一种基于同步光源的x-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用

文档序号：1459363 发布日期：2020-02-21 浏览：10次 >En<

阅读说明：本技术 一种基于同步光源的x-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用 (X-ray multicolor genetic marker probe based on synchronous light source and preparation method and application thereof ) 是由樊春海诸颖孔华庭张继超闫庆龙王丽华胡钧于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用,包括：1)构建至少两种同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒,并将其同时转染进细胞；2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞；3)加入第一DAB-金属络合物,冰浴反应；4)去除反应液,加入封闭液；5)加入第二DAB-金属络合物,冰浴反应；6)若构建三种及三种以上融合表达质粒,则重复上述步骤4),5)；7)去除反应液,固定细胞；以及8)同步X射线成像观察,每种DAB-金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰,即得。根据本发明,提供了一种能同时对细胞内多种生物分子进行高特异性识别和高分辨率成像的方法,具有良好的生物医学应用前景。(The invention provides an X-ray multicolor genetic marking probe based on a synchronous light source, a preparation method and application thereof, comprising the following steps: 1) constructing at least two fusion expression plasmids simultaneously comprising enzyme and target protein, and simultaneously transfecting the fusion expression plasmids into cells; 2) fixing the cells using an ice bath of glutaraldehyde fixing solution; 3) adding a first DAB-metal complex, and carrying out ice-bath reaction; 4) removing the reaction solution, and adding a sealing solution; 5) adding a second DAB-metal complex, and carrying out ice-bath reaction; 6) if three or more than three fusion expression plasmids are constructed, repeating the steps 4) and 5); 7) removing the reaction solution and fixing the cells; and 8) synchronous X-ray imaging observation, wherein each DAB-metal polymer has a specific fluorescence peak under X-rays, and the DAB-metal polymer is obtained. According to the invention, the method capable of simultaneously carrying out high-specificity identification and high-resolution imaging on multiple biomolecules in the cell is provided, and the method has a good biomedical application prospect.)

一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用

技术领域

本发明涉及生物化学技术领域，更具体地涉及一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用。

背景技术

显微成像技术是细胞生命科学发展的主要推动力之一。细胞的每一项生理活动均是一个复杂的生物学过程，涉及多种蛋白分子之间的相互作用及其定位变化。这在客观上要求研究细胞成像的技术能够同时对多个生物分子发出的信号进行获取与成像，从而对生命过程做出完整的阐述。基于同步X射线的显微技术在细胞成像领域具有独特的优势。由于X射线的波长在0.1-10nm范围内，因此其天然就是一种超分辨显微成像技术，分辨率理论上能够达到数个纳米。另外，与电子束相比，X射线对生物样品的穿透力更强，因此不需要经过切片等处理就能对完整细胞进行成像。更重要的是，X射线显微成像技术对不同元素具有独特的X射线荧光特征谱且互不干扰。因此，结合X射线敏感的成像探针，能够实现同时对细胞内多种生物分子的高分辨识别和成像。

我们之前的专利中，发展了一种基于同步光源的X-射线遗传标记探针，应用于对细胞内特定生物分子进行识别并成像。但是，如何同时对多种感兴趣的生物分子进行标记仍是一大瓶颈。因此，现阶段开发同步X射线多色成像探针，实现同时对细胞内多种生物分子的精确识别和定位具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用，从而解决现有X射线显微技术还无法对细胞内多种生物分子同时进行识别和定位的问题。

为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

根据本发明的第一方面，提供一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：1)构建至少两种同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，并将所述至少两种融合表达质粒同时转染进细胞，所述细胞表达至少两种不同的融合蛋白；2)使用戊二醛固定液冰浴固定所述细胞；3)加入针对第一种融合蛋白的第一DAB-金属络合物，冰浴反应，使所述第一种融合蛋白催化第一DAB-金属络合物发生聚合；4)去除反应液，加入封闭液；5)加入针对第二种融合蛋白的第二DAB-金属络合物，冰浴反应，使所述第二种融合蛋白催化第二DAB-金属络合物发生聚合；6)若构建三种及三种以上同时包括酶和目的蛋白的融合表达质粒，则重复上述步骤4)，5)，直至所有融合蛋白催化相应的DAB-金属络合物发生聚合；7)去除反应液，使用固定液固定细胞；以及8)将所述细胞滴加在同步成像基底上，同步X射线成像观察，每种DAB-金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰，即得一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针。

