癌(HCC)的发展的方法，其包括向患者施用有效量的本文所述的生物缀合物。在某些实施方案中，肝细胞癌(HCC)的发展是肝硬化的结果。在某些实施方案中，该方法包括抑制肝星状细胞增殖和/或纤维化表型转变。在某些实施方案中，例如在经导管动脉化学栓塞(TACE)过程中，将生物缀合物局部施用至肝脏。
蜘蛛状血管瘤或蜘蛛痣是由被许多较小血管围绕的中央小动脉组成的血管病变，由于***的增加而发生。掌部红斑是在大鱼际和小鱼际***处的手掌发红，也是由于***增加。男性***发育不全症或男性无癌的***腺体增大是由***增加引起的，可以在多达三分之二的患者中发生。性腺功能减退(表现为阳痿的性激素减少)、***、***减退和睾丸萎缩，可能是原发性腺损伤或下丘脑/垂体功能受压所致。性腺功能减退症与酒精中毒和血色素沉着症引起的肝硬化有关。肝硬化患者的肝脏大小可能会增大、正常或缩小。
在一个实施方案中，本文提供的生物缀合物和方法可以用来预防和/或治疗肾纤维化。肾纤维化可以由对肾脏的急性或持续伤害引起。损伤可能导致细胞外基质过度沉积。随着时间的流逝，这可能导致肾脏衰竭，需要患者进行透析或肾脏移植。
腹水是腹膜腔内积液，会引起腹侧钝感。这随着腹围的增加而可见。肝病性口臭是由于二甲基硫醚含量增加而产生的霉味。黄疸是由于胆红素增加而引起的皮肤和粘膜的黄变。此外，肝硬化会增加对血流的抵抗力和门静脉系统的高压，从而导致门脉高压。
在一个实施方案中，本文提供的生物缀合物和方法可以用来预防和/或治疗心脏中的纤维化。心脏中的纤维化以心房纤维化、心肌内膜纤维化、或心肌梗塞的形式存在。胶质瘢痕是脑中的纤维化。其他类型的纤维化包括但不限于关节纤维化(膝盖、肩膀、其他关节)、克罗恩氏(Crohn's)病(肠)、杜普伊特伦(Dupuytren's)挛缩(手、手指)、瘢痕疙瘩(皮肤)、纵隔纤维化(纵隔的软组织)、骨髓纤维化(骨髓)、佩罗尼氏(Peyronie's)病(***)、肾源性全身纤维化(皮肤)、进行性大块纤维化(肺)、腹膜后纤维化(腹膜后的软组织)、硬皮/全身性硬化症(皮肤、肺)、以及某些形式的粘连性囊炎(肩)。
预期本发明的组合物和方法适用于预防和/或治疗任何这些疾病或与这些疾病有关的症状或特征。纤维化的发展涉及受刺激的细胞铺设***，包括胶原蛋白和糖胺聚糖。本公开的生物缀合物可以与胶原蛋白或糖胺聚糖相互作用，并因此破坏这种过量的***的形成。生物缀合物还可以保护内皮屏障。这可以是与由于微血管损伤而暴露的细胞外基质相互作用。保护内皮屏障会防止炎症细胞渗入组织从而引起过多的ECM沉积，其导致纤维化组织。因此，生物缀合物可以预防、抑制、延迟和/或逆转纤维化。
在某些实施方案中，纤维化是缺血后、感染后或特发性的(例如肾、肝、心脏、肺)。参见，例如Guerrot,D.,et al.Fibrogenesis&tissue repair 5.Suppl 1(2012):S15和Yamaguchi,I.,et al.Nephron Experimental Nephrology 120.1(2012):e20-e31。在某些实施方案中，纤维化是腹膜后的。在某些实施方案中，纤维化是皮肤的(例如硬皮病)。参见，例如Maurer,B.,et al.Annals of the rheumatic diseases(2013):annrheumdis-2013。
在一个实施方案中，所述疾病不是急性肾小管坏死、糖尿病慢性肾衰竭、狼疮性肾炎、肾纤维化、或急性肾小球肾炎。在一个实施方案中，所述疾病不是特发性肺纤维化(IPF)、慢性阻塞性肺疾病、哮喘、或肺气肿。
在某些实施方案中，纤维化是由溶酶体贮积病引起的、或与溶酶体贮积病有关，其包括但不限于法布里(Fabry)病、高雪氏(Gaucher)病、尼曼-皮克(Niemann–Pick)病和亨特(Hunter)综合症(粘多糖病)。因此，在某些实施方案中，本文提供了在有需要的患者中预防由溶酶体贮积病引起或与之相关的纤维化的方法。
在一个实施方案中，本文提供了本文公开的生物缀合物用于预防或治疗纤维化的用途。在一个实施方案中，本文提供了本文公开的生物缀合物用于制备用于预防或治疗纤维化的药物的用途。在一个实施方案中，本文提供了本文公开的生物缀合物用于预防或治疗肝纤维化的用途。在一个实施方案中，本文提供了本文公开的生物缀合物用于预防或治疗肺纤维化的用途。在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含肝素和约5至约10、或约5个肽，其中所述肽包含GQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ ID NO:)的至少一个序列、或具有来自其每一个的一个、两个或三个氨基添加、缺失和/或取代的氨基酸序列。在一个实施方案中，上述方法中使用的生物缀合物包含肝素和约5至约10、或约5个肽，其中所述肽包含GQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ ID NO:)的至少一个序列。在一个实施方案中，所述肽通过酰肼-羰基键结合至肝素或其他聚糖。
