一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY2及应用
阅读说明：本技术 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY2及应用 (Lilium regale WRKY transcription factor gene LrWRKY2 and application thereof ) 是由 刘迪秋 普丽梅 陈虹均 郑锂蕾 李珊 王自娥 葛锋 于 2019-11-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种岷江百合WRKY转录因子基因<I>LrWRKY2</I>,其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所述,编码如SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的蛋白质,本发明通过功能基因组学相关技术研究证实<I>LrWRKY2</I>基因具有提高植物抗真菌的功能,将本发明抗真菌的<I>LrWRKY2</I>基因构建到植物表达载体上并转入烟草中过量表达,转基因烟草植株具有很强的抗真菌侵染能力,实验结果显示超表达<I>LrWRKY2</I>的转基因烟草对稻黑孢霉、茄腐镰刀菌、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、人参链格孢的侵染具有高水平的抗性。(The invention discloses a Lilium regale WRKY transcription factor gene LrWRKY2 The nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO:1, encoding the polypeptide shown as SEQ ID NO:2, the invention is proved by related technical research of functional genomics LrWRKY2 The gene has the function of improving the antifungal effect of plants, and the invention is antifungal LrWRKY2 The gene is constructed on a plant expression vector and is transferred into tobacco for over-expression, and the transgenic tobacco plant has strong true resistanceThe bacteria infection ability and the experimental result show that the over-expression is realized LrWRKY2 The transgenic tobacco has high-level resistance to infection of nigrospora oryzae, fusarium solani, fusarium verticillium, botrytis cinerea and alternaria ginseng.)
技术领域
本发明涉及分子生物学以及基因工程相关技术研究领域，特别是一种具有抗真菌侵染能力的岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY2及应用。
背景技术
植物以一种高度可变且时序性的方式对转录组进行大规模重新编程以应对病原物入侵或其它逆境胁迫，而这种赋予植物对不同环境条件具有可塑性适应的调控反应是多种转录因子网络作用的结果。WRKY转录因子是植物防卫反应相关转录因子网络中的一个调控蛋白基因家族，主要参与植物免疫系统应对多种不同的生物和非生物胁迫(Pandey SP,Somssich IE. The role of WRKY transcription factors in plant immunity. PlantPhysiol, 2009, 150(4): 1648-1655; Bakshi M, Oelmüller R. WRKY transcriptionfactor: Jack of many trades in plants. Plant Signal Behav, 2014, 9(2):e27700.)。WRKY转录因子是植物中最大的几类转录因子之一，N 端一般是由WRKYGQK 七肽序列组成的WRKY结构域，C 端则是CX4-5CX22-23HXH (C2H2)或CX7CX23-HXC (C2HC)组成的锌指结构(Rushton PJ, Somssich IE, Ringler P, et al. WRKY transcriptionfactors. Trends Plant Sci, 2010, 15(5): 247-258.)。