根据本发明所提供的制备方法，其工作原理为：质粒在细胞内同时表达不同的酶与蛋白的融合蛋白，构建同时包括酶和目的蛋白的多种融合表达质粒，并将所述多种融合表达质粒同时转染进细胞，质粒在细胞内同时表达不同的酶与蛋白的融合蛋白，不同的酶反应体系可以先后催化不同的DAB-金属聚合，在细胞内生物分子处原位产生DAB-金属聚合物。使用同步X射线成像观察，每种DAB-金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰，从而实现对细胞内多种生物分子的特征识别和定位。

步骤1)中，所述酶包括：抗坏血酸过氧化物酶(APEX、APEX2)、迷你单线态氧产生蛋白(MiniSOG)、四半胱氨酸肽(tetracysteine)以及辣根过氧化物酶(HRP)等等。最优选为APEX2。其中，APEX、APEX2、MiniSOG、Tetracysteine适用于细胞内任意蛋白，HRP最适用于内质网相关蛋白。

应当理解的是，本发明为了达到多色成像目的，融合表达质粒至少需要两种。在本方法中，融合表达的种类取决于具有催化功能的酶的种类，目前，适用于本方法的酶主要有上述四种：抗坏血酸过氧化物酶、迷你单线态氧产生蛋白、四半胱氨酸肽以及辣根过氧化物酶，但是，理论上，本方法不限制融合表达质粒的种类，在未来越来越多的酶被发现和发展之后，本方法可以适用于更多的酶和目的蛋白的融合表达质粒。

步骤1)中所采用的转染试剂为Lipofectamine 3000Transfection Reagent、Lipofectamine 2000Transfection Reagent、Lipofectamine 2000CD TransfectionReagent、Lipofectamine LTX Reagent或jetPRIME Transfection Reagent。

其中的转染方法为常规方法，转染试剂和质粒的比例为3:1～1:1，最佳地为1.5:1。转染时间为12～48h，最佳地为24h。

所述细胞为常规传代或原代培养的细胞株，并在实际应用过程中根据细胞的种属来源在构建融合表达质粒时设计表达具有催化活性的酶和目的蛋白的DNA序列。优选地，可根据不同物种在密码子使用上的偏好性，对DNA序列进行设计与优化，使其在细胞中更好地表达。

步骤2)中所使用的固定液仅限戊二醛，因为戊二醛可以最大程度地保持酶的催化活性。所述戊二醛固定液的浓度为1.5～3％。其中较佳的为2％。固定时间为20～60min，最佳为40min。

步骤3)、5)中，所述DAB-金属络合物中的金属选自：Fe、Co、Ni、Cu、Zn、La、Sn、Cd组成的组中的任意一种，针对不同的融合蛋白选择不同种类的DAB-金属络合物。应当知晓的是，DAB-金属络合物和融合表达质粒无固定的一一对应关系，可以根据实际需要任意配对。

步骤3)、5)中，不同的酶反应体系的发生需要不同的反应条件：抗坏血酸过氧化物酶反应体系的发生需要H₂O₂；迷你单线态氧产生蛋白反应体系的发生需要持续的充O₂以及488nm光照；四半胱氨酸肽反应体系的发生需要加入ReAsH-EDT2，持续的充O₂以及585nm光照。

也就是说，针对不同的酶，底物分子反应液成分不同。例如，APEX和APEX2可以催化H₂O₂产生¹O₂，¹O₂可以进一步催化底物分子聚合，因此对于APEX和APEX2来说，底物分子反应液中必须含有双氧水。对于MiniSOG和Tetracysteine来说，双氧水则并非必需成分。

针对不同的酶，底物分子反应条件不同。例如，对于MiniSOG和Tetracysteine来说，需要荧光照射和O₂的持续供给。而对于APEX和APEX2来说，荧光照射和O₂并非必需成分。

步骤3)、5)中，冰浴反应时间为30s～2h。根据不同目的蛋白选择最优冰浴反应时间。

步骤4)中，所使用的封闭液为乙酰咪唑溶液或者乙酸酐溶液。浓度为1～100mM。

步骤7)中所使用的固定液可选地是多聚甲醛、戊二醛、乙醇、甲醇、冰醋酸、丙酮或***等等。其中，最优选地为多聚甲醛，特别是4％多聚甲醛固定液。多聚甲醛固定液使得细胞内的蛋白固定，保持其结构，利于进一步的脱水和观察。