在一个实施方案中，本文提供了一种用于在有需要的患者中预防或治疗肝纤维化或肺纤维化的方法，其包括向所述患者施用有效量的生物缀合物，所述生物缀合物包含肝素和约5至约10、或约5个肽，其中所述肽包含GQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ ID NO:)的至少一个序列。在一个实施方案中，本文提供了本文公开的生物缀合物在有需要的患者中预防或治疗肝纤维化或肺纤维化的用途。在一个实施方案中，施用有效量的生物缀合物。
本文还提供了预防和/或治疗血管炎的方法。血管炎是由血管壁的炎症所定义，并形成了各种疾病实体的不同群体的病理基础。血管炎是在自身免疫性疾病中通常观察到的难治的病理状况之一，并且其许多起因对于诸如类固醇和免疫抑制剂的常规使用的治疗方法是难治的。在血管炎综合征中，炎症发生在各种大小的动脉中，并且发烧、肌肉和关节疼痛、血管阻塞、皮肤溃疡和多发性单神经炎可能发展。该方法可用于治疗大血管血管炎(LVV)、中血管血管炎(MVV)、小血管血管炎(SVV)、可变血管血管炎(VVV)、单器官血管炎(SOV)、与全身性疾病相关的血管炎、和/或与可能的病因相关的血管炎。大血管血管炎(LVV)的非限制性实例包括高隆动脉炎(TAK)和巨细胞动脉炎(GCA)。中血管血管炎(MVV)的非限制性实例包括结节性多动脉炎(PAN)和川崎(kawasaki)病(KD)。小血管血管炎(SVV)的非限制性实例包括抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关血管炎(AAV)、显微镜下多血管炎(MPA)、肉芽肿伴多血管炎(Wegener's)(GPA)、嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(Churg-Strauss)(EGPA)、免疫复合物SVV、抗肾小球基底膜(抗GBM)疾病、灰球性脉管炎(CV)、IgA血管炎(Henoch-
在一个实施方案中，本文提供了预防和/或治疗血管血管炎的方法。在一个实施方案中，本文提供了预防和/或治疗小血管血管炎的方法，包括抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关血管炎(AAV)、显微镜下多血管炎(MPA)、肉芽肿伴多血管炎(Wegener's)(GPA)、嗜酸性肉芽肿伴多血管炎(Churg-Strauss)(EGPA)、免疫复合物SVV、抗肾小球基底膜(抗GBM)疾病、灰球性脉管炎(CV)、IgA血管炎(Henoch-
联合疗法
在一些实施方案中，本公开的组合物可以与可用于预防或治疗纤维化的第二药剂组合使用。因此，在一个实施方案中，提供了一种组合、组合物、套装或试剂盒，其包括本公开内容的任何组合物和一种或多种这种第二药剂。在一个实施方案中，本公开的任何治疗方法进一步包括施用一种或多种这种第二药剂。
第二药剂可以是可用于预防、治疗或以其他方式改善纤维化的症状的任何药物或生物药剂。非限制性实例包括：类固醇，例如predonine；还原剂，例如N-乙酰半胱氨酸；抗纤维化药物，例如吡非尼酮和尼达尼布；免疫抑制药物，例如皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、青霉素、环孢霉素A和FK506；以及其他药剂，例如秋水仙碱、IFN-γ和霉酚酸酯。
在一些实施方案中，本公开的组合物可以与可用于预防或治疗血管炎的第二药剂组合使用。因此，在一个实施方案中，提供了一种组合、组合物、套装或试剂盒，其包括本公开内容的任何组合物和一种或多种这种第二药剂。在一个实施方案中，本公开的任何治疗方法进一步包括施用一种或多种这种第二药剂。
第二药剂可以是可用于预防、治疗或以其他方式改善血管炎的症状的任何药物或生物药剂。非限制性实例包括***、环磷酰胺(Cytoxan)、甲基***龙、甲氨蝶呤钠、Medrol(Pak)、Medrol、***、***龙、DexPak、Deltasone、可的松、***增强剂(Prednisone Intensol)、***磷酸钠、Orapred ODT、Trexall、Rheumatrex、甲氨蝶呤钠(PF)、Veripred 20、***增强剂、***龙磷酸钠、Pediapred、Milliped、Rayos、Milliped和DoubleDex。
4.组合物
在一个实施方案中，该生物缀合物以组合物形式施用。本公开提供了包含生物缀合物和药学上可接受的载体的组合物。药学上可接受的载体是本领域普通技术人员已知的，包括水或盐水。如本领域已知的，组分以及它们的相对量由预期用途和递送方法确定。可以选择组合物中使用的稀释剂或载体，使得它们不降低生物缀合物的期望效果。合适的组合物的实例包括水溶液，例如在等渗盐水、5％葡萄糖中的溶液。也可以使用其他熟知的药学上可接受的液体载体，例如醇、乙二醇、酯和酰胺。在某些实施方案中，组合物还包含一种或多种赋形剂，例如但不限于离子强度调节剂、溶解度增强剂、糖(如甘露糖醇或山梨醇)、pH缓冲剂、表面活性剂、稳定聚合物、防腐剂和/或共溶剂。
