阅读说明：本技术 一种生物质单细胞的分离方法 (Separation method of biomass single cells ) 是由 杨海滨 刘东杰 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种生物质单细胞的分离方法,包括以下步骤：(1)利用经125-155mM弱酸酸化的80-100mM亚氯酸钠处理生物质材料,离心,弃上清液；(2)加水洗涤步骤(1)获得的沉淀物至无弱酸酸化的亚氯酸钠的残留,离心,弃上清液；(3)利用0.05-0.2M碱溶液处理步骤(2)获得的沉淀物,离心,弃上清液,得生物质单细胞。上述分离方法反应条件温和,无需使用高浓度碱溶液,可高效地获得完整的单细胞,且经济环保,应用前景广阔。(The invention provides a separation method of biomass single cells, which comprises the following steps: (1) treating the biomass material with 80-100mM sodium chlorite acidified by 125-155mM weak acid, centrifuging, and discarding the supernatant; (2) adding water to wash the precipitate obtained in the step (1) until no weak acid acidified sodium chlorite remains, centrifuging, and discarding the supernatant; (3) and (3) treating the precipitate obtained in the step (2) by using 0.05-0.2M alkali solution, centrifuging, and removing supernatant to obtain the biomass single cell. The separation method has mild reaction conditions, does not need to use high-concentration alkali solution, can efficiently obtain complete single cells, and has the advantages of economy, environmental protection and wide application prospect.)

一种生物质单细胞的分离方法

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种生物质单细胞的分离方法。

背景技术

植物细胞间的连接主要依赖于细胞壁中胶层。对生物质来说，细胞壁中的纤维素、半纤维素以及木质素的相互作用决定细胞间的粘连程度。

为了提高生物质利用率，目前普遍采取的预处理技术主要是物理(如高温)结合化学(如酸碱溶液)处理，去除生物质细胞壁抗性因子，如半纤维素和木质素，从而打破细胞间和细胞内网络结构，提高物质转化效率。但是现有的预处理方式条件剧烈，会破坏细胞壁，无法实现细胞的完整分离，且技术不具有普适性。

目前没有生物质单细胞分离技术的报道。

发明内容

基于此，本发明提供一种生物质单细胞的分离方法，所述方法利用经弱酸酸化的亚氯酸钠和低浓度碱溶液处理生物质材料，可高效地获得完整的单细胞，适用于各种类型植物，且经济环保，应用前景广阔。

具体技术方案为：

一种生物质单细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)利用经125-155mM弱酸酸化的80-100mM亚氯酸钠处理生物质材料，离心，弃上清液；

(2)加水洗涤步骤(1)获得的沉淀物至无弱酸酸化的亚氯酸钠的残留，离心，弃上清液；

(3)利用0.05-0.2M碱溶液处理步骤(2)获得的沉淀物，离心，弃上清液，得生物质单细胞。

在其中一些实施例中，所述弱酸选自乙酸、硼酸、柠檬酸、草酸中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述弱酸的摩尔浓度为135-150mM，所述亚氯酸钠的摩尔浓度为80-90mM。

在其中一些实施例中，优选弱酸的摩尔浓度为140mM，亚氯酸钠的摩尔浓度为88mM。

在其中一些实施例中，所述碱溶液选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、氢氧化钙溶液中的一种或多种。

