阅读说明：本技术 一种替莫瑞林的制备方法 (Preparation method of temeprelin ) 是由 曾德志 董华建 文永均 于 2019-10-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种替莫瑞林的制备方法,方法中采用了特殊的保护氨基酸片段：(E)-3-Hexenoicacid-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-OH,缩短了制备工艺周期,提高了规模化制备中产品的纯度和收率。(The invention provides a preparation method of tesamorelin, which adopts special protective amino acid fragments: (E) 3-Hexenolic acid-Tyr (tBu) -Ala-Asp (OtBu) -Ala-Ile-Phe-Thr (tBu) -Asn (Trt) -Ser (tBu) -Tyr (tBu) -Arg (Pbf) -Lys (Boc) -Val-Leu-OH, shortens the preparation process period and improves the purity and yield of products in large-scale preparation.)

一种替莫瑞林的制备方法

技术领域

本发明属于多肽药物制备方法技术领域，特别涉及替莫瑞林的制备方法。

背景技术

替莫瑞林是替莫瑞林是用于伴有脂肪代谢障碍的人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者中腹部脂肪过多的治疗新药替莫瑞林是GRF合成类似物。与内源性GRF作用相似，其在体外通过结合并激活GRF受体发挥作用。GRF是下丘脑调节多肽，可刺激脑垂体生长激素细胞合成和释放内源性生长激素(GH)。GH通过与靶细胞包括软骨细胞、成骨细胞、心肌细胞、肝细胞和脂肪细胞的特定受体相互作用而发挥药理作用。

健康成年人皮下注射替莫瑞林2mg后，绝对生物利用度小于4％。无脂肪代谢障碍的健康人和HIV感染患者皮下注射单剂量2mg后，药时曲线下面积(AUC)分别为(634.6±72.4)和(852.8±91.9)pg.h.mL^-1，血药峰浓度(C_max)分别为(2874.6±43.9)和(2822.3±48.9)pg.mL^-1，达峰时均为1.5h，表观分布容积分别为(9.4±3.1)和(10.5±6.1)L.kg^-1，连续应用14d后的平均消除半衰期(t_1/2)分别为26和38min。

替莫瑞林具有以下的结构：

(E)-3-Hexenoic acid-Tyr-Ala-Asp-Ala⁵-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser¹⁰-Tyr-Arg-Lys-Val-Leu¹⁵-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala²⁰-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln²⁵-Asp-Ile-Met-Ser-Arg³⁰-Gln-Gln-Gly-Glu-Ser³⁵-Asn-Gln-Glu-Arg-Gly⁴⁰-Ala-Arg-Ala-Arg-Leu⁴⁵-NH2

替莫瑞林的制备方法已有报道，本发明提供一种高效的替莫瑞林制备方法，提高了高产品的纯度和收率，以满足医药用途。

发明内容

本发明提供了一种新的高效制备方法，采用了特殊的保护氨基酸，缩短了制备工艺周期，提高了了规模化制备方法中产品纯度和收率。

本发明提供了一种替莫瑞林的制备方法，包括：采用氨基树脂为起始树脂，用固相多肽合成法制备，经过多肽固相合成法得到替莫瑞林树脂，替莫瑞林树脂再经酸解得到替莫瑞林粗品，最后替莫瑞林粗品纯化得到替莫瑞林纯品。

其中替莫瑞林多树脂的合成过程中除了使用其他常规的保护氨基酸，同时使用了以下特殊保护氨基酸片段：

(E)-3-Hexenoic acid-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-OH。

替莫瑞林肽树脂：

(E)-3-Hexenoic acid-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala⁵-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)¹⁰-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu¹⁵-Gly-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala²⁰-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)²⁵-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(Pbf)³⁰-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)³⁵-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly⁴⁰-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Arg(Pbf)-Leu⁴⁵-氨基树脂

上述替莫瑞林的制备方法中，所述的氨基树脂，其氨基取代值为0.3～1.0mmol/g树脂，优选的取代值为0.3～0.5mmol/g树脂。

上述替莫瑞林的制备方法中，所述氨基树脂为Rink MBHA树脂、Rink Amide树脂或Rink Amide AM树脂中的一种，优选为Rink Amide MBHA树脂。

上述替莫瑞林的制备方法中，所述的Fmoc-保护氨基酸或保护氨基酸片段的用量为所投料树脂总摩尔数的1.2～6倍；优选为2.5～3.5倍。

作为本发明优选的方案，上述替莫瑞林树脂经酸解同时脱去树脂及侧链保护基，得到替莫瑞林素线性肽粗品。

进一步地，所述替莫瑞林树脂酸解时采用的酸解剂为三氟醋酸(TFA)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水混合溶剂，混合溶剂的配比为：TFA的比列为80-95％(V/V)，EDT的比例为1～10％(V/V)，余量为水。优选的配比TFA为89-91％、EDT 4-6％、余量为水。最优的，配比为90％、EDT 5％、余量为水。

