阅读说明：本技术 一种组成型激活态小g蛋白及其在水稻耐盐方面的应用 (Constitutive activated small G protein and application thereof in salt tolerance of rice ) 是由 张云辉 方先文 朱孔志 卢俊 陈海元 张所兵 朱晓妹 于 2019-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种组成型激活态小G蛋白及其在水稻耐盐方面的应用,属于水稻基因工程领域。本发明主要是通过PCR引入错配的方式将拟南芥小G蛋白ARA6的第93位谷氨酰胺(Q)突变为亮氨酸(L),使小G蛋白ARA6处于激活态,与GTP牢固结合而不能从靶膜上解离。通过构建35S启动子驱动AtARA6<Sup>Q93L</Sup>的过量表达载体,转化水稻,获得AtARA6<Sup>Q93L</Sup>过量表达的转基因植株,从后代中选择纯合的过量表达株系。经盐溶液处理,过表达AtARA6<Sup>Q93L</Sup>可显著增强水稻的耐盐性。因此,本发明在水稻耐盐性上有较大的应用潜力。(The invention discloses a constitutive activated small G protein and application thereof in salt tolerance of rice, belonging to the field of rice genetic engineering. The invention mainly mutates glutamine 93 (Q) of arabidopsis small G protein ARA6 to leucine (L) by introducing mismatch through PCR (polymerase chain reaction), so that the small G protein ARA6 is in an activated state and is firmly combined with GTP and can not be dissociated from a target membrane. Driving AtARA6 by construction of 35S promoter Q93L The rice was transformed to obtain AtARA6 Q93L Overexpressing transgenic plants, selecting homozygous overexpressing lines from the progeny.Treating with saline solution to overexpress AtARA6 Q93L Can obviously enhance the salt tolerance of the rice. Therefore, the invention has great application potential in the salt tolerance of rice.)

一种组成型激活态小G蛋白及其在水稻耐盐方面的应用

一、技术领域

本发明涉及水稻基因工程领域，具体涉及一种组成型激活态小G蛋白及其在水稻耐盐方面的应用。

二、背景技术

我国现有滩涂总面积超过3000万亩，目前每年仍以1.9万亩的速度增长，内陆盐碱地更是近15亿亩。近期可开展农业利用的盐碱地面积达3亿亩，是我国重要的土地后备资源。在我国现有耕地资源已得到充分挖掘，常规耕地生产力水平进一步提升面临瓶颈的情况下，加强沿海滩涂和内陆盐碱地开发可显著提升我国农业生产能力。通过传统育种或转基因技术发展耐盐作物，提高粮食总产，并利用作物种植修复土壤，对于保障国家粮食安全具有重要的现实意义和长远的战略意义。

小G蛋白是一类大小在20-25kDa的分子开关，在与GTP结合呈现的激活态和与GDP结合呈现的失活态之间循环。处于激活态的小G蛋白能与其效应因子互作从而引发下游的调控事件。RAB是小G蛋白家族中最大的一个亚家族，包括60多个成员，定位于不同的细胞器中。RAB主要参与细胞的内膜运输。细胞中内膜系统合成的蛋白和膜物质需要经过囊泡(Vesicle)的运输才能达到作用的地方，因此囊泡运输对生物体的正常生长、发育和维持细胞稳态非常重要。囊泡在两个膜室之间的运输经历以下过程：囊泡从供体膜出牙、沿细胞骨架运动、在靶膜上停泊/拴系和SNARE蛋白介导的囊泡与靶膜融合(Zerial and McBride，Nat Rev Mol Cell Biol,2001,2:107-117)，而所有过程都需要RAB蛋白的参与。