在某些实施方案中，该组合物是水溶液。因为配制的容易性，以及能够通过滴注溶液来容易地施用这些组合物，所以水性溶液适合用于组合物制剂。在某些实施方案中，该组合物是混悬液、粘稠或半粘稠凝胶、或其他类型的固体或半固体组合物。在一些实施方案中，该组合物为本领域中众所周知的泡沫、软膏、液体洗涤剂、凝胶剂、喷雾剂和脂质体的形式。或者，局部施用是通过选自泵-导管系统、连续或选择性释放装置或粘附屏障(adhesionbarrier)的装置将所提供的生物缀合物输注至治疗部位。在某些实施方案中，该组合物是直接施用于或接触静脉或动脉的内壁的溶液。在一些实施方案中，该组合物包含聚合物基质。在其他实施方案中，该组合物是可吸收的。在某些实施方案中，该组合物包含pH缓冲剂。在一些实施方案中，该组合物含有润滑性增强剂。
在某些实施方案中，聚合物基质或聚合物材料被用作该组合物的药学上可接受的载体。本文所述的聚合物材料可包含天然或非天然聚合物，例如糖、肽、蛋白质、层粘连蛋白、胶原蛋白、透明质酸、离子和非离子水溶性聚合物；丙烯酸聚合物；亲水性聚合物，如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素；聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物，或天然和合成的其它聚合试剂。在某些实施方案中，本文提供的组合物被配制成膜、凝胶、泡沫或其它剂型。
合适的离子强度调节剂包括，例如，甘油、丙二醇、甘露醇、葡萄糖、右旋糖、山梨糖醇、氯化钠、氯化钾和其它电解质。
在某些实施方案中，该生物缀合物的溶解度可能需要增强。在这种情况下，通过使用合适的制剂技术可以提高溶解度，例如掺入增溶剂成分，如甘露醇、乙醇、甘油、聚乙二醇、丙二醇、泊洛沙姆和本领域已知的其它物质。
在某些实施方案中，该组合物含有润滑性增强剂。如本文所用的，润滑性增强剂是指能够改变药学上可接受的载体的粘度的一种或多种药学上可接受的聚合物材料。合适的聚合物材料包括但不限于：离子型和非离子型水溶性聚合物；透明质酸及其盐、硫酸软骨素及其盐、葡聚糖、明胶、壳聚糖、胶凝糖(gellans)、其他生物缀合物或多糖或其任何组合；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物，如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素；胶原蛋白和改性胶原蛋白；半乳甘露聚糖，例如瓜尔豆胶、刺槐豆胶和他拉胶，以及衍生自上述天然树胶的多糖以及含有甘露糖和/或半乳糖部分作为主要结构组分的类似天然或合成树胶(例如羟丙基瓜尔胶)；胶，如黄蓍胶和黄原胶；结冷胶；海藻酸和海藻酸钠；壳聚糖；乙烯聚合物；亲水性聚合物，如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇；羧基乙烯基聚合物或交联的丙烯酸聚合物，例如“卡波姆”家族聚合物(如能够以CarbopolTM商标商购获得的羧基聚亚烷基)；和各种其他粘性或粘弹性物质。在一个实施方案中，润滑性增强剂选自透明质酸、皮肤素、软骨素、肝素、乙酰肝素、角蛋白、葡聚糖、壳聚糖、藻酸盐、琼脂糖、明胶、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、卡波姆941、卡波姆940、卡波姆971P、卡波姆974P、或其药学上可接受的盐。在一个实施方案中，润滑性增强剂与生物缀合物同时施用。或者，在一个实施方案中，将润滑性增强剂与生物缀合物按顺序施用。在一个实施方案中，润滑性增强剂是硫酸软骨素。在一个实施方案中，润滑增强剂是透明质酸。该润滑性增强剂可以改变组合物的粘度。
关于上述润滑性增强剂的结构、化学性质和物理性质的进一步细节参见例如US5,409,904、US 4,861,760(结冷胶)、US 4,255,415、US 4,271,143(羧基乙烯基聚合物)、WO94/10976(聚乙烯醇)、WO 99/51273(黄原胶)和WO 99/06023(半乳甘露聚糖)。提出使用非酸性润滑性增强剂，如中性或碱性试剂，以有助于实现制剂的所需pH。
在一些实施方案中，生物缀合物可与以下物质组合：矿物质、氨基酸、糖、肽、蛋白质、维生素(诸如抗坏血酸)或层粘连蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白、透明质酸、纤维蛋白、弹性蛋白或聚集蛋白聚糖或生长因子(如表皮生长因子、血小板衍生的生长因子、转化生长因子β或成纤维细胞生长因子)、以及糖皮质激素(如***)或粘弹性改变剂(如离子型和非离子型水溶性聚合物；丙烯酸聚合物；亲水性聚合物(如聚环氧乙烷、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物和聚乙烯醇)；纤维素聚合物和纤维素聚合物衍生物(如羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素和醚化纤维素)；聚(乳酸)、聚(乙醇酸)、乳酸和乙醇酸的共聚物、或天然和合成的其它聚合物)。
