阅读说明：本技术 一种造血干细胞冻存液及其制备方法和使用方法 (Hematopoietic stem cell cryopreservation liquid and preparation method and application method thereof ) 是由 黄亚非 代建波 余昆洪 李捡平 于 2018-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种造血干细胞冻存液及其制备方法和使用方法,包括卵磷脂、卵清蛋白、肌球蛋白、血小板裂解物和缓冲液；其中,每100ml所述冻存液中,所述卵磷脂的质量范围为1g至4g,所述卵清蛋白的质量范围为0.8g至1.5g,所述肌球蛋白的质量范围为0.8g至1.5g,所述血小板裂解物的质量至少为所述肌球蛋白质量的7.5倍,余量为所述缓冲液。本发明的有益效果是：本发明解决了传统细胞冻存液成分的毒副作用、细胞冻存存活率低的问题,既通过改变细胞内外电解质平衡,又通过增强细胞膜张力、武装细胞膜结构,提高细胞在冻存时的存活率。(The invention relates to a hematopoietic stem cell frozen stock solution and a preparation method and a using method thereof, wherein the hematopoietic stem cell frozen stock solution comprises lecithin, ovalbumin, myosin, platelet lysate and buffer solution; wherein, in every 100ml of the frozen stock solution, the mass range of the lecithin is 1g to 4g, the mass range of the ovalbumin is 0.8g to 1.5g, the mass range of the myosin is 0.8g to 1.5g, the mass of the platelet lysate is at least 7.5 times of the mass of the myosin, and the balance is the buffer solution. The invention has the beneficial effects that: the invention solves the problems of toxic and side effect of the components of the traditional cell freezing solution and low cell freezing survival rate, and improves the survival rate of cells during freezing by changing the balance of electrolytes inside and outside the cells, enhancing the tension of cell membranes and armed cell membrane structure.)

一种造血干细胞冻存液及其制备方法和使用方法

技术领域

本发明涉及造血干细胞冻存技术领域，尤其涉及一种造血干细胞冻存液及其制备方法和使用方法。

背景技术

冻存液是指可以保护细胞免受冷冻损伤的物质，在细胞悬液中加入冻存液可保护细胞免受溶液损伤和冰晶损伤，还可以通过在细胞内外维持一定的摩尔浓度，降低细胞内外未结冰溶液中电解质的浓度，从而使细胞免受溶质的损伤。

传统的细胞冻存液在-80℃冰箱保存时，都是加入低分子或者高分子化学物，通过改变细胞内外电解质以及渗透压的平衡来稳定细胞在低温保存时的细胞存活率；如，常规细胞冻存液都是加入10％二甲基亚砜和白蛋白、羟乙基淀粉组合物，而二甲基亚砜等一些低分子物质具有细胞毒性以及其他方面的毒副作用，冻存细胞存活率不是很高，整体来看，传统细胞冻存保护液在细胞冻存方面存在许多缺陷。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的缺陷，提供一种造血干细胞冻存液及其制备方法和使用方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

依据本发明的一个方面，提供一种造血干细胞冻存液，包括卵磷脂、卵清蛋白、肌球蛋白、血小板裂解物和缓冲液；

其中，每100ml所述冻存液中，所述卵磷脂的质量范围为1g至4g，所述卵清蛋白的质量范围为0.8g至1.5g，所述肌球蛋白的质量范围为0.8g至1.5g，所述血小板裂解物的质量至少为所述肌球蛋白质量的7.5倍，余量为所述缓冲液。

本发明的有益效果是：肌球蛋白重链环抱能将卵清蛋白运输进细胞内，使卵清蛋白提前与水分子结合而改变细胞内粘度，从而在降温时阻止冰晶的形成，另外，肌球蛋白与卵磷脂共同作用能够增强细胞膜的张力和抗压力，从而使得细胞不容易被冰晶刺破，从而使得细胞冻存时不需要程控降温，可直接放入-80℃冰箱中冻存，操作方便；血小板裂解物能够为肌球蛋白的运输提供需要的ATP和营养物质，还与缓冲液共同作用调节电解质平衡；本发明解决了传统细胞冻存液成分的毒副作用、细胞冻存存活率低的问题，既通过改变细胞内外电解质平衡，又通过增强细胞膜张力、武装细胞膜结构，提高细胞在冻存时的存活率。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步：每100ml所述冻存液中，所述卵磷脂和所述肌球蛋白的质量比范围为4:1至1:1，所述卵清蛋白和所述肌球蛋白的质量比范围为8:10至11:10。