目前，囊泡运输与植物耐盐性的关系研究较少。理论上，在盐胁迫下细胞内的膜系统最易收到盐胁迫诱导的活性氧(ROS)的伤害。因此，要维持细胞膜结构和功能的完整性需要通过内吞(endocytosis)受损的细胞膜物质和外泌(exocytosis)新的膜组分。同时，与盐离子运输相关的离子泵或通道蛋白在亚细胞结构上的正确定位也离不开囊泡运输的作用。Mazel等(Plant Physiol,2004,134:118-128)将AtRabG3e在拟南芥中过表达加快了细胞的内吞过程，使更多的Na⁺离子积累到液泡中，也减少了细胞内ROS的积累，从而提高了耐盐性。又如V-SNARE AtVAMP7C蛋白家族在囊泡和液泡膜的融合中起作用。AtVAMP7C的RNAi和T-DNA***株系在盐胁迫下细胞内产生的含H₂O₂的囊泡无法与液泡膜融合，维持了液泡的正常功能，从而增加了对盐的抗性(Leshem等,Proc Natl Acad Sci USA,2006,103:18008-18013)。拟南芥中过表达植物特有型RAB5小G蛋白ARA6融合GFP荧光蛋白增强了拟南芥的抗盐性(Ebine等,Nat Cell Biol,2011,13:853-859)。在水稻中包含两个ARA6的同源基因，分别是OsRAB5b和OsRAB5d。过表达组成型激活态的OsRAB5b/d能增强拟南芥对于盐胁迫的耐受能力(刘钰龙,南京农业大学硕士学位论文，2016)。然而RAB5小G蛋白与水稻耐盐性之间的关系尚未见相关报道。

三、

发明内容

技术问题

本发明所要解决的技术问题是，通过35S启动子过表达一种组成型激活态的RAB5小G蛋白，提高单子叶模式植物水稻的耐盐性。

技术方案

一种组成型激活态的RAB5小G蛋白，其特征在于，所述的组成型激活态小G蛋白的基因AtARA6^Q93L核苷酸序列为SEQ ID NO.1：

ATGGGATGTGCTTCTTCTCTTCCAGATAGGAACTCTGGAACTTTAAGTGGTCTTAGCAATTCAGAGAATGCTGTTCCAGCTGATGCCAAAAATCTACGTGTGAAGTTAGTTCTATTAGGAGACTCTGGTGTTGGTAAAAGTTGTATTGTCCTTCGATTTGTACGTGGTCAGTTTGACGCTACATCTAAGGTAACTGTTGGAGCCTCGTTCTTGTCCCAAACTATAGCATTGCAAGACTCTACCACAGTGAAGTTTGAAATATGGGATACAGCAGGACTGGAGAGGTATTCTGCTCTTGCACCACTATACTACCGTGGAGCTGGAGTTGCTGTTATTGTGTATGATATAACAAGCCCTGAATCGTTCAAGAAAGCACAGTATTGGGTTAAGGAACTGCAAAAGCATGGAAGCCCAGATATTGTTATGGCTCTGGTTGGTAACAAAGCTGATCTACATGAAAAAAGAGAAGTACCTACTGAGGATGGAATGGAGCTTGCAGAGAAGAACGGCATGTTCTTCATTGAGACGTCAGCCAAGACAGCCGATAACATAAATCAACTGTTTGAGGAAATTGGCAAGAGGCTACCTCGTCCTGCTCCTTCGTCATGA。

所述的组成型激活态小G蛋白的基因AtARA6^Q93L编码的蛋白质，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2：

MGCASSLPDRNSGTLSGLSNSENAVPADAKNLRVKLVLLGDSGVGKSCIVLRFVRGQFDATSKVTVGASFLSQTIALQDSTTVKFEIWDTAGLERYSALAPLYYRGAGVAVIVYDITSPESFKKAQYWVKELQKHGSPDIVMALVGNKADLHEKREVPTEDGMELAEKNGMFFIETSAKTADNINQLFEEIGKRLPRPAPSS。

所述的组成型激活态小G蛋白的基因AtARA6^Q93L可以在水稻遗传改良中应用。优选在改良水稻耐盐性中的应用。

所述的组成型激活态小G蛋白的基因AtARA6^Q93L编码的蛋白质可以在水稻遗传改良中应用。优选是指在改良水稻耐盐性中的应用。

有益效果

1.本发明提供的组成型激活态小G蛋白AtARA6^Q93L基因可以调控水稻的耐盐性。

2.本发明提供的由35S启动子驱动的组成型激活态小G蛋白AtARA6^Q93L过量表达载体可以提高单子叶植物水稻的耐盐性。

3.试验证明，野生型水稻中检测不到AtARA6^Q93L的表达，而转基因水稻株系中检测到不同表达量的AtARA6^Q93L基因，表达量可达到内参基因OsActin的11.4-29.2％。盐处理后过表达AtARA6^Q93L的水稻在苗长和根长上和野生型没有显著差异，而鲜重则达到野生型的1.3倍。