应当理解，步骤2)中所使用的固定液仅限戊二醛，而步骤7)中所使用的固定液并不仅限戊二醛，还可以是其他种类的固定液，但是最优选地是多聚甲醛。

步骤7)中固定液的固定时间为10min～2h。较佳时间为15min。

步骤8)中，根据不同的金属离子选择不同的入射能量，适用于Fe的入射能量为280-1500eV和7112-15000eV、适用于Co的入射能量为280-1700eV和7709-16000eV、适用于Ni的入射能量为280-1900eV和8332-17000eV、适用于Cu的入射能量为280-2000eV和8979-18000eV、适用于Zn的入射能量为280-2100eV和9659-20000eV、适用于La的入射能量为280-2500eV、5483-12000eV和38925-78000eV、适用于Sn的入射能量为280-2000eV、3929-11000eV和29200-50000eV、适用于Cd的入射能量为280-1700eV、3538-11000eV和26711-50000eV。

选取的X射线入射能量范围内都能对相应的金属元素进行成像，但也有最优入射能量选择，以Co、Ni、Cu、Zn为例，入射能量选择为10000eV。

根据本发明的第二方面，提供一种根据上述制备方法制得的基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针。

根据本发明的第三方面，提供一种同步X射线多色遗传标记探针在细胞内生物分子识别和成像中的应用，包括：构建同时包括酶和目的蛋白的多种融合表达质粒，并将所述融合表达质粒同时转染进细胞，质粒在细胞内同时表达不同的酶与蛋白的融合蛋白，不同的酶反应体系可以先后催化不同的DAB-金属络合物聚合，在细胞内生物分子处原位产生DAB-金属聚合物，使用同步X射线成像观察，每种DAB-金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰，从而实现对细胞内多种生物分子的特征识别和定位。

根据本发明的一个优选方案，实现对细胞核和线粒体的标记，需要选择定位于细胞核和线粒体的蛋白和酶进行融合。例如，细胞核的标记可以选择的是NLS，一种定位于细胞核内的蛋白标签，线粒体可以选择的是COX8蛋白，一种定位于线粒体内的蛋白；通过将构建好的融合蛋白表达质粒转染进入细胞后，细胞会表达酶与目的蛋白的融合蛋白，并定位于目的蛋白处。相似地，只要设计定位于细胞内其他区域的蛋白与酶的融合蛋白，还可实现对细胞内其他区域进行标记。

本发明的积极进步效果在于：同步X射线显微成像技术和与之相适合的多种分子探针对于理解细胞生命过程具有十分重要的意义。但是，目前X射线显微技术多用于对细胞内单一生物靶标进行成像，和该技术相适合的特异性识别细胞内重要生物靶标的分子探针种类仍有限。本发明利用X射线显微成像技术对不同元素具有独特的X射线荧光特征谱且互不干扰的特点，向细胞内同时转染表达不同的酶与蛋白的融合蛋白的质粒，质粒在细胞内同时表达不同的酶与蛋白的融合蛋白。不同的酶反应体系可以先后催化不同的DAB-金属聚合，在细胞内生物分子处原位产生DAB-金属聚合物。使用同步X射线成像观察，每种DAB-金属聚合物在X射线下具有特异性的荧光峰，实现对细胞内多种生物分子的特征识别和定位。

总之，本发明提供了一种能同时对细胞内多种生物分子进行高特异性识别和高分辨率成像的方法，具有良好的生物医学应用前景。

附图说明

图1A是同步X射线双色遗传探针对细胞核与线粒体的标记成像图(白色区域，左为细胞核，右为线粒体)；

图1B是同步X射线双色遗传探针标记细胞核和线粒体区域的代表性X射线荧光谱；

图1C是图1A中左右两个图的叠加图(灰色部分指示细胞核，白色部分指示线粒体。灰色，白色均为伪色)；

图2A是同步X射线双色遗传探针对细胞微丝与线粒体的标记成像图(白色区域，左为细胞微丝，右为线粒体)；

图2B是同步X射线双色遗传探针标记细胞微丝和线粒体区域的代表性X射线荧光谱；

图2C是图2A中左右两个图的叠加图(灰色部分指示细胞微丝，白色部分指示线粒体，灰色，白色均为伪色)；

图3A从上至下依次是三种同步X射线双色遗传探针对细胞核与线粒体的标记成像图；

图3B为相应的双色探针组合标记后细胞核和线粒体区域的代表性X射线荧光谱；

图3C为图3A中每一组左和右的叠加图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明选择人HeLa细胞，双色遗传标记体系，催化活性的酶以APEX2+MiniSOG为主，生物靶标选择细胞核+线粒体蛋白为代表，底物分子选择DAB-Co和DAB-Ni为代表，构建X-射线多色遗传标记探针并应用于该细胞的成像研究，以下实施例具体说明本发明的实施效果。