合用于本发明组合物的pH缓冲剂包括例如乙酸盐、硼酸盐、碳酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐缓冲剂，以及盐酸、氢氧化钠、氧化镁、磷酸二氢钾、碳酸氢盐、氨、碳酸、盐酸、柠檬酸钠、柠檬酸、乙酸、磷酸氢二钠、硼砂、硼酸、氢氧化钠、二乙基巴比妥酸和蛋白质以及各种生物缓冲液，例如TAPS、Bicine、Tris、Tricine、HEPES、TES、MOPS、PIPES、二甲胂酸盐或MES。在某些实施方案中，将合适的缓冲体系(例如磷酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸)加入组合物中以防止储存条件下的pH漂移。在一些实施方案中，缓冲液是磷酸盐缓冲盐水(PBS)溶液(即，含有磷酸钠、氯化钠，以及在一些制剂中含有氯化钾和磷酸钾)。具体浓度将根据使用的试剂而变化。在某些实施方案中，加入pH缓冲体系(例如磷酸钠、乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或硼酸)以将pH保持在约pH 4至约pH 8、或约pH 5至约pH8、或约pH 6至约pH 8、或约pH 7至约pH 8。在一些实施方案中，选择缓冲剂以将pH保持在约pH 4至约pH 8的范围内。在一些实施方案中，pH从约pH 5到约pH 8。在一些实施方案中，缓冲液是盐水缓冲液。在某些实施方案中，所述pH为约pH 4至约pH 8、或约pH 3至约pH 8、或约pH 4至约pH 7。在一些实施方案中，所述组合物为膜、凝胶、贴剂或液体溶液形式，其包含聚合物基质、pH缓冲剂、润滑性增强剂和生物缀合物，其中所述组合物任选地含有防腐剂；并且其中所述组合物的pH在约pH 4至约pH 8的范围内。
在组合物中使用表面活性剂来递送更高浓度的生物缀合物。表面活性剂起到增溶抑制剂和稳定胶体分散体的作用，所述胶体分散体例如是胶束溶液、微乳液、乳液和混悬液。合适的表面活性剂包含聚山梨酸酯、泊洛沙姆、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧乙烯蓖麻油、泰洛沙泊、曲通和失水山梨糖醇单月桂酸酯。在一个实施方案中，表面活性剂的亲水/亲油/平衡值(HLB)在12.4至13.2范围内，并且可用于眼用(例如TritonX114和泰洛沙泊)。
在某些实施方案中，将稳定聚合物(即缓和剂)加入到组合物中。稳定聚合物应该是离子/带电的聚合物，更具体地说是在其表面上携带负电荷的聚合物，其可以表现出(-)10-50mV的ζ-电位以获得物理稳定性并且能够在水中形成分散体(即水溶性)。在一个实施方案中，稳定聚合物包含来自交联聚丙烯酸酯家族的聚电解质或多种聚电解质(如果多于一种的话)，例如卡波姆和
在一个实施方案中，该组合物包含增加生物缀合物对血管的细胞外基质的渗透性的试剂。优选地，该增加渗透性的试剂选自苯扎氯铵、皂苷、脂肪酸、聚氧乙烯脂肪醚、脂肪酸烷基酯、吡咯烷酮、聚乙烯吡咯烷酮、丙酮酸、焦谷氨酸或其混合物。
该生物缀合物可以被消毒以去除不需要的污染物，包括但不限于内毒素和传染物。可以使用不会不利地影响生物缀合物的结构和生物趋向性质(biotropic property)的灭菌技术。在某些实施方案中，可以使用常规灭菌技术来消毒和/或灭菌生物缀合物，包括环氧丙烷或环氧乙烷处理、无菌过滤、气体等离子体灭菌、γ辐射、电子束和/或过酸(如过乙酸)灭菌。在一个实施方案中，该生物缀合物可以经受一个或多个灭菌过程。或者，可以将生物缀合物包裹在包括塑料包装或箔包装的任何类型的容器中，并且可以进一步灭菌。
在一些实施方案中，将防腐剂加入到组合物中以防止使用期间的微生物污染。加入到组合物中的合适的防腐剂包括苯扎氯铵、苯甲酸、对羟基苯甲酸烷基酯、苯甲酸烷基酯、氯丁醇、氯甲酚、十六烷醇、脂肪醇(如十六烷醇)、汞的有机金属化合物(如乙酸盐、硝酸苯汞或硼酸苯汞)、双咪唑烷基脲、己二酸二异丙酯、二甲基聚硅氧烷、EDTA盐、维生素E及其混合物。在某些实施方案中，防腐剂选自苯扎氯铵、氯丁醇、二甲基十二烷基苄基溴化铵、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯乙醇、依地酸二钠、山梨酸或聚季铵盐-1。在某些实施方案中，该组合物包含防腐剂。在一些实施方案中，防腐剂的用量为约0.001％至约1.0％w/v。在某些实施方案中，该组合物不含防腐剂并被称为“无防腐剂的”。在一些实施方案中，单位剂量组合物是无菌的、但无防腐剂的。