受WRKY 调控的靶基因启动子区大都含有W-box (TTGACC/T)，其中TGAC 是W-box的核心序列，且高度保守，一旦当中某一核苷酸发生改变都会导致WRKY 蛋白与之结合的能力的降低，甚至丧失(谢政文, 王连军, 陈锦洋, 等. 植物WRKY 转录因子及其生物学功能研究进展. 中国农业科技导报, 2016, 18(3): 46-54.)。WRKY结构域由四股β折叠构成，保守的WRKYGQK残基对应于N端的β折叠(strand β-1)，能够进入DNA沟并与DNA上的W盒发生作用(Ciolkowski I, Wanke D, Birkenbihl RP, et al. Studies on DNA-bindingselectivity of WRKY transcription factors lend structural clues into WRKY-domain function. Plant Mol Biol, 2008, 68(1-2): 81-92.)。
WRKY转录因子通过调控植物转录组重新编程以应对不同病原物的入侵，其对抗病反应相关基因的转录调控是植物对病原体防卫反应的关键组成部分，在植物防卫反应中起重要作用。植物中的WRKY基因家族包含许多调节植物生长和发育以及多种应激反应的成员(Wu ZJ, Li XH, Liu ZW, et al. Transcriptome-wide identification of Camellia sinensis WRKY transcription factors in response to temperature stress. MolGenet Genomics, 2016, 291(1): 255-69.)。在胡杨中过表达PtrWRKY18和PtrWRKY35可增强对锈菌（Melampsora）的抗性，同时提高转基因植物中PR基因的表达(Jiang Y, Guo L,Ma X, et al. The WRKY transcription factors PtrWRKY18 and PtrWRKY35 promoteMelampsora resistance in Populus. Tree Physiol, 2017, 37(5): 665-675.)。草莓FaWRKY1则负调控果实对胶孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)的抗性(Higuera JJ,Garrido-Gala J, Lekhbou A, et al. The strawberry FaWRKY1 transcription factornegatively regulates resistance to Colletotrichum acutatum in fruit uponInfection. Front Plant Sci, 2019, 10: 480.)。PtWRKY14超表达则可增强烟草(Nicotiana tabacum)对TMV侵染的抵抗能力(王兴, 林善枝. PtWRKY14基因转化烟草及对TMV的抗性影响研究. 广东农业科学, 2014, 41(7): 130-133.)。此外，水杨酸（SA）介导的活性氧（ROS）信号传导增强了JcWRKY转基因烟草对苜蓿炭腐病病原菌的抗性(Agarwal P,Patel K, Agarwal PK. Ectopic expression of JcWRKY confers enhanced resistancein transgenic tobacco against Macrophomina phaseolina. DNA Cell Biol, 2018,37(4): 298-307.)。
百合是百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物的总称，属多年生球根类花卉。在种球繁殖及鲜切花生产过程中，百合易受到真菌、病毒、细菌等多种病原菌的危害。目前发现的百合病害达几十种之多，其中由镰刀属（Fusariumspp.）真菌引起的枯萎病（又称为基腐病、茎腐病）是百合生产中危害最严重的病害。镰刀菌侵染百合种球后引起基盘坏死、鳞片腐烂脱落，造成种球质量下降；植株感染镰刀菌后叶片变黄、萎蔫下垂，植株提早枯萎死亡，严重影响百合切花的产量和品质。其中尖孢镰刀菌（F. oxysporum）致病性最强、分离频率最高，是百合枯萎病的主要致病菌。岷江百合(L. regale Wilson)为我国特有种，仅分布于岷江流域海拔800～2700m 的河谷到山腰的岩石缝中，具有强的抗枯萎病性，是现代百合育种的重要种质资源。WRKYs参与应答多种生物和非生物胁迫，是植物防御系统的重要组成部分，因此对岷江百合中WRKY转录因子基因的发掘以及功能分析具有重要的研究及其应用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY2及其应用，即在提高烟草对稻黑孢霉（Nigrospora oryzae）、茄腐镰刀菌（Fusarium solani）、轮枝镰刀菌（Fusarium verticillioides）、葡萄座腔菌（Botryosphaeria dothidea）、人参链格孢（Alternaria panax）抗性中的应用。
本发明从岷江百合中克隆获得的具有抗真菌活性的WRKY转录因子的全长基因，WRKY转录因子基因LrWRKY2核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因cDNA全长序列为1302bp，包含一个1032 bp的开放阅读框、45 bp的5’非翻译区、225 bp的3’非翻译区，编码如SEQID NO:2所示氨基酸序列的蛋白质。
本发明中LrWRKY2基因的编码区是序列表SEQ ID NO:1中第46-1077位所示的核苷酸序列。
本发明分离克隆岷江百合的一个抗真菌相关基因的完整cDNA片段，利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导将目的基因转入受体植物中并过量表达，通过进一步实验验证该基因是否具有抗真菌的活性，为后期利用该基因改良烟草及其他植物抵御真菌病害的能力奠定基础，发明人将这个基因命名为LrWRKY2。