四、附图说明

图1水稻转基因株系AtARA6^Q93L的表达定量图。

图2水稻野生型和转基因株系耐盐性对比图。

五、

具体实施方式

1.组成型激活态小G蛋白AtARA6^Q93L的克隆。

提取拟南芥幼苗总RNA，按照M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)的要求，将1μg总RNA反转录成cDNA，参照AtARA6序列信息(TAIR登录号：AT3G54840)设计PCR引物，在SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5中引入点突变。

SEQ ID NO.3：ATGGGATGTGCTTCTTCTCT

SEQ ID NO.4：AGCAGAATACCTCTCCAGTC

SEQ ID NO.5：TGGGATACAGCAGGACTGGA

SEQ ID NO.6：TCATGACGAAGGAGCAGGAC

ARA6^WTcDNA作为模板，引物SEQ ID NO.3+SEQ ID NO.4，产物长度294bp，SEQ IDNO.7：

ATGGGATGTGCTTCTTCTCTTCCAGATAGGAACTCTGGAACTTTAAGTGGTCTTAGCAATTCAGAGAATGCTGTTCCAGCTGATGCCAAAAATCTACGTGTGAAGTTAGTTCTATTAGGAGACTCTGGTGTTGGTAAAAGTTGTATTGTCCTTCGATTTGTACGTGGTCAGTTTGACGCTACATCTAAGGTAACTGTTGGAGCCTCGTTCTTGTCCCAAACTATAGCATTGCAAGACTCTACCACAGTGAAGTTTGAAATATGGGATACAGCAGGACTGGAGAGGTATTCTGCT

ARA6^WTcDNA作为模板，引物SEQ ID NO.5+SEQ ID NO.6，产物长度348bp，为SEQ IDNO.8：

TGGGATACAGCAGGACTGGAGAGGTATTCTGCTCTTGCACCACTATACTACCGTGGAGCTGGAGTTGCTGTTATTGTGTATGATATAACAAGCCCTGAATCGTTCAAGAAAGCACAGTATTGGGTTAAGGAACTGCAAAAGCATGGAAGCCCAGATATTGTTATGGCTCTGGTTGGTAACAAAGCTGATCTACATGAAAAAAGAGAAGTACCTACTGAGGATGGAATGGAGCTTGCAGAGAAGAACGGCATGTTCTTCATTGAGACGTCAGCCAAGACAGCCGATAACATAAATCAACTGTTTGAGGAAATTGGCAAGAGGCTACCTCGTCCTGCTCCTTCGTCATGA

(下划线为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的重叠序列)

将SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8的混合片段作为模板，引物SEQ ID NO.3+SEQ IDNO.6，通过重叠延伸PCR技术得到AtARA6第278位核苷酸由腺嘌呤A突变为胸腺嘧啶T的CDS全长序列，产物长度609bp(全长ARA^Q93L CDS)。50μL反应体系：cDNA模板1μL，2×PCR buffer25μL，前后引物各1.5μL(10μM)，dNTP mix 10μL(2mM)，KOD FX 1μL，ddH₂O 10μL。反应程序：94℃预变性2min，98℃变性10sec，55℃退火30sec，68℃延伸30sec，反应33个循环，68℃延伸5min。PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化，连接到平末端克隆载体pEASY-Blunt(TRANSGEN)，转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆摇菌，用质粒小提试剂盒(AXYGEN)提取质粒，进行序列测定，测定序列为SEQ ID No.1。

2.35S驱动AtARA6^Q93L过量表达载体的构建。

在上述SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.6引物的5’端各加入来自载体1300-221-Flag的XbaI和BamHI酶切位点两侧的16bp序列，形成SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10两条引物。

SEQ ID NO.9:CACGGGGGACTCTAGAATGGGATGTGCTTCTTCTCT

SEQ ID NO.10:AGGCTACGTAGGATCCTCATGACGAAGGAGCAGGAC

以pEASY-AtARA6^Q93L的质粒作为模板，通过PCR扩增目的片段。PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化。以XbaI和BamHI双酶切1300-221-Flag载体质粒，酶切体系为：10×buffer K 2.5μL，XbaI 2.0μL，BamHI 2.0μL，质粒DNA 10μL，ddH₂O补充到50μL，37℃酶切过夜。将线性化的载体通过凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化。将含有AtARA6^Q93L完整CDS的片段和线性化的1300-221-Flag载体通过同源重组试剂盒连接(In-Fusion HD CloningKit，TAKARA)，得到重组质粒1300-221-AtARA6^Q93L转化DH5α感受态细胞，提取质粒并测序获得正确序列的克隆，测定序列为SEQ ID No.1。