实施例1同步X射线双色遗传标记探针的制备及在细胞核+线粒体双色成像中的应用。

pcDNA3-NLS-APEX2质粒的构建。该质粒的构建过程采用常规分子生物学手段进行，具体如下：首先，根据人源的NLS-APEX2蛋白序列，使用人源偏性的密码子优化了其DNA序列并合成全序列，全序列由上海权阳生物科技有限公司合成。然后将NLS-APEX2序列克隆进入pcDNA3哺乳动物表达载体骨架中，从而构建出pcDNA3-NLS-APEX2质粒。测序并验证质粒序列，该质粒序列如SEQ ID NO:1所示。其中，pcDNA3是一种商业化的哺乳动物表达载体骨架(购自Invitrogen^TM)。将NLS-APEX2融合蛋白的序列克隆进入pcDNA3载体后，会驱动NLS-APEX2融合蛋白的表达。在实际应用过程中根据细胞的种属来源在构建融合表达质粒时设计相应的DNA序列。

pEGFP-mito-MiniSOG质粒(Addgene plasmid#57773)购自Addgene。该质粒序列如SEQ ID NO:2所示。

HeLa细胞的培养。其中，HeLa细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。采用MEM(含10％FBS)培养基，37℃，5％CO₂，饱和湿度培养。将氮化硅窗置于细胞培养板中，紫外灭菌，7×10⁴细胞/孔的密度接种，贴壁过夜。

质粒的转染。将pcDNA3-NLS-APEX2和pEGFP-mito-MiniSOG质粒同时转染进入HEK293T细胞(购自HEK293T细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)。使用脂质体Lipo3000法进行转染，每孔加入1.5μL Lipo3000，500ng pcDNA3-NLS-APEX2质粒，500ngpEGFP-mito-MiniSOG质粒和2μL P3000。24h后去除培养基，2％戊二醛冰浴固定。

加入含有0.03％H₂O₂的3,3'-二氨基联苯胺(DAB-Ni)反应液，冰浴反应20min，去除孔内反应液。加入10mM的乙酸酐溶液进行封闭，处理10min后，去除孔内反应液。

加入DAB-Co反应液，向反应液中缓慢通入氧气。使用150W，488nm激光照射感兴趣的区域20min。去除孔内反应液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水，同步X射线成像观察。

在上海光源BL15U1硬X射线微聚焦线站，入射光能量选取10keV，光斑尺寸选取为400nm，单点采集时间为2s，对同步X射线多色遗传探针标记细胞进行X射线荧光成像。另外，在同步X射线多色遗传探针标记细胞样品中细胞核和线粒体区域，分别采集30s的X射线荧光谱图。

结论：标记结束后，可在同步辐射X射线显微镜下清楚地观察到细胞核和线粒体的定位分布(图1A，左为细胞核，右为线粒体)。细胞核和线粒体区域的代表性X射线荧光谱结果显示，细胞核区域标记有明显的Ni信号(图1B左)，线粒体区域有明显的Co信号(图1B右)。图1C为图1A中左右两个图的叠加图，其中灰色部分指示细胞核，白色部分指示线粒体。

实施例2同步X射线双色遗传标记探针的制备及在微丝+线粒体双色成像中的应用。

pEGFP-mito-MiniSOG质粒来源同实施例1。pEGFP-APEX2-Actin质粒(Addgeneplasmid#66172)，序列如SEQ ID NO:3所示。HeLa细胞的来源和培养方法同实施例1。

将pEGFP-APEX2-Actin和pEGFP-mito-MiniSOG质粒同时转染进入HeLa细胞。使用脂质体Lipo3000法进行转染，每孔加入1.5μL Lipo3000，500ng pEGFP-APEX2-Actin质粒，500ng pEGFP-mito-MiniSOG质粒和2μL P3000。24h后去除培养基，2％戊二醛冰浴固定。加入含有0.03％H₂O₂的3,3'-二氨基联苯胺(DAB-Ni)反应液，冰浴反应20min，去除孔内反应液。加入10mM的乙酸酐溶液进行封闭，处理10min后，去除孔内反应液。