在其中一些实施例中，所述碱溶液的摩尔浓度为0.1-0.2M。

在其中一些实施例中，优选碱溶液的摩尔浓度为0.1M。

在其中一些实施例中，所述步骤(1)中利用弱酸酸化的亚氯酸钠处理生物质材料的条件为：70-80℃处理6-12h，优选处理期间每隔1h快速震荡搅拌1次。

在其中一些实施例中，所述步骤(1)中利用弱酸酸化的亚氯酸钠处理生物质材料的条件为：70℃处理12h，优选分2次处理，每次6h，处理期间每隔1h快速震荡搅拌1次。

在其中一些实施例中，所述步骤(3)利用碱溶液处理步骤(2)获得的沉淀物的条件为：20-30℃处理8-16h，优选处理期间每隔1h快速震荡搅拌1次。

在其中一些实施例中，所述步骤(3)利用碱溶液处理步骤(2)获得的沉淀物的条件为：25℃处理16h，优选分2次处理，每次8h，处理期间每隔1h快速震荡搅拌1次。

在其中一些实施例中，所述生物质材料与乙酸酸化的亚氯酸钠的料液比为1g:(40-60)mL；所述生物质材料与碱溶液的料液比为1g:(40-60)mL。

在其中一些实施例中，优选所述生物质材料与乙酸酸化的亚氯酸钠的料液比为1g：40mL；所述生物质材料与碱溶液的料液比为1g：40mL。

在其中一些实施例中，所述步骤(1)中利用弱酸酸化的亚氯酸钠处理生物质材料前还对生物质材料进行前处理，方法如下：取生物质材料，经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品。

在其中一些实施例中，所述离心的条件为12000g。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明创造性地利用经弱酸酸化的亚氯酸钠结合低浓度碱溶液来处理生物质材料，首次实现了从生物质材料中分离出完整的单细胞。此外，本发明方法分离出的细胞中，完整单细胞的比例可达90％以上，甚至最难分离的红松软木经本发明方法分离得到的单细胞比例也可接近80％，分离效率很高。本发明方法首先利用经弱酸酸化的亚氯酸钠处理生物质材料进行脱木素反应，进一步结合低浓度碱溶液处理，能有效脱除木质素和半纤维素，获得完整的生物质单细胞。发明人经过研究发现，当亚氯酸钠浓度为80-100mM，且碱溶液浓度为0.05-0.2M时，可保证分离得到的生物质单细胞的完整性，以及高的分离效率。

2、本发明分离方法制备条件温和，整个分离过程中不需要使用高浓度的酸碱溶液，避免造成环境污染，同时节约经济成本，适用于各种类型植物单细胞的分离，适应性好。

附图说明

图1为实施例1-5中分离得到的细胞中单细胞、2-5个细胞以及5个以上细胞的分布结果图。

图2为实施例2处理的红松软木与未处理样品的对比图。

图3为实施例2处理的红松软木与未处理样品用扫描电子显微镜在超高分辨率下观察获得的表面形态图。

图4为实施例2处理的红松软木与未处理样品经过物理震荡，用电子显微镜观察获得的样品形貌图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

实施例1

本实施例一种生物质单细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)首先杨木经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品，称取1g杨木样品，溶解到40mL经140mM乙酸酸化的88mM亚氯酸钠溶液中，在70℃下反应6h，反应期间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述乙酸酸化亚氯酸钠溶液，在上述条件下反应6h，离心去上清液；

(2)加入清水洗涤沉淀物，直至无亚氯酸钠残留，然后12000g离心除上清液；

(3)沉淀物中加入0.1M NaOH 40ml，在25℃下反应8h，其间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述NaOH溶液反应8h，离心后得到固体沉淀物，再经清水清洗去除残留NaOH溶液，12000g离心除上清液，得杨木单细胞。

实施例2

本实施例一种生物质单细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)首先红松软木经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品，称取1g红松软木样品，溶解到40mL经140mM乙酸酸化的88mM亚氯酸钠溶液中，在70℃下反应6h，反应期间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述乙酸酸化亚氯酸钠溶液，在上述条件下反应6h，离心去上清液；

(2)加入清水洗涤沉淀物，直至无亚氯酸钠残留，然后12000g离心除上清液；

(3)沉淀物中加入0.1M NaOH 40ml，在25℃下反应8h，其间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述NaOH溶液反应8h，离心后得到固体沉淀物，再经清水清洗去除残留NaOH溶液，12000g离心除上清液，得红松软木单细胞。