3.AtARA6^Q93L过量表达载体在水稻中的遗传转化。

将1300-221-AtARA6^Q93L质粒转化农杆菌EHA105(用于水稻遗传转化)。水稻的遗传转化：将颗粒饱满无霉点的水稻粳稻品种日本晴成熟种子脱壳后用3％的次氯酸钠消毒30min，再用无菌水冲洗4～5次，加入无菌水浸泡2h，将种子放于灭菌滤纸上吸干表面水分后接种于愈伤组织诱导培养基；28℃(16h光照/8h黑暗)培养约28天，得到愈伤组织；将阳性EHA105农杆菌摇至OD₆₀₀＝0.6-0.8，5000rpm离心5min收集菌体，用含乙酰丁香酮(AS)的悬浮液重悬菌体，和愈伤组织在22℃黑暗条件下暗培养3d；用羧苄水清洗去除愈伤组织表面的农杆菌，无菌水洗4～5次，在灭菌滤纸上吸干表面水分；将愈伤组织转移到含有潮霉素的筛选培养基上，28℃培养15d，挑选抗性愈伤组织再转移到新的潮霉素培养基，继续培养15d；将生长状态良好的抗性愈伤组织转移到分化培养基中培养至分化出水稻幼苗，待幼苗长至2cm左右移栽到生根培养基。所得转基因水稻植株提取DNA后通过潮霉素基因引物鉴定阳性转基因植株。

7.过表达转基因水稻纯合株系的鉴定。

在收获转基因T₀代植株上的种子(T₁)后，按单株种植T₁代植株，并按单株收获T₂代种子。采用50mg/L的潮霉素水浸泡水稻种子的方式，根据种子发芽状况来确定纯合家系。转基因纯合家系的所有种子在潮霉素水中均能发芽。由此鉴定出了1300-221-AtARA6^Q93L过表达水稻的纯合家系，用于下一步的耐盐性分析。

8.转基因植株的基因表达验证。

使用植物总RNA提取试剂盒(北京天根公司)提取野生型和转基因植株总RNA。用NanoDrop 2000微量分光光度计(Thermo Scientific)，检测RNA的浓度及质量，电泳检测RNA的完整性。取2μg RNA作为模板，使用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit(Takara公司)，反转录合成第一链cDNA。使用SYBR premix Ex TaqTM(TaKaRa公司)试剂盒，在ABI PRISM 7900HT上扩增。程序为:95℃for 30s,40cycles of95℃for 5s,60℃for30s,and 95℃for 15s,60℃for 1min,95℃for 15s。待扩增反应结束后，使用7900HTReal-Time PCR仪(Applied Biosystems)自带的软件分析CT值，用OsActin基因的表达量作为内参，计算出目的基因的的相对表达量。结果表明，野生型水稻中检测不到AtARA6^Q93L的表达，而转基因水稻株系中检测到不同表达量的AtARA6^Q93L基因，表达量可达到内参基因OsActin的11.4-29.2％。(图1)。

9.转基因水稻植株的耐盐性鉴定。

将发芽后生长14天的水稻幼苗用含140mM NaCl的营养液处理10天，同时以普通营养液培养的水稻幼苗作为对照，每2天更换一次新营养液。处理结束后调查苗长、根长和和鲜重。结果表明，盐处理后过表达AtARA6^Q93L的水稻在苗长和根长上和野生型没有显著差异，而鲜重则达到野生型的1.3倍。(图2)。表明过表达AtARA6^Q93L也能在一定程度上提高水稻的耐盐性。

综上所述，本发明构建了由35S启动子驱动的组成型激活态小G蛋白AtARA6^Q93L基因的过表达载体，并将该载体导入单子叶植物水稻中，显著提高了水稻的耐盐性。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种组成型激活态小G蛋白及其在水稻耐盐方面的应用