在一些实施方案中，生物缀合物和其他药剂的单独或顺序施用是有利于递送组合物的。在某些实施方案中，生物缀合物和其它药剂可以以不同的给药频率或间隔给药。例如，生物缀合物可以每天给药，而其他药剂可以给药频率低些。另外，如本领域技术人员所显而易见的，可以使用相同的施用途径或不同的施用途径施用生物缀合物和其它药剂。
可以使用任何有效的施用生物缀合物的方案。例如，生物缀合物可以作为单一剂量施用或作为多剂量每日方案施用。此外，例如一至五天每周的交错疗法可以用作每日治疗的替代方案。
在各种实施方案中，生物缀合物可以局部施用，例如通过膜、凝胶、贴剂或液体溶液施用。在一些实施方案中，组合物以在缓冲的无菌水溶液形式提供。在某些实施方案中，溶液具有约1至约100厘泊(cps)、或约1至约200cps、或约1至约300cps、或约1至约400cps的粘度。在一些实施方案中，溶液具有约1至约100cps的粘度。在某些实施方案中，溶液具有约1至约200cps的粘度。在某些实施方案中，溶液具有约1至约300cps的粘度。在某些实施方案中，溶液具有约1至约400cps的粘度。在某些实施方案中，溶液呈可注射液体溶液的形式。在其它实施方案中，组合物被配制成粘性液体(即几百至几千cps的粘度)、凝胶或软膏。在这些实施方案中，生物缀合物分散或溶解在合适的药学上可接受的载体中。
与用于基于导管的递送的生物缀合物一起使用的示例性组合物可以包含：a)如本文所述的合成生物缀合物；b)药学上可接受的载体；c)聚合物基质；d)pH缓冲剂，以提供约pH 4至约pH 8范围内的pH；和e)浓度范围为总配方重量的约0.25％至约10％的水溶性润滑性增强剂，或任何单独的组分a)、b)、c)、d)或e)，或a)、b)、c)、d)或e)的任何组合。
示例性制剂可以包含：a)如本文所述的生物缀合物；b)药学上可接受的载体；c)聚合物基质；；和d)pH缓冲剂以提供约pH 4至约pH 8范围内的pH，其中所述溶液对于液体溶液具有约3至约30cps的粘度。
本公开所考虑的示例性组合物还可以用于通过注射施用，包括水性或油性混悬液或乳剂(其具有芝麻油、玉米油、棉籽油或花生油)，还包括酏剂(其具有甘露醇、右旋糖)或无菌水溶液以及类似的药物载体。盐水中的水溶液也常规用于注射，但是在本文中不太优选。也可以使用乙醇、甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等(及其合适的混合物)、环糊精衍生物和植物油。例如，通过使用诸如卵磷脂的包衣，通过在分散液的情况下维持所需的粒径和通过使用表面活性剂，来维持适当的流动性。可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来预防微生物的作用。
无菌可注射溶液通过如下方法制备：将所需量的组分加入具有上述各种其他成分(按需要)的适当溶剂中，然后过滤除菌。通常，通过将各种灭菌的活性成分加入含有基础分散介质和所需的上述其它成分的无菌载体中来制备分散液。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，其由先前无菌过滤的溶液产生活性成分加任何另外的所需成分的粉末。
在制备包含本文所述的生物缀合物的药物组合物时，活性成分通常通过赋形剂或载体稀释和/或包封在可为胶囊、小袋、纸或其他容器形式的载体内。当赋形剂用作稀释剂时，其可以是固体、半固体或液体材料(如上)，其充当活性成分的媒介物、载体或介质。因此，所述组合物可以是膜、凝胶、贴剂、散剂、锭剂、小药囊、扁囊剂、酏剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂、气雾剂(固体形式或在液体介质中)、包含例如高达10wt％的活性化合物的软膏剂、软明胶膜和硬明胶膜、凝胶、贴剂、无菌注射溶液和无菌包装粉末的形式。
合适赋形剂的一些实例包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、***胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆和甲基纤维素。所述制剂可另外包含：润滑剂，如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和悬浮剂；防腐剂，如羟基苯甲酸甲酯和羟基苯甲酸丙酯；甜味剂；和调味剂。
用于药物递送的膜在本领域中是公知的，并且包括无毒、无刺激性聚合物，不含可浸出的杂质，如多糖(例如纤维素、麦芽糖糊精等)。在一些实施方案中，聚合物是亲水性的。在其他实施方案中，聚合物是疏水性的。该膜粘附在其所施用的组织上，并且在约一周的时间内被缓慢地吸收到体内。本文所述的薄膜剂型中使用的聚合物是可吸收的，并且显示出如本领域中所公知的足够的剥离强度、剪切强度和拉伸强度。在一些实施方案中，膜是可注射的。在某些实施方案中，在手术介入之前、之中或之后将膜施用至患者。