进一步：每100ml所述冻存液中，所述卵磷脂和所述肌球蛋白的质量比为3:1。

上述进一步方案的有益效果是：提高卵磷脂和肌球蛋白的配合作用效率，尽可能减少冰晶的形成，使得细胞冻存时不需要程控降温，操作方便。

进一步：每100ml所述冻存液中，所述卵清蛋白和所述肌球蛋白的质量比为1:1。

上述进一步方案的有益效果是：提高卵清蛋白和肌球蛋白共同作用的效率，尽可能的增强细胞膜的张力和抗压力，避免细胞被冰晶刺破，提高细胞存活率。

进一步：所述缓冲液为勃脉力A注射液或者PBS缓冲液。

上述进一步方案的有益效果是：起到定容和调节电解质平衡的作用。

依据本发明的另一个方面，提供一种造血干细胞冻存液的制备方法，制备每100ml所述冻存液，包括以下步骤：

S01：取1g至4g的卵磷脂、0.8g至1.5g的卵清蛋白和0.8g至1.5g的肌球蛋白在2ml的勃脉力A注射液缓冲液中混匀，得到混合溶液；

S02：将所述步骤S01中得到的所述混合溶液避光常温静置15min；

S03：在所述混合溶液中加入质量至少为所述肌球蛋白质量7.5倍的血小板裂解物，并加入一定量的勃脉力A注射液缓冲液定容，使所述冻存液的体积达到100ml。

本发明的有益效果是：通过将卵磷脂、卵清蛋白和肌球蛋白在2ml的勃脉力A注射液缓冲液中混匀，并避光常温静置，用于为卵磷脂和肌球蛋白、卵清蛋白和肌球蛋白的相互结合提供生物作用时间，以提高其配合作用效率。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步：所述步骤S01中，所述卵磷脂和所述肌球蛋白的质量比为3:1。

上述进一步方案的有益效果是：提高卵磷脂和肌球蛋白的配合作用效率，尽可能减少冰晶的形成，使得细胞冻存时不需要程控降温，操作方便。

进一步：所述步骤S01中，所述卵清蛋白和所述肌球蛋白的质量比为1:1。

上述进一步方案的有益效果是：提高卵清蛋白和肌球蛋白共同作用的效率，尽可能的增强细胞膜的张力和抗压力，避免细胞被冰晶刺破，提高细胞存活率。

依据本发明的另一个方面，提供一种造血干细胞冻存液的使用方法，包括以下步骤，将制备好的造血干细胞悬液加入到所述冻存液中，然后直接放入-80℃的冰箱中保存。

本发明的有益效果是：细胞冻存时不需要程控降温，可直接放入-80℃冰箱中冻存，操作方便。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

进一步：所述冻存液与所述造血干细胞悬液的体积比为1:1或者2:1。

上述进一步方案的有益效果是：使细胞能够充分与冻存液的作用成份相互接触、并相互作用，以达到最理想的冻存效果，提高细胞存活率。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

一种造血干细胞冻存液，其包括卵磷脂、卵清蛋白、肌球蛋白、血小板裂解物和缓冲液；

其中，每100ml所述冻存液中，所述卵磷脂的质量范围为1g至4g，所述卵清蛋白的质量范围为0.8g至1.5g，所述肌球蛋白的质量范围为0.8g至1.5g，所述血小板裂解物的质量至少为所述肌球蛋白质量的7.5倍，余量为所述缓冲液。