<141> 2019-12-09

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 609

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgggatgtg cttcttctct tccagatagg aactctggaa ctttaagtgg tcttagcaat 60

tcagagaatg ctgttccagc tgatgccaaa aatctacgtg tgaagttagt tctattagga 120

gactctggtg ttggtaaaag ttgtattgtc cttcgatttg tacgtggtca gtttgacgct 180

acatctaagg taactgttgg agcctcgttc ttgtcccaaa ctatagcatt gcaagactct 240

accacagtga agtttgaaat atgggataca gcaggactgg agaggtattc tgctcttgca 300

ccactatact accgtggagc tggagttgct gttattgtgt atgatataac aagccctgaa 360

tcgttcaaga aagcacagta ttgggttaag gaactgcaaa agcatggaag cccagatatt 420

gttatggctc tggttggtaa caaagctgat ctacatgaaa aaagagaagt acctactgag 480

gatggaatgg agcttgcaga gaagaacggc atgttcttca ttgagacgtc agccaagaca 540

gccgataaca taaatcaact gtttgaggaa attggcaaga ggctacctcg tcctgctcct 600

tcgtcatga 609

<210> 2

<211> 202

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Gly Cys Ala Ser Ser Leu Pro Asp Arg Asn Ser Gly Thr Leu Ser

1 5 10 15

Gly Leu Ser Asn Ser Glu Asn Ala Val Pro Ala Asp Ala Lys Asn Leu

20 25 30

Arg Val Lys Leu Val Leu Leu Gly Asp Ser Gly Val Gly Lys Ser Cys

35 40 45

Ile Val Leu Arg Phe Val Arg Gly Gln Phe Asp Ala Thr Ser Lys Val

50 55 60

Thr Val Gly Ala Ser Phe Leu Ser Gln Thr Ile Ala Leu Gln Asp Ser

65 70 75 80

Thr Thr Val Lys Phe Glu Ile Trp Asp Thr Ala Gly Leu Glu Arg Tyr

85 90 95

Ser Ala Leu Ala Pro Leu Tyr Tyr Arg Gly Ala Gly Val Ala Val Ile

100 105 110

Val Tyr Asp Ile Thr Ser Pro Glu Ser Phe Lys Lys Ala Gln Tyr Trp

115 120 125

Val Lys Glu Leu Gln Lys His Gly Ser Pro Asp Ile Val Met Ala Leu

130 135 140

Val Gly Asn Lys Ala Asp Leu His Glu Lys Arg Glu Val Pro Thr Glu

145 150 155 160

Asp Gly Met Glu Leu Ala Glu Lys Asn Gly Met Phe Phe Ile Glu Thr

165 170 175

Ser Ala Lys Thr Ala Asp Asn Ile Asn Gln Leu Phe Glu Glu Ile Gly

180 185 190

Lys Arg Leu Pro Arg Pro Ala Pro Ser Ser

195 200

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggatgtg cttcttctct 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agcagaatac ctctccagtc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgggatacag caggactgga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcatgacgaa ggagcaggac 20

<210> 7

<211> 294

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgggatgtg cttcttctct tccagatagg aactctggaa ctttaagtgg tcttagcaat 60

tcagagaatg ctgttccagc tgatgccaaa aatctacgtg tgaagttagt tctattagga 120

gactctggtg ttggtaaaag ttgtattgtc cttcgatttg tacgtggtca gtttgacgct 180

acatctaagg taactgttgg agcctcgttc ttgtcccaaa ctatagcatt gcaagactct 240

accacagtga agtttgaaat atgggataca gcaggactgg agaggtattc tgct 294

<210> 8

<211> 348

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgggatacag caggactgga gaggtattct gctcttgcac cactatacta ccgtggagct 60

ggagttgctg ttattgtgta tgatataaca agccctgaat cgttcaagaa agcacagtat 120

tgggttaagg aactgcaaaa gcatggaagc ccagatattg ttatggctct ggttggtaac 180

aaagctgatc tacatgaaaa aagagaagta cctactgagg atggaatgga gcttgcagag 240

aagaacggca tgttcttcat tgagacgtca gccaagacag ccgataacat aaatcaactg 300

tttgaggaaa ttggcaagag gctacctcgt cctgctcctt cgtcatga 348

<210> 9

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cacgggggac tctagaatgg gatgtgcttc ttctct 36

<210> 10

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aggctacgta ggatcctcat gacgaaggag caggac 36