这里使用的凝胶是指可以具有从软和弱到硬和韧的性质的固态胶状物质。如本领域所熟知的，凝胶是通过流体在其整个体积内膨胀的非流体胶体网络或聚合物网络。水凝胶是一种凝胶，其包含亲水性聚合物链网络，有时以胶体凝胶的形式存在，其中水是分散介质。水凝胶是高吸收性的并且可以含有大量的水，例如大于90％的水。在一些实施方案中，本文所述的凝胶包含天然或合成的聚合物网络。在一些实施方案中，凝胶包含亲水性聚合物基质。在其他实施方案中，凝胶包含疏水性聚合物基质。在一些实施方案中，凝胶具有与天然组织非常相似的柔韧程度。在某些实施方案中，凝胶是生物相容的和可吸收的。在某些实施方案中，在外科手术之前、之中或之后将凝胶施用至患者。
本文使用的液体溶液是指本领域公知的溶液剂、混悬剂、乳剂、滴剂、软膏剂、液体洗剂、喷雾剂、脂质体。在一些实施方案中，所述液体溶液含有水性pH缓冲剂，当添加少量酸或碱时所述水性pH缓冲剂抵抗pH的变化。在某些实施方案中，在手术介入之前、之中或之后将液体溶液施用至患者。
示例性制剂可以包含：a)如本文所述的一种或多种生物缀合物；b)药学上可接受的载体；和c)作为基质网络的亲水性聚合物，其中所述组合物配制成粘性液体(即几百至几千厘泊的粘度)、凝胶或软膏。在这些实施方案中，生物缀合物分散或溶解在合适的药学上可接受的载体中。
在某些实施方案中，生物缀合物或包含其的组合物在配制之前、期间或之后被冻干。因此，本文还提供了包含生物缀合物的冻干组合物或包含含有如本文所述生物缀合物的组合物的冻干组合物。
5.剂量
生物缀合物的合适剂量可以通过标准方法确定，例如通过在实验室动物模型或临床试验中建立剂量-反应曲线来确定，并且可以根据患者状况、被治疗的疾病状态、施用途径和组织分布以及共同使用其他治疗方法的可能性而显著变化。给予患者的有效量基于体表面积、患者体重或质量、以及医师对患者状况的评估。在各种示例性实施例中，剂量在约0.01μg至约10g的范围内。例如，对于全身性递送，剂量可以是约10g、或约5g、或约1g。在其它示例性实施方案中，有效剂量范围为每剂约100μg至约10g，或每剂约100μg至约1g，或每剂约100μg至约500mg，每剂约0.01μg至约100mg，或每剂约100μg至约50mg，或每剂约500μg至约10mg，或每剂约1mg至10mg，或每剂约1至约100mg，或每剂约1mg至500mg，或每剂约1mg至200mg，或每剂约10mg至100mg，或每剂约10mg至75mg，或每剂约10mg至50mg，或每剂约10mg，或每剂约20mg，或每剂约30mg，或每剂约40mg，或每剂约50mg，或每剂约60mg，或每剂约70mg，或每剂约80mg，或每剂约90mg，或每剂约100mg。在本文所述的各种实施方案的任一个中，有效剂量范围为每剂约0.01μg至约1000mg，每剂1μg至约100mg，约100μg至约1.0mg，约50μg至约600μg，约50μg至约700μg，约100μg至约200μg，约100μg至约600μg，约100μg至约500μg，约200μg至约600μg，或约100μg至约50mg，或每剂约500μg至约10mg，或每剂约1mg至约10mg。
在一些实施方案中，组合物以多剂量形式包装。因此需要防腐剂来防止使用过程中的微生物污染。在某些实施方案中，可以将如上所述的合适的防腐剂加入到组合物中。在一些实施方案中，组合物含有防腐剂。在某些实施方案中，防腐剂的用量为约0.001％至约1.0％w/v。在一些实施方案中，单位剂量组合物是无菌的、但无防腐剂的。
实施例
实施例1.生物缀合物的合成
可以根据以下方案制备生物缀合物。用适当浓度的离液剂(chaotropic agent)，例如丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲或尿素(例如约5M至约10M尿素)，制备合适的反应缓冲液(例如2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES))。用1N HCl将最终pH调节至pH约4.5至约6。
将酰肼官能化的肽(例如表2中的肽1-20)溶解于反应缓冲液中至3mg/mL。在偶联反应之前新鲜制备该肽溶液。将相应的生物素化肽溶解于反应缓冲液中至3mg/mL。在偶联反应之前，新鲜制备生成的生物素标记的肽溶液。将聚糖(例如肝素(MWavg＝16kDa))溶解于反应缓冲液中至20mg/mL，并储存在-20℃或在偶联反应之前新鲜制备。在将EDC(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)溶解于反应缓冲液中至75mg/mL，然后立即加入到聚糖。可替换地，可以仅使用未标记的肽合成生物缀合物，并且任选地使用生物素酰肼标记生物缀合物。
通过加入对于肝素50摩尔过量的1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)(59.3mg或0.79mL 75mg/mL的水溶液)来活化肝素。起始材料在室温下反应约5分钟。然后将生物素标记的肽以1：1摩尔比(肝素：被标记的肽)(15.3mg或5.1mL 3mg/mL的反应缓冲液溶液)加入至活化的肝素中。然后将反应混合物在室温下摇动约5分钟。当摇动时，将未标记的肽以给定的摩尔比(肝素：肽，详细信息参见表2)加入到反应缓冲液中。然后在摇动的同时使组分在室温下反应约2小时。在指定的时间之后，通过在室温下摇动的同时用0.5M NaOH(约4.5mL)将pH升至8约30分钟来淬灭反应。