上述LrWRKY2基因可以应用于提高烟草的抗真菌特性，具体操作如下：
（1）采用扩增LrWRKY2的特异引物，从接种尖孢镰刀菌后的岷江百合根中提取总RNA，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)扩增出LrWRKY2的全长编码区，然后将其连接到pGEM-T载体上，经测序获得具有目的基因的克隆；
（2）用限制性内切酶BamHI和XbaI酶切pGEM-T-LrWRKY2载体，通过胶回收得到目的基因片段，用同样的内切酶酶切植物表达载体pCAMBIA2300s，胶回收获得所需载体大片段，再将所获得LrWRKY2基因片段与pCAMBIA2300s片段连接，构建植物超表达载体，之后将所构建的重组载体通过根癌农杆菌介导转入烟草中表达；
（3）以重组载体T-DNA上具有的抗性标记筛选转化子，并通过PCR以及RT-PCR检测得到真正的转基因植株，分析转基因植物叶片抗真菌侵染的能力，最后筛选出对真菌抗性明显增强的转基因植株。
本发明为提高植物对真菌病害的抗性提供了一种新的方法，通过基因工程手段培育抗病植物可以克服传统育种的不足，不仅育种周期缩短，而且操作简单，容易获得高抗材料。本发明来自岷江百合的LrWRKY2基因能增强植物对真菌的抗性，将该基因导入烟草中，可以产生具有真菌抗性的新品种和新材料。利用基因工程技术培育抗性植物品种和材料具有明显的优势和不可取代的重要性；它不仅可以为大规模生产农作物、药材、园艺植物等提供方便，大量减少化学农药的使用，还可以为农业生产节约成本、减小环境污染，因此本发明具有广阔的市场应用前景。
附图说明
图1是本发明LrWRKY2转基因烟草基因组DNA的PCR检测结果图，图中：Marker为DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；阳性对照为质粒pGEM-T-LrWRKY2为模板的PCR结产物；WT为非转基因烟草(野生型)总DNA为模板PCR的产物；
图2是本发明阳性LrWRKY2转基因烟草中LrWRKY2转录水平的表达分析结果图；图中：Marker是DL2000 DNA Marker (大连宝生物)；WT是非转基因烟草总RNA逆转录cDNA为模板的PCR产物；阳性对照是质粒pGEM-T-LrWRKY2为模板的PCR产物；
图3是本发明LrWRKY2转基因烟草抗性鉴定的结果图；图中a、b、c、d、e分别是接种稻黑孢霉、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌、人参链格孢的LrWRKY2转基因烟草叶片；WT为野生型烟草的叶片，1、8、17、27为LrWRKY2转基因烟草的叶片。
具体实施方式
下面通过附图和实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
实施例1：LrWRKY2全长基因克隆以及序列分析
用尖孢镰刀菌接种岷江百合，用接种24 h后的根提取总RNA，用液氮将接种后的岷江百合根研磨成粉末，然后转入离心管中，采用异硫氰酸胍法提取总RNA，采用逆转录酶M-MLV(promega)以总RNA为模板合成cDNA第一链，反应体系和操作过程为：取5 μg Total RNA，依次加入50 ng oligo（dT），2 μL dNTP（2.5 mM each）、DEPC水加至反应体积为14.5 μL；混匀后，70℃加热变性5 min后迅速在冰上冷却5 min，然后依次加入4 μL 5×First-standbuffer、0.5 μL RNasin（200U）、1 μL M-MLV（200U），混匀并短时离心，42℃温浴1.5 h，取出后70℃加热10 min，终止反应；cDNA第一链合成后置于-20℃保存备用。
以合成的第一链cDNA为模板，扩增目的基因LrWRKY2，所用上下游引物序列分别为5’ CTACAAGGTTCATCCTGCTAGACAT 3’及5’ TTTGCTTTCCATCCACTAGATAACA3’。采用AdvantageTM 2 PCR Enzyme（Clontech）扩增出目的基因；PCR反应条件：94℃ 5 min；94℃30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32个循环；72℃ 7 min；反应体系（20 μL）为0.5 μL cDNA、2μL 10×Advantage 2 PCR Buffer、0.4 μL 50×dNTP Mix （10mM each）、0.4 μL 正向引物（10 μM）、0.4 μL 反向引物（10 μM）、0.4 μL Advantage 2 PCR Polymerase Mix、15.9 μLPCR-Grade water；PCR结束后，取5 μL用于琼脂糖凝胶电泳，以检测扩增产物的特异性以及大小。