加入DAB-Co反应液及后续处理步骤同时实施例1。标记后，同步X射线成像观察步骤和X射线荧光谱图采集方法均与实施例1相同。

结论：标记结束后，可在同步辐射X射线显微镜下清楚地观察到细胞微丝和线粒体的定位分布(图2A，左为细胞微丝，右为线粒体)。细胞核和线粒体区域的代表性X射线荧光谱结果显示，细胞微丝区域标记有明显的Ni信号(图2B左)，线粒体区域有明显的Co信号(图2B右)。图2C为图2A中左右两个图的叠加图，其中灰色部分指示细胞微丝，白色部分指示线粒体。

实施例3基于APEX2、MiniSOG、Tetracysteine的同步X射线双色遗传标记探针在细胞双色成像中的应用比较。

pcDNA3-NLS-APEX2质粒的构建方法同实施例1。pEGFP-mito-MiniSOG质粒来源同实施例1。分别构建pcDNA3-mito-Tetracysteine和pcDNA3-NLS-MiniSOG质粒。首先，根据人源的mito-Tetracysteine和NLS-MiniSOG蛋白序列，使用人源偏性的密码子优化了其DNA序列并合成全序列，全序列由上海权阳生物科技有限公司合成。然后将mito-Tetracysteine和NLS-MiniSOG序列克隆进入pcDNA3哺乳动物表达载体骨架中，从而分别构建出pcDNA3-mito-Tetracysteine和pcDNA3-NLS-MiniSOG质粒，测序并验证质粒序列，其质粒序列分别如SEQ ID NO:4所示和SEQ ID NO:5所示。分别将pcDNA3-NLS-APEX2和pEGFP-mito-MiniSOG质粒,pcDNA3-NLS-APEX2和pcDNA3-mito-Tetracysteine质粒以及pcDNA3-mito-Tetracysteine质粒和pcDNA3-NLS-MiniSOG质粒转染进入HeLa细胞。其中，HeLa细胞培养以及各质粒的转染方法和实施例1相同。

基于APEX2+MiniSOG的X射线双色遗传标记方法同实施例1。

基于APEX2+Tetracysteine的X射线双色遗传标记方法为：转染结束后，2％戊二醛冰浴固定。加入含有0.03％H₂O₂的DAB-Ni反应液，冰浴反应20min，去除孔内反应液。加入10mM的乙酸酐溶液进行封闭，处理10min后，去除孔内反应液。加入ReAsH-EDT₂后，加入DAB-Co反应液，向反应液中缓慢通入氧气。使用150W，585nm激光照射感兴趣的区域10min。去除孔内反应液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水。

基于MiniSOG+Tetracysteine的X射线双色遗传标记方法为：转染结束后，2％戊二醛冰浴固定。加入含有0.03％H₂O₂的DAB-Ni反应液，向反应液中缓慢通入氧气。使用150W，488nm激光照射感兴趣的区域20min。去除孔内反应液，加入10mM的乙酸酐溶液进行封闭，处理10min后，去除孔内反应液。加入ReAsH-EDT₂后，加入DAB-Co反应液，向反应液中缓慢通入氧气。使用150W，585nm激光照射感兴趣的区域10min。去除孔内反应液，4％多聚甲醛固定。梯度乙醇脱水。

上述三种双色探针组合标记后，同步X射线成像观察步骤与X射线荧光谱图采集方法均与实施例1相同。

结论：结果见图3A、3B、3C。以细胞核+线粒体为例，标记结束后，可在同步辐射X射线显微镜下观察到三种同步双色X射线遗传标记探针组合标记的细胞核+线粒体的定位分布，图中可见，基于APEX2+MiniSOG的同步X射线双色遗传标记探针在细胞成像中的应用效果明显优于其他两种。

以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院上海高等研究院

<120> 一种基于同步光源的X-射线多色遗传标记探针及其制备方法以及应用

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6276

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg 60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg 120

cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc 180

ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt 240

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gatgtgtttg ggaaagctat gggcctgact gaccaggata tcgtcgcact gtctggaggg 1500

cacaccattg gcgccgctca taaggaaagg tcaggcttcg agggaccctg gacaagcaac 1560

cccctgattt tcgacaattc ttactttact gaactgctga gtggagagaa ggaagggctg 1620

ctgcagctgc ccagcgacaa agccctgctg tccgatcccg tgttcagacc tctggtcgat 1680

aagtatgcag ccgacgagga tgcttttttc gcagattacg cagaagcaca tcagaagctg 1740

tcagaactgg gatttgccga cgcctaagaa ttctgcagat atccatcaca ctggcggccg 1800

ctcgagcatg catctagagg gccctattct atagtgtcac ctaaatgcta gagctcgctg 1860

atcagcctcg actgtgcctt ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc 1920

ttccttgacc ctggaaggtg ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc 1980