所述酸解剂用量为每克替莫瑞林树脂需要4～15ml酸解剂，优选的，每克替莫瑞林树脂需要9～11ml酸解剂。使用酸解剂裂解的时间为室温条件下1～5小时，优选的为2小时。

进一步的，替莫瑞林粗品经高效液相色谱纯化、冻干得到替莫瑞林纯品，具体方法为：

替莫瑞林粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.5至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得替莫瑞林纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到替莫瑞林醋酸水溶液，冷冻干燥，得替莫瑞林纯品。

本发明方法直接使用了以下特殊保护氨基酸：

(E)-3-Hexenoic acid-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu-OH。

缩短了生产周期，大幅度提高了粗品纯度，提高了产品收率，所得产品纯度大于99.0％，与已有技术相比，本发明工艺更具有广泛的实用价值和应用前景。

具体实施方式

本发明公开了一种合成替莫瑞林的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

在本发明具体实施方式中，申请文件中所用英文缩写对应的中文含义见表1。

表1

下面结合实施例，进一步阐述本发明。

实施例1 替莫瑞林肽树脂的合成

替莫瑞林肽树脂：

(E)-3-Hexenoic acid-Tyr(tBu)-Ala-Asp(OtBu)-Ala⁵-Ile-Phe-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Ser(tBu)¹⁰-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Val-Leu¹⁵-Gly-Gln(Trt)-Leu-Ser(tBu)-Ala²⁰-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Leu-Leu-Gln(Trt)²⁵-Asp(OtBu)-Ile-Met-Ser(tBu)-Arg(Pbf)³⁰-Gln(Trt)-Gln(Trt)-Gly-Glu(OtBu)-Ser(tBu)³⁵-Asn(Trt)-Gln(Trt)-Glu(OtBu)-Arg(Pbf)-Gly⁴⁰-Ala-Arg(Pbf)-Ala-Arg(Pbf)-Leu⁴⁵-氨基树脂

使用Rink Amide MBHA树脂为起始树脂，通过去Fmoc保护和偶联反应，依次与表2所示的保护氨基酸偶联，制得替莫瑞林肽树脂。本实施例使用的保护氨基酸相对应的保护氨基酸或片段如下所示：

表2

1、接入第1个保护氨基酸

取0.09mol第1个保护氨基酸和0.09mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.09mol DIC，搅拌下慢慢加入至保护氨基酸DMF溶液中，于室温环境中搅拌反应30分钟，得到活化后的保护氨基酸溶液，备用。

取0.03mol的Fmoc-Gly-树脂(取代值约0.5mmol/g)，采用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤得到去Fmoc的树脂。

将活化后的第1个保护氨基酸溶液加入到已去Fmoc的树脂中，偶联反应120～300分钟，过滤洗涤，得含1个保护氨基酸的树脂。

2、接入第2～45个保护氨基酸或片段

采用上述同样方法，依次接入上述对应的第2～45个保护氨基酸或片段，得替莫瑞林肽树脂。

实施例2 替莫瑞林粗品的制备

取实施例1制得的替莫瑞林肽树脂，加入体积比为TFA∶水∶EDT＝95∶5∶5的裂解试剂(裂解试剂10mL/克树脂)，搅拌均匀，室温搅拌反应3小时，反应混合物使用砂芯漏斗过滤，收集滤液，树脂再用少量TFA洗涤3次，合并滤液后减压浓缩，加入无水***沉淀，再用无水***洗沉淀3次，抽干得类白色粉末即为替莫瑞林粗品，粗品纯度为70.9％。

实施例3 替莫瑞林粗品的纯化

取实施例2制得的替莫瑞林粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.5至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤，纯化备用；

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，采用两种流动相系统交替纯化，第一种流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，第二种流动相系统为50mmol醋酸铵/水溶液-乙腈。77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，用0.45μm滤膜滤过，得替莫瑞林纯化中间体浓缩液；

采用高效液相色谱法进行换盐，流动相系统为1％醋酸/水溶液-乙腈，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，77mm*250mm的色谱柱流速为90mL/min(可根据不同规格的色谱柱，调整相应的流速)；采用梯度洗脱，循环上样方法，上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，采集图谱，观测吸收度的变化，收集换盐主峰并用分析液相检测纯度，合并换盐主峰溶液，减压浓缩，得到替莫瑞林醋酸水溶液，冷冻干燥，得替莫瑞林纯品32.9g，纯度为99.2％，最大单一杂质0.12％，总收率为27.4％，分子量为5135.8(100％M+H)。

上述实施例表明，本发明提供的方法所得产品纯度大于99.0％，单一杂质均小于0.15％，提高了产品质量，具有广泛的实用价值和应用前景。