对PCR产物进行TA克隆，使用的试剂盒为pGEM-T easy Vector SystemⅠ（Promega,USA），反应体系和操作过程为：取1.5 μL PCR产物，依次加入1 μL pGEM-T Vector（50 ng/μL）和2.5 μL 2×Ligation solution I，混匀后置于16 ℃过夜反应。采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中。使用含有氨苄青霉素（ampicillin，Amp）的LB固体培养基筛选阳性克隆，挑选若干个单菌落，摇菌后用扩增LrWRKY2的特异引物鉴定出多克隆位点***LrWRKY2的克隆，将所鉴定的克隆进行测序，最终获得的LrWRKY2全长cDNA为1302 bp，通过NCBI ORF finder （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析发现其包含一个1032 bp的开放读码框（见序列表），LrWRKY2编码一个含343个氨基酸的蛋白质，其分子量约为37.91 KDa，等电点约为5.88，含有4个半胱氨酸残基。LrWRKY2具有1个WRKYGQK保守结构域，在每个WRKY结构域之后紧接一个C2H2 (C-X4-C-X22/23-H-X1-H)型锌指基序。显然，LrWRKY2编码的蛋白质属于Ⅱ类WRKY转录因子。
实施例2：植物超表达载体构建
采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒（上海生工）提取***LrWRKY2的大肠杆菌质粒pGEM-T-LrWRKY2以及植物表达载体pCAMBIA2300s的质粒，取1 μL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性及浓度高低；用限制性内切酶BamHI（TaKaRa）和XbaI（TaKaRa）分别对质粒pGEM-T-LrWRKY2和pCAMBIA2300s进行双酶切（100 μL体系），反应体系和操作过程为：取20 μL pGEM-T-LrWRKY2和pCAMBIA2300s质粒、依次加入10 μL 10×K buffer、4 μL BamHI、6 μL XbaI、60 μL ddH2O，混匀后短时离心，置于37℃过夜反应；将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对LrWRKY2片段和pCAMBIA2300s载体大片段分别进行胶回收，整个过程使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒（上海生工）；取1 μL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20℃保存备用。
利用T4 DNA Ligase（TaKaRa），将回收的LrWRKY2 DNA片段和pCAMBIA2300s载体片段连接起来，反应体系（20 μL）和操作过程为：取10 μL LrWRKY2 DNA片段依次加入2 μLpCAMBIA2300s载体DNA、2 μL 10×T4 DNA Ligase Buffer、1 μL T4 DNA Ligase、5 μLddH2O，混匀后短时离心，然后16℃水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌DH5α中，用含有50 mg/L卡那霉素（kanamycin，Km）的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增LrWRKY2的特异引物进行PCR，挑选出LrWRKY2与pCAMBIA2300s成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入甘油并置于-80℃保存备用。
采用SanPrep柱式质粒抽提试剂盒（上海生工）提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300s-LrWRKY2质粒。随后用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300s-LrWRKY2转入根癌农杆菌LBA4404感受态细胞中。操作步骤为：取2μgpCAMBIA2300s-LrWRKY2质粒加入含有200μL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴5min，随后转入液氮中冷冻1 min，然后迅速置于37℃水浴5 min，之后立即冰浴2 min，加入800μL LB液体培养基于28℃振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃静止培养。挑选单菌落摇菌，再用扩增LrWRKY2的特异性引物进行PCR，检测pCAMBIA2300s-LrWRKY2是否转入农杆菌中，对于阳性克隆，加入甘油后置于-80℃保存备用。
实施例3：农杆菌介导的植物遗传转化以及转基因植物筛选
本实验的转基因受体是烟草，将烟草种子用75%的酒精浸泡30s，用无菌水洗涤后用0.1%的HgCl2浸泡8 min，然后再用无菌水洗涤若干次，播种于1/2 MS培养基上，28℃暗培养6d，发芽后转至光照培养箱（25℃，16 h/d光照），以后每月用1/2MS培养基继代一次。
从-80℃冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300s-LrWRKY2质粒的农杆菌LBA4404菌种，接种于5 mL含有50 mg/L Km和20 mg/L利福平的LB液体培养基中，28℃培养至培养基浑浊。吸取1 mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28℃培养48 h；随后将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于附加有20 mg/L的乙酰丁香酮的MGL液体培养基中，28℃振荡培养2-3 h以活化农杆菌。