每100ml所述冻存液中，所述卵磷脂和所述肌球蛋白的质量比范围为4:1至1:1，所述卵清蛋白和所述肌球蛋白的质量比范围为8:10至11:10。

优选的，每100ml所述冻存液中，所述卵磷脂和所述肌球蛋白的质量比为3:1。

优选的，每100ml所述冻存液中，所述卵清蛋白和所述肌球蛋白的质量比为1:1。

所述缓冲液为勃脉力A注射液或者PBS缓冲液，在本实施例中，优选为勃脉力A注射液缓冲液。

所述勃脉力A注射液缓冲液购买自上海百特医疗用品有限公司。

优选的，每100ml所述冻存液中含有3g卵磷脂、1g卵清蛋白、1g肌球蛋白和7.5g血小板裂解物，余量为勃脉力A注射液缓冲液。

一种造血干细胞冻存液的制备方法，制备每100ml所述冻存液，其包括以下步骤：

S01：取1g至4g的卵磷脂、0.8g至1.5g的卵清蛋白和0.8g至1.5g的肌球蛋白在2ml的勃脉力A注射液缓冲液中混匀，得到混合溶液；

S02：将所述步骤S01中得到的所述混合溶液避光常温静置15min；

S03：在所述混合溶液中加入质量至少为所述肌球蛋白质量7.5倍的血小板裂解物，并加入一定量的勃脉力A注射液缓冲液定容，使所述冻存液的体积达到100ml。

所述步骤S01中，所述卵磷脂和所述肌球蛋白的质量比为3:1，所述卵清蛋白和所述肌球蛋白的质量比为1:1。

一种造血干细胞冻存液的使用方法，包括以下步骤，将制备好的造血干细胞悬液加入到所述冻存液中，然后直接放入-80℃的冰箱中保存。

进一步，所述冻存液与所述造血干细胞悬液的体积比为1:1或者2:1。在本实施例中，所述冻存液与所述造血干细胞悬液的体积比优选为2:1。

实施例一：一种造血干细胞冻存液，按照其制备方法进行制备100ml所述冻存液，其中包括3g卵磷脂、1g卵清蛋白、1g肌球蛋白和7.5g血小板裂解物，余量为勃脉力A注射液缓冲液，按照其使用方法将100ml的造血干细胞悬液加入到所述冻存液中，然后放入-80℃的冰箱中保存。

实施例二：一种造血干细胞冻存液，按照其制备方法进行制备100ml所述冻存液，其中包括3g卵磷脂、1g卵清蛋白、1g肌球蛋白和7.5g血小板裂解物，余量为勃脉力A注射液缓冲液，按照其使用方法将50ml的造血干细胞悬液加入到所述冻存液中，然后放入-80℃的冰箱中保存。

实施例三：一种造血干细胞冻存液，按照其制备方法进行制备100ml所述冻存液，其中包括1g卵磷脂、1g卵清蛋白、1g肌球蛋白和7.5g血小板裂解物，余量为勃脉力A注射液缓冲液，按照其使用方法将50ml的造血干细胞悬液加入到所述冻存液中，然后放入-80℃的冰箱中保存。

实施例四：一种造血干细胞冻存液，按照其制备方法进行制备100ml所述冻存液，其中包括3g卵磷脂、0.8g卵清蛋白、1g肌球蛋白和7.5g血小板裂解物，余量为勃脉力A注射液缓冲液，按照其使用方法将50ml的造血干细胞悬液加入到所述冻存液中，然后放入-80℃的冰箱中保存。

实施例五：一种造血干细胞冻存液，按照其制备方法进行制备100ml所述冻存液，其中包括3g卵磷脂、1g卵清蛋白、1g肌球蛋白和6g血小板裂解物，余量为勃脉力A注射液缓冲液，按照其使用方法将50ml的造血干细胞悬液加入到所述冻存液中，然后放入-80℃的冰箱中保存。

在造血干细胞冻存前、及在对造血干细胞冻存一个月后，对五组实施例的造血干细胞进行复苏后，分别检测造血干细胞回收率、存活率、CD34+回收率和菌落生成能力，具体实验数据结果分别如下表1、表2和表3所示。

表1造血干细胞存活率数据表

其中，TNC指的是有核细胞，造血干细胞被包含在有核细胞内，通过统计有核细胞的数量来统计造血干细胞的回收率，通过台盼蓝染色统计造血干细胞的存活率。

表2细胞CD34+回收率数据表

表3细胞菌落生成能力数据表

其中，CFU(Colony-Forming Units)，菌落形成单位，指单位体积中的干细胞的群落总数，用来体现干细胞的增殖能力。

根据表1、表2和表3的实验结果数据可知，在实施例二的实验条件下，造血干细胞冻存后的细胞存活率、细胞回收率、细胞CD34+回收率以及细胞的增殖能力都是最好的；减少卵磷脂、卵清蛋白或者血小板裂解物的量会影响细胞的冻存效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。