然后以约15psi的TMP以35mL/min的流速先后使用5倍柱体积(CV)的反应缓冲液(约250mL)和10CV的水(约500mL)，通过渗滤器(Spectrum-MidiKros mPES 10K中空管过滤器)，将生成生物缀合物进行纯化。然后将作为最终产物的保留物在80℃冷冻。任选地，将终产物冻干至干燥。使用上述方法将约5个肽缀合至聚糖。
从如上所述的肝素和示于表(表2)中的酰肼官能化的肽制备以下生物缀合物。
表2
*Ahx＝6-氨基己酸
通过使肽以每个聚糖约1:8或约1:6个肽的比例进行反应来合成化合物1-17和20，并且可以预期的是缀合至聚糖的肽的平均数目为每聚糖约5个肽，对应于约22％的肽官能化。通过使每个聚糖约1:8或约1:9或约1:12个肽的比例进行反应来合成化合物18，并且可以预期的是缀合至聚糖的肽的平均数目为每肽约8个肽，对应于约33％的肽官能化。通过使肽以每个聚糖约1:4或约1:3个肽的比例进行反应来合成化合物19，并且可以预期的是缀合至聚糖的肽的平均数目为每聚糖约3个肽，对应于约11％的肽官能化。
实施例2.胶原结合平板试验
使用以下的方法来评估本文所公开的生物缀合物对于胶原的结合亲和力。
通过平板试验比较生物缀合物变体的胶原结合，其中胶原被包被在96孔板上。在室温下将胶原以50μg/mL 0.02N乙酸溶液包被在高结合平板上1h。未结合的胶原用pH 7.41X PBS冲洗。然后将平板在室温于1％牛奶的1X PBS溶液中封闭1小时。
将含有生物素化肽的生物缀合物变体溶于pH 7.4 1％牛奶的1X PBS溶液，终浓度为1mg/mL。从该溶液中，进行10X连续稀释。然后在被封闭的胶原包被平板上孵育分子，并在室温下孵育15分钟。然后将平板用含1％BSA和0.2％Tween20的1X PBS溶液冲洗3次。
通过链霉亲和素-HRP检测结合的分子，将其在含有1％BSA和0.2％Tween20的1XPBS中以1：500稀释，并在室温下以200μL/孔孵育20分钟。用含有0.2％Tween20的1X PBS将链霉亲和素溶液从平板上冲洗3次。然后在室温下将TMB底物溶液以100μL/孔加入到每个孔中，持续15分钟，然后用100μL硫酸溶液(0.16M)停止颜色的变化。然后在450nm处测量孔中的吸光度，并通过吸光度对浓度的剂量-反应描绘结合亲和力。
该方法用于通过比较EC50值来比较各种胶原结合的生物缀合物的胶原结合亲和力。更具体地，将每种生物缀合物的EC50值与化合物4的EC50进行比较。
图1示出了生物缀合物化合物4、化合物8和化合物13的胶原结合的比较。图1示出减少精氨酸的数量可增加EC50。
图2示出了生物缀合物化合物4和化合物12的胶原结合的比较。图2示出增加精氨酸的数量可减少EC50。
图3示出了生物缀合物化合物4和化合物14的胶原结合的比较。图3示出用另外的带正电的氨基酸(具体为赖氨酸)取代精氨酸不会影响结合EC50。
图4示出了生物缀合物化合物4、化合物8和化合物11的胶原结合的比较。图4示出减少氨基酸的数量会轻微增加EC50。
图5示出了生物缀合物化合物4、化合物9和化合物10的胶原结合的比较。图5示出将精氨酸残基更邻近于聚糖放置使EC50降低。
图1-5表明了在生物缀合物的肽部分中带正电荷的氨基酸残基的数量和位置(相对于聚糖)存在相关性。
图6示出了图1-5的生物缀合物化合物4(两个批次)、化合物6、化合物7、化合物8和化合物10的胶原结合的比较，并且图7示出将其相应的EC50值进行比较的柱状图。
图8示出了生物缀合物化合物4和化合物15的胶原结合的比较。图8示出用6-氨基-1-己酸取代GSG不会显著地影响EC50，其表明结合是依赖于肽的该区域的长度，而非特定序列。
图9示出了直链的生物缀合物(化合物16)、环状生物缀合物(化合物17)和化合物18的胶原结合的比较。化合物18在胶原结合亲和力上示出显著增加(较低EC50)。
图10示出了生物缀合物化合物18和化合物19的胶原结合的比较。化合物19在胶原结合亲和力上示出增加(较低EC50)。
图11示出了化合物4、化合物5(两个批次)和化合物3的胶原结合的比较。与化合物5和化合物3相比，化合物4在胶原结合亲和力上示出显著增加(较低Kd)。
实施例3.血小板聚集
通过在2-8℃过夜孵育，将I型原纤维胶原吸附到Ibidiμ-载玻片上。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗Ibidiμ-载玻片，然后用1％BSA的1x PBS溶液封闭。将2mg/mL的化合物10(如图12B所示)和化合物1(如图12A所示)应用至Ibidiμ-载玻片上并使其孵育。1小时之后，用1x PBS冲洗掉过量的缀合物。新鲜抽取的人类全血用钙黄绿素AM(活荧光细胞标记物)预染色。使用注射泵以1000s-1的剪切速率将血液泵过通道10分钟。当血液流过Ibidiμ-载玻片时，使用荧光显微镜拍摄聚集的荧光标记血小板的图像。图12显示化合物10(小图12B)抑制血小板与I型原纤维胶原的结合。