取烟草无菌苗叶片切成1 cm2左右的叶盘，完全浸泡于上述含有活化农杆菌的MGL液体培养基中，浸染时间为15 min，用无菌滤纸吸干叶片表面的菌液，将叶盘置于共培养基上进行室温培养，烟草转化的共培养基为MS+0.02 mg/L 6-BA+2.1 mg/L NAA+30 g/Lsucrose+6 g/L琼脂，22℃无光条件下共培养2天。
将共培养后的叶盘转到加有抗生素的MS筛选培养基中分化成苗，同时筛选转基因植株。烟草筛选培养基为MS+0.5mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L sucrose+6g/L琼脂+50mg/L Km+200 mg/L 头孢霉素（cefotaxime sodium salt，Cef）；筛选培养时将培养瓶转移至光照培养箱培养（25℃，16 h/d光照，8 h/d黑暗），待烟草长出芽后用含有50 mg/L Km和200mg/L Cef的MS培养基继代培养，因烟草愈伤分化率较高，故需要对再生植株进行进一步筛选，将烟草再生苗移至含有50 mg/L Km的MS培养基上使其生根，最后选用生根较好的再生苗做进一步的检测。
采用CTAB法提取转基因烟草植株叶片的基因组DNA，将提取的基因组DNA取1μL通过琼脂糖凝胶电泳检测其完整性和浓度，以转基因植株的基因组DNA为模板用扩增LrWRKY2的特异引物进行PCR，PCR结束后，取8μL产物用于琼脂糖凝胶电泳以检测阳性转基因植株，部分烟草转基因植株的扩增结果如图1所示，LrWRKY2转基因烟草共筛选到51株阳性转基因植株。
实施例4：转基因烟草中LrWRKY2的表达分析以及转基因植株抗真菌侵染的功能分析
取阳性转基因单株以及非转基因烟草（野生型）的嫩叶提取总RNA，逆转录生成cDNA第一链，并以此为模板用扩增LrWRKY2的特异引物进行PCR，根据PCR结果分析各转基因单株中LrWRKY2转录水平的表达，总RNA提取以及RT-PCR的方法与实施例1中相同，PCR结束之后，取8μL用于琼脂糖凝胶电泳，部分单株的检测结果如图2所示，共检测到47个转基因单株中LrWRKY2在转录水平大量表达，这些单株的编号为1～47。
将实验室保存的几种病原真菌接种于PDA固体培养基（200g/L马铃薯，15g/L琼脂，20 g/L葡萄糖）上，28℃暗培养7d。选取温室中生长良好、大小均一且完全伸展的野生型烟草和LrWRKY2转基因烟草叶片，用手术剪从叶柄除剪下。用无菌塑料枪头在叶片约相同位置形成大小一致的伤口，分别接种大小相等的真菌菌丝块。将处理后的叶片置于铺有无菌水浸湿的滤纸的平板中，于28℃光照培养箱中培养，每天加水保湿。培养7 d后收集叶片并观察各株系叶片的发病情况。结果如图3所示，分别接种稻黑孢霉、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌、人参链格孢等五种病原真菌后，野生型烟草的叶片形成较大的病斑，叶片出现黄化和腐烂的现象，而转基因烟草叶片的症状很轻微，形成的病斑面积也远小于野生型烟草。显然，LrWRKY2转基因烟草对稻黑孢霉、轮枝镰刀菌、葡萄座腔菌、茄腐镰刀菌、人参链格孢等病原真菌具有很强的抗性。
序列表
<110> 昆明理工大学
<120> 一种岷江百合WRKY转录因子基因LrWRKY2及应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1302
<212> DNA
<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)
<400> 1
ctcccctctc cctctctcac ccctacaagg ttcatcctgc tagacatgtg tgatctcttc 60
tggcaaagaa tggaaggcga gcttgccgac atcgtccgca ccagcggcct caccagccat 120
ccgcccatct ccgactttgc tgattgggat ctaccttccg accccataac cttctcccct 180
tcatcccaag acaacttcgg cgacccattc atcaacttgc cagatccatt gcttcatgaa 240
tcaccggcca ccaatatcgc tccagtctct gactccgaca accatgaaat aggtgtgcca 300
cttgctcaga ggatgatagc agcgagcgag gagctgaaga ggcctaacaa catattctca 360
cggatgctgc agatctcccc aagggagcta aaagctactc aaatgatatc gaccagtgat 420
ttgatgaaga cgagcaacag tggctcgaca ggcgccgtgc agatttcctc tccaaggggt 480
cttggaatca agaggaggaa aagccaggca aagaaggtgg tgtgcatccc agcaccagca 540
gctacaacca gcaggagcag tggagaggtt gttccagctg atctttgggc ttggaggaag 600
tatggacaga aacccatcaa aggttctcct catccaaggg gctactatag atgcagcagc 660
tcaaaaggat gctcagcaag gaagcaagtc gagaggagcc gaactgatcc aaacatgcta 720
gtcatcactt acacatccga gcacaaccat ccctggccga cacagaggaa cgctctcgct 780
ggatcgacaa gatcgtcaca cccggctaag aacatctctt ccgcggcatc caagatctcc 840
