阅读说明：本技术 一种淀粉转化制备昆布二糖的方法 (Method for preparing laminaribiose by starch conversion ) 是由 游淳 孙尚尚 于 2018-08-08 设计创作，主要内容包括：本发明公布了一种构建体外多酶分子机器,通过多酶级联催化来制备昆布二糖的方法,属于昆布二糖的酶催化制备领域。本发明所公开的昆布二糖的制备方法包括将淀粉中的葡萄糖单元分别通过淀粉磷酸化酶和葡萄糖苷酶转化生成葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖,然后葡萄糖-1-磷酸与葡萄糖通过昆布二糖磷酸化酶合成昆布二糖。过程中通过添加促使淀粉完全磷解的其他辅助酶,例如异淀粉酶,可以进一步提高淀粉的利用率以及昆布二糖的最终浓度。该技术方法具有底物廉价易得,生产成本低,产品得率高,分离纯化简单等优势,可实现昆布二糖的规模化生产。(The invention discloses a method for preparing laminaribiose by constructing an in-vitro multienzyme molecular machine and through multienzyme cascade catalysis, belonging to the field of enzymatic preparation of laminaribiose. The preparation method of the laminaribiose disclosed by the invention comprises the steps of converting glucose units in starch into glucose-1-phosphate and glucose by starch phosphorylase and glucosidase respectively, and then synthesizing the laminaribiose by the laminaribiose phosphorylase through the glucose-1-phosphate and the glucose. The utilization of starch and the final concentration of laminaribiose can be further improved by adding other auxiliary enzymes, such as isoamylase, which promote complete starch phospholysis during the process. The method has the advantages of cheap and easily available substrate, low production cost, high product yield, simple separation and purification, and the like, and can realize the large-scale production of laminaribiose.)

一种淀粉转化制备昆布二糖的方法

技术领域

本发明属于生物制造领域，具体涉及一种以淀粉为原料，通过酶法制备昆布二糖的方法。

背景技术

昆布二糖是一种由β-1,3糖苷键连接的低聚糖，主要用于农业领域，可用于促进种子发芽，也可作为天然防腐剂使用。

目前，昆布二糖的生产主要还是传统的稀酸水解松针或者昆布等多糖。该工艺过程产率低、分离提取成本高，导致昆布二糖的价格居高不下。昆布二糖还能利用化学法进行制备，即以卤素糖基作为糖基供体，通过来源于Koenigs-Knorr方法的O糖基化获得昆布二糖。然而终产品不容易纯化，最终得率低于10％。

随着工业酶生物技术的发展，有科学家开始尝试酶法合成昆布二糖。日本科学家就利用3个酶(蔗糖磷酸化酶，葡萄糖异构酶和昆布二糖磷酸化酶)，以蔗糖为底物生产昆布二糖，然而昆布二糖的得率只有50％左右，导致后续产品分离的成本较高。

因此，亟待开发一种低成本，低污染，高得率的昆布二糖酶制备方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种制备昆布二糖的方法，其以淀粉为底物，通过体外多酶催化反应催化生产昆布二糖，该方法具有产率高，生产成本低，环境友好等优点。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明提供了一种利用酶催化反应制备昆布二糖的方法，其特征在于，以淀粉为底物，加入淀粉磷酸化酶(α-glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1，αGP)、葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20，AG)和昆布二糖磷酸化酶(laminaribiose phosphorylase，EC2.4.1.31，LBP)，进行多酶催化反应。在本发明中，淀粉为底物，淀粉经淀粉磷酸化酶和葡萄糖苷酶催化分别转化为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖，葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖经昆布二糖磷酸化酶催化生成昆布二糖。

优选地，淀粉为可溶性淀粉、可溶性直链淀粉、可溶性支链淀粉、淀粉糊精、麦芽糊精、麦芽多糖和麦芽糖中的任意一种或多种的任意比例的混合物。

优选地，多酶催化反应中淀粉的浓度为1-200g/L，进一步优选为5-50g/L，更优选为8-20g/L，最优选为10g/L。

优选地，多酶催化反应的反应温度为10-95℃，进一步优选为20-80℃，更优选为30-60℃，最优选为50℃。

优选地，多酶催化反应的反应时间为0.5-150小时，进一步优选为1-60小时，更优选为6-48小时，最优选为12小时。

优选地，多酶催化反应中还加入缓冲液、磷酸盐、金属离子。

本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如HEPES缓冲液、Tris-HCl缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸盐缓冲液例如柠檬酸钠缓冲液等，优选地，缓冲液为HEPES缓冲液。优选地，缓冲液的pH为5.0-8.0，更优选为6.0-7.5，最优选为6.5。优选地，反应体系中缓冲液的浓度为10-500mM，进一步优选为20-150mM，更优选为50-120mM，最优选为100mM。

本领域技术人员可以理解，各种磷酸盐均可用于本发明，例如磷酸钾、磷酸钠等，优选地，磷酸盐为磷酸钾。优选地，反应体系中磷酸盐的浓度为1-50mM，进一步优选为2-30mM，更优选为5-15mM，最优选为20mM。

本领域技术人员可以理解，各种金属离子均可用于本发明，例如锌离子、镁离子、锰离子等，优选地，金属离子为锌离子。优选地，反应体系中锌离子的浓度为1-20mM，进一步优选为2-15mM，更优选为3-10mM，最优选为5mM。