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gggggaggat tgggaagaca atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc 2100

tgaggcggaa agaaccagct ggggctctag ggggtatccc cacgcgccct gtagcggcgc 2160

attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg ccagcgccct 2220

agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg gctttccccg 2280

tcaagctcta aatcggggca tccctttagg gttccgattt agtgctttac ggcacctcga 2340

ccccaaaaaa cttgattagg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct gatagacggt 2400

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aacaacactc aaccctatct cggtctattc ttttgattta taagggattt tggggatttc 2520

ggcctattgg ttaaaaaatg agctgattta acaaaaattt aacgcgaatt aattctgtgg 2580

aatgtgtgtc agttagggtg tggaaagtcc ccaggctccc caggcaggca gaagtatgca 2640

aagcatgcat ctcaattagt cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 2700

cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc 2760

gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat 2820

tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc ctctgcctct gagctattcc agaagtagtg 2880

aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg caaaaagctc ccgggagctt gtatatccat 2940

tttcggatct gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac aagatggatt 3000

gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact gggcacaaca 3060

gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct 3120

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<210> 2

<211> 4359

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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cttctatgaa aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca 3180

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ccacccccca agttcgggtg aaggcccagg gctcgcagcc aacgtcgggg cggcaggccc 3480

tgccatagcc tcaggttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 3540

taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 3600

gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 3660

tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 3720

ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 3780

gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 3840

tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 3900

cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 3960

gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 4020

actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 4080

ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 4140

gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 4200

atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 4260

tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc 4320

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<210> 3

<211> 5907

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg ccatgcatta 60

gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg 120

ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga 180

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ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatccgc tagcgctacc 660

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cgcagactac caggatgccg tggagaaagc caagaagaag ctgagagggt ttatcgcaga 780

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gggaaccaaa acaggcggac cctttggaac aatcaagcac cctgctgaac tggcacatag 900

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cacggccgag cgggaaatcg tgcgtgacat taaggagaag ctgtgctacg tcgccctgga 2160

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gcctgacggc caggtcatca ccattggcaa tgagcggttc cgctgccctg aggcactctt 2280

ccagccttcc ttcctgggca tggagtcctg tggcatccac gaaactacct tcaactccat 2340

catgaagtgt gacgtggaca tccgcaaaga cctgtacgcc aacacagtgc tgtctggcgg 2400

caccaccatg taccctggca ttgccgacag gatgcagaag gagatcactg ccctggcacc 2460

cagcacaatg aagatcaaga tcattgctcc tcctgagcgc aagtactccg tgtggatcgg 2520

cggctccatc ctggcctcgc tgtccacctt ccagcagatg tggatcagca agcaggagta 2580

tgacgagtcc ggcccctcca tcgtccaccg caaatgcttc tagggatcca ccggatctag 2640

ataactgatc ataatcagcc ataccacatt tgtagaggtt ttacttgctt taaaaaacct 2700

cccacacctc cccctgaacc tgaaacataa aatgaatgca attgttgttg ttaacttgtt 2760

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tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga 3420

gacaataacc ctgataaatg cttcaataat attgaaaaag gaagagtcct gaggcggaaa 3480

gaaccagctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg 3540

cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg 3600

ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc 3660

gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca 3720

tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt 3780

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ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt 4020

ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg 4080

gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg tcactgaagc gggaagggac tggctgctat 4140

tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat 4200

ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc atacgcttga tccggctacc tgcccattcg 4260

accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg 4320

atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc 4380

tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc 4440

cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg 4500

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cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg agatttcgat tccaccgccg ccttctatga 4740

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accgagaccc cattggggcc aatacgcccg cgtttcttcc ttttccccac cccacccccc 5040

aagttcgggt gaaggcccag ggctcgcagc caacgtcggg gcggcaggcc ctgccatagc 5100

ctcaggttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat 5160

ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt 5220

ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct 5280

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ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc 5400

aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc 5460

gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc 5520

gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg 5580

aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata 5640

cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta 5700

tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc 5760

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cctggccttt tgctggcctt ttgctca 5907

<210> 4

<211> 5531

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4