实施例3

本实施例一种生物质单细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)首先水稻杆经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品，称取1g水稻茎样品，溶解到40mL经140mM柠檬酸酸化的88mM亚氯酸钠溶液中，在70℃下反应6h，反应期间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述柠檬酸酸化亚氯酸钠溶液，在上述条件下反应6h，离心去上清液；

(2)加入清水洗涤沉淀物，直至无亚氯酸钠残留，然后12000g离心除上清液；

(3)沉淀物中加入0.08M NaOH 40ml，在25℃下反应8h，其间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述NaOH溶液反应8h，离心后得到固体沉淀物，再经清水清洗去除残留NaOH溶液，12000g离心除上清液，得水稻杆单细胞。

实施例4

本实施例一种生物质单细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)首先竹子经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品，称取1g竹子样品，溶解到40mL经140mM乙酸酸化的95mM亚氯酸钠溶液中，在70℃下反应6h，反应期间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述乙酸酸化亚氯酸钠溶液，在上述条件下反应6h，离心去上清液；

(2)加入清水洗涤沉淀物，直至无亚氯酸钠残留，然后12000g离心除上清液；

(3)沉淀物中加入0.1M KOH 40ml，在25℃下反应8h，其间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述KOH溶液反应8h，离心后得到固体沉淀物，再经清水清洗去除残留KOH溶液，12000g离心除上清液，得竹子单细胞。

实施例5

本实施例一种生物质单细胞的分离方法，包括以下步骤：

(1)首先竹子经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品，称取1g竹子样品，溶解到40mL经140mM草酸酸化的88mM亚氯酸钠溶液中，在70℃下反应6h，反应期间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述草酸酸化亚氯酸钠溶液，在上述条件下反应6h，离心去上清液；

(2)加入清水洗涤沉淀物，直至无亚氯酸钠残留，然后12000g离心除上清液；

(3)沉淀物中加入0.2M NaOH 40ml，在25℃下反应8h，其间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述NaOH溶液反应8h，离心后得到固体沉淀物，再经清水清洗去除残留NaOH溶液，12000g离心除上清液，得竹子单细胞。

对比例1

本对比例一种生物质单细胞的分离方法，除了亚氯酸钠不经过乙酸酸化外，其他均与实施例1相同，具体步骤如下：

(1)首先杨木经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品，称取1g杨木样品，溶解到40mL 88mM亚氯酸钠溶液中，在70℃下反应6h，反应期间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述亚氯酸钠溶液，在上述条件下反应6h，离心去上清液；

(2)加入清水洗涤沉淀物，直至无亚氯酸钠残留，然后12000g离心除上清液；

(3)沉淀物中加入0.1M NaOH 40ml，在25℃下反应8h，其间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述NaOH溶液反应8h，离心后得到固体沉淀物，再经清水清洗去除残留NaOH溶液，12000g离心除上清液，得杨木单细胞。

对比例2

本对比例一种生物质单细胞的分离方法，除了NaOH溶液的浓度为0.03mM外，其他均与实施例1相同，具体步骤如下：

(1)首先杨木经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品，称取1g杨木样品，溶解到40mL经140mM乙酸酸化的88mM亚氯酸钠溶液中，在70℃下反应6h，反应期间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述乙酸酸化亚氯酸钠溶液，在上述条件下反应6h，离心去上清液；

(2)加入清水洗涤沉淀物，直至无亚氯酸钠残留，然后12000g离心除上清液；

(3)沉淀物中加入0.03M NaOH 40ml，在25℃下反应8h，其间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述NaOH溶液反应8h，离心后得到固体沉淀物，再经清水清洗去除残留NaOH溶液，12000g离心除上清液，得杨木单细胞。