ccacctgcaa atttgaagga agaagaaccc aaggaggagg taatctcaac cattgtgcca 900
gtgaaggaag aaatggcagg aaatgatcat caagaattcc aagaccaagt gttgcagcat 960
acttacaagc caatgatacc agactcgaat caatccgatg atttctttga tgagttggga 1020
gaattgggga ctgattctat ggattcattt aacatgtttg aatgggccgg gaaataatct 1080
ggagtcatag atttcgaata aaaagttgtt atctagtgga tggaaagcaa aaactattga 1140
ggtttgaagc acatacattt tcacatactt gatttaacca aaatatgaat taaatcctta 1200
gtgtcctata agtgaaaatg tattgtgcat ggattctgtt ttatggattg ctacatatat 1260
ttgtgttttg gactatctga ccaatgactg gttaacttat aa 1302
<210> 2
<211> 343
<212> PRT
<213> 岷江百合(Lilium regale Wilson)
<400> 2
Met Cys Asp Leu Phe Trp Gln Arg Met Glu Gly Glu Leu Ala Asp Ile
1 5 10 15
Val Arg Thr Ser Gly Leu Thr Ser His Pro Pro Ile Ser Asp Phe Ala
20 25 30
Asp Trp Asp Leu Pro Ser Asp Pro Ile Thr Phe Ser Pro Ser Ser Gln
35 40 45
Asp Asn Phe Gly Asp Pro Phe Ile Asn Leu Pro Asp Pro Leu Leu His
50 55 60
Glu Ser Pro Ala Thr Asn Ile Ala Pro Val Ser Asp Ser Asp Asn His
65 70 75 80
Glu Ile Gly Val Pro Leu Ala Gln Arg Met Ile Ala Ala Ser Glu Glu
85 90 95
Leu Lys Arg Pro Asn Asn Ile Phe Ser Arg Met Leu Gln Ile Ser Pro
100 105 110
Arg Glu Leu Lys Ala Thr Gln Met Ile Ser Thr Ser Asp Leu Met Lys
115 120 125
Thr Ser Asn Ser Gly Ser Thr Gly Ala Val Gln Ile Ser Ser Pro Arg
130 135 140
Gly Leu Gly Ile Lys Arg Arg Lys Ser Gln Ala Lys Lys Val Val Cys
145 150 155 160
Ile Pro Ala Pro Ala Ala Thr Thr Ser Arg Ser Ser Gly Glu Val Val
165 170 175
Pro Ala Asp Leu Trp Ala Trp Arg Lys Tyr Gly Gln Lys Pro Ile Lys
180 185 190
Gly Ser Pro His Pro Arg Gly Tyr Tyr Arg Cys Ser Ser Ser Lys Gly
195 200 205
Cys Ser Ala Arg Lys Gln Val Glu Arg Ser Arg Thr Asp Pro Asn Met
210 215 220
Leu Val Ile Thr Tyr Thr Ser Glu His Asn His Pro Trp Pro Thr Gln
225 230 235 240
Arg Asn Ala Leu Ala Gly Ser Thr Arg Ser Ser His Pro Ala Lys Asn
245 250 255
Ile Ser Ser Ala Ala Ser Lys Ile Ser Pro Pro Ala Asn Leu Lys Glu
260 265 270
Glu Glu Pro Lys Glu Glu Val Ile Ser Thr Ile Val Pro Val Lys Glu
275 280 285
Glu Met Ala Gly Asn Asp His Gln Glu Phe Gln Asp Gln Val Leu Gln
290 295 300
His Thr Tyr Lys Pro Met Ile Pro Asp Ser Asn Gln Ser Asp Asp Phe
305 310 315 320
Phe Asp Glu Leu Gly Glu Leu Gly Thr Asp Ser Met Asp Ser Phe Asn
325 330 335
Met Phe Glu Trp Ala Gly Lys
340
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
ctacaaggtt catcctgcta gacat 25
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
tttgctttcc atccactaga taaca 25