在优选的实施方案中，以经异淀粉酶(isoamylase,EC 3.2.1.68，IA)处理后的淀粉作为底物，加入淀粉磷酸化酶(α-glucan phosphorylase，EC 2.4.1.1，αGP)、葡萄糖苷酶(α-glucosidase，EC 3.2.1.20，AG)和昆布二糖磷酸化酶(laminaribiose phosphorylase，EC 2.4.1.31，LBP)进行多酶催化反应。

优选地，异淀粉酶处理的条件为在10-99℃反应0.5-72小时，进一步优选在30-95℃反应1-48小时，更优选在50-90℃反应1-12小时，最优选在85℃反应3小时。

优选地，用异淀粉酶处理淀粉时，淀粉的浓度为1-500g/L，进一步优选为10-300g/L，更优选为50-250g/L，最优选为200g/L；异淀粉酶的用量为0.1-20U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-8U/mL，最优选为5U/mL。

优选地，异淀粉酶在含有缓冲液、金属离子的体系中处理淀粉。

本领域技术人员可以理解，各种缓冲液均可用于本发明，例如乙酸钠缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液例如柠檬酸钠缓冲液等，优选地，缓冲液为乙酸钠缓冲液。优选地，缓冲液的pH为4.0-8.0，更优选为4.5-6.5，最优选为5.5。优选地，反应体系中缓冲液的浓度为1-50mM，进一步优选为2-20mM，更优选为3-10mM，最优选为5mM。

本领域技术人员可以理解，各种金属离子均可用于本发明，例如锌离子、镁离子、锰离子等，优选地，金属离子为锌例子。优选地，反应体系中锌离子的浓度为0.01-10mM，进一步优选为0.1-5mM，更优选为0.2-1mM，最优选为0.5mM。

在本发明中，多酶催化反应中加入的淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和昆布二糖磷酸化酶可以为任意比例。

优选地，加入淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和昆布二糖磷酸化酶的比例为1～3:1:1～3。

进一步优选地，加入淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和昆布二糖磷酸化酶的比例为2:1:3。

优选地，多酶催化反应中淀粉磷酸化酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL，最优选为2U/mL。

优选地，多酶催化反应中葡萄糖苷酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL，最优选为1U/mL。

优选地，多酶催化反应中昆布二糖磷酸化酶的用量为0.1-50U/mL，进一步优选为0.5-10U/mL，更优选为1-5U/mL，最优选为3U/mL。

在本发明中，可以使用各种来源的淀粉磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶、异淀粉酶和葡萄糖苷酶。例如，淀粉磷酸化酶可以来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)、热纤维梭菌(Clostridium thermocellum)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)等，优选地，淀粉磷酸化酶来源于海栖热袍菌；昆布二糖磷酸化酶可以来源于类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)、小眼虫(Euglena Gracilis)、无胆甾原体(Acholeplasma laidlawii)等，优选地，昆布二糖磷酸化酶来源于类芽孢杆菌；异淀粉酶可以来源于硫化叶菌(Sulfolobustokodaii)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、黄杆菌(Flavobacterium sp.)等，优选地，异淀粉酶来源于硫化叶菌；葡萄糖苷酶可以来源于黑曲霉(Aspergillus niger)、甜菜(Betavulgaris)、淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)等，优选地，葡萄糖苷酶来源于淡紫色拟青霉。本发明还可以使用氨基酸序列与上述来源的各种酶具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性的淀粉磷酸化酶、昆布二糖磷酸化酶、异淀粉酶和葡萄糖苷酶。

本发明以淀粉为底物，加入淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和昆布二糖磷酸化酶，配制三酶反应体系，酶催化途径包括：由淀粉磷酸化酶和葡萄糖苷酶分别将淀粉中的葡萄糖单元转化为葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖；由昆布二糖磷酸化酶将葡萄糖和葡萄糖-1-磷酸转化为昆布二糖。

由于淀粉是一种由不同链长的直链淀粉和支链淀粉组成的混合物。直链淀粉葡萄糖单元之间以α-1,4糖苷键相连，而支链淀粉通过α-1,6糖苷键与淀粉主链相连，而淀粉磷酸化酶并不能分解α-1,6糖苷键，为了提高葡萄糖-1-磷酸的得率，在反应体系中加入能够分解淀粉中α-1,6糖苷键的脱支酶-异淀粉酶，从而提高淀粉利用率。

由于无机磷在反应过程中是循环的，所以只需要添加少量磷酸盐缓冲液就可以启动反应，并使反应持续发生，故而在实际生产中，磷酸盐的使用并不会造成环境压力。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明在一个多酶催化反应中，以淀粉为原料，通过体外多酶催化转化为昆布二糖，并通过过程优化，添加能促进淀粉水解的酶，使转化效率显著提高，高得率又大大降低昆布二糖的分离成本。本发明方法具有简便，原料利用率高、昆布二糖得率高，分离成本低，环境友好等优点，可以实现昆布二糖的规模化生产。

附图说明

图1为淀粉转化生成昆布二糖的体外多酶催化途径的示意图；其中：IA为异淀粉酶，αGP为淀粉磷酸化酶，AG为葡萄糖苷酶，LBP为昆布二糖磷酸化酶。

图2为SDS-PAGE检测4个关键酶；其中：M为Marker，IA和αGP通过热处理纯化，AG和LBP通过Ni-NTA柱纯化。

图3为