对比例3

本对比例一种生物质单细胞的分离方法，除了亚氯酸钠的浓度为110mM外，其他均与实施例1相同，具体步骤如下：

(1)首先杨木经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品，称取1g杨木样品，溶解到40mL经140mM乙酸酸化的110mM亚氯酸钠溶液中，在70℃下反应6h，反应期间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述乙酸酸化亚氯酸钠溶液，在上述条件下反应6h，离心去上清液；

(2)加入清水洗涤沉淀物，直至无亚氯酸钠残留，然后12000g离心除上清液；

(3)沉淀物中加入0.1M NaOH 40ml，在25℃下反应8h，其间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述NaOH溶液反应8h，离心后得到固体沉淀物，再经清水清洗去除残留NaOH溶液，12000g离心除上清液，得杨木单细胞。

对比例4

本对比例一种生物质单细胞的分离方法，除了NaOH溶液的浓度为0.3mM外，其他均与实施例1相同，具体步骤如下：

(1)首先杨木经干燥破碎过筛后获得300-450μm粒径大小的生物质样品，称取1g杨木样品，溶解到40mL经140mM乙酸酸化的88mM亚氯酸钠溶液中，在70℃下反应6h，反应期间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述乙酸酸化亚氯酸钠溶液，在上述条件下反应6h，离心去上清液；

(2)加入清水洗涤沉淀物，直至无亚氯酸钠残留，然后12000g离心除上清液；

(3)沉淀物中加入0.3M NaOH 40ml，在25℃下反应8h，其间每隔1h进行快速震荡搅拌，然后12000g离心除上清液，再次加入40ml上述NaOH溶液反应8h，离心后得到固体沉淀物，再经清水清洗去除残留NaOH溶液，12000g离心除上清液，得杨木单细胞。

利用显微镜对实施例1-5和对比例1-4中制备得到的细胞进行观察、计数和计算，得出单细胞、2-5个细胞(2-5个细胞连接在一起形成细胞团)以及5个以上细胞(5个以上的细胞连接在一起形成细胞团)的分布情况，结果如表1和图1所示：

表1细胞分布检测结果

由表1和图1可知，实施例1-5中的分离方法可高效地获得杨木、红松软木、水稻杆和竹子单细胞，且单细胞的分布比例高达95％以上(实施例3-5)，而最难实现单细胞分离的红松软木经过本发明方法制备得到的单细胞比例接近80％。此外，显微镜下观察显示本发明方法制备得到的单细胞仍然保持很好的完整性，说明本发明方法可高效地分离出完整的生物质单细胞。

红松软木作为最难分离的生物质材料，经过本发明方法处理后，可分离得到比例接近80％的完整单细胞。如图2所示，红松软木经实施例2方法处理后(图中标记为分离处理)，与未处理样品(图中标记为未处理)相比呈白色纤维状悬浮于水中；用扫描电子显微镜在超高分辨率下观察红松软木表面形态发现，与未处理样品(图中标记为未处理)相比，处理后(图中标记为分离处理)的红松细胞间的粘连作用减弱，细胞呈分离状态，但在静止状态下仍粘贴在一起维持组织形态的完整性(图3)；红松软木完整组织经实施例2方法处理后，再经过物理震荡，用电子显微镜下观察红松软木样品形貌，结果如图4所示，与未处理样品(图中标记为未处理)相比，处理后(图中标记为分离处理)的红松细胞彻底分离，呈现单细胞状态。

与实施例1相比，对比例1中直接使用不经弱酸酸化的亚氯酸钠来处理生物质材料，由表1可知，其制备得到的单细胞比例远远低于实施例1。

与实施例1相比，对比例2中使用0.03M NaOH溶液来处理生物质材料，导致单细胞的比例严重下降，基本不能实现单细胞的分离。

与实施例1相比，对比例3中使用经140mM乙酸酸化的110mM亚氯酸钠溶液来处理生物质材料，对比例4中使用0.3M NaOH溶液来处理生物质材料，由表1可知，两种情况均会导致细胞完整性受到损害，不能分离出完整的单细胞。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。