实施例4：生物缀合物用于治疗或预防新生内膜增生和外周动脉疾病(PAD)
在兔血管成形术模型中评估新内膜增生，在该模型中递送如本文所述的生物缀合物。该研究招募了多只(例如六只)兔子。每只动物都接受对左右髂动脉(iliac artery)进行球囊血管成形术介导的损伤。将动物分为测试组(肝素-SILY)或溶媒对照(1xPBS)。在每组中，两个髂动脉均受到损伤，并在球囊损伤后立即用测试物品或对照进行治疗。
在受伤后的给定时间(例如28天)后，对动物实施安乐死并通过组织学评估动脉节段。通常选择来自每个血管的具有最严重的新生内膜反应的几个(例如三个)组织学切片用于进行形态测定。用数字形态测定(IPLab software,Rockville,MD)从Movat染色的载玻片上测量外层弹性层(EEL)、内部弹性层(IEL)和管腔的截面面积。新生内膜厚度被测量为在最小和最大位点处从IEL到管腔的距离，然后取平均值。截面面积用于计算以下内容：
·中层面积＝EEL面积–IEL面积
·新生内膜面积＝IEL面积–管腔面积
·内膜-中层面积＝EEL面积–管腔面积
·％狭窄＝[1–(管腔面积/IEL面积)]*100
使用方差分析(ANOVA)比较变量的均值。小于0.05的p值通常被认为具有统计学意义。
可以预期的是，本文所述的生物缀合物将有效抑制新内膜增生，因此可以用于治疗或预防外周动脉疾病(PAD)。
实施例5:非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型
在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)小鼠模型中测试了化合物影响肝纤维化的能力。C57BL/6小鼠出生后接受单次皮下注射200μg链脲佐菌素。从4周龄开始，给动物喂高脂饮食。从第5周开始，持续4个周，直到第9周，动物接受每周3X的生理盐水或化合物10静脉内治疗。在同一期间内，另一组动物每天口服替米沙坦。在9周龄时处死动物，并收集肝脏用于组织学和生化分析。
使用天狼星红染色对肝脏的胶原含量进行组织学分析。定量染色并在图13中示出。与溶媒治疗组相比，用替米沙坦或化合物10治疗降低了肝脏中的胶原水平。
使用体内成像系统的分布
用荧光标记合成化合物。具体地，CF633经由酰肼以1:1的染料与骨架的合成摩尔比连接至骨架。将该分子以10mg/kg静脉内给药至裸鼠，并使用体内成像系统(IVIS)进行成像。在不同的时间点，将动物麻醉并使用IVIS成像，以确定标记化合物的生物分布。图14示出了注射后5或60分钟的化合物的定位。该化合物似乎集中于肾脏和膀胱。
实施例6：胶原结合试验2
针对不带间隔物的GQLYKSILYGSG(SEQ ID NO:)(肽X)结合结构域并针对单独的间隔物序列GSGSGSRR(SEQ ID NO:)(间隔物A)，对GQLYKSILYGSGSGSRR(SEQ ID NO:)(化合物10)的结合亲和力进行评估，结果如图18所示。与结合结构域或分离的间隔物相比，加入间隔物导致更大的结合亲和力。
对WREPSFSALS(SEQ ID NO:)(又称为vWF-2x，由于其与胶原上的von Willebran结合位点的结合)有和没有GSGSGSRR(SEQ ID NO:)间隔物的结合亲和力进行评估。WREPSFSALSGSGSGSRR(SEQ ID NO:)、WREPSFSALS(SEQ ID NO:)和GSGSGSRR(SEQ ID NO:)在图19右上中示出。胶原蛋白结合试验示出加入间隔物序列后结合亲和力增加。
通过孵育过夜，将50μg/ml的I型胶原蛋白吸附到高结合平板上。然后将平板用PBS洗涤，并用1％脱脂牛奶的PBS溶液封闭1小时。在1％BSA的PBS溶液中制备分子稀释液，然后在25℃下孵育1小时。然后用含有0.05％Tween 20的PBS洗涤平板。制备在1％BSA PBS中的链霉亲和素-HRP的1:500稀释液，并加入至平板上20分钟。然后将平板用PBS洗涤，并加入TMB溶液10分钟以显色。使用0.16M的硫酸停止显色，并使用酶标仪测量450mm处的吸光度。化合物10用作所有EC50结果的参比标准。
间隔物的长度和化学结构影响整个分子的胶原结合亲和力。间隔物通常主要由具有一些精氨酸残基的甘氨酸和丝氨酸的肽序列组成。甘氨酸和丝氨酸序列GSG可以用氨基己酸(Ahx)代替。精氨酸残基的位置在结合亲和力中起重要作用。将精氨酸残基更靠近GAG定位可改善胶原蛋白结合(图15)。另外，具有多个精氨酸残基增加了胶原结合亲和力。间隔物长度积极地对应于更高的结合亲和力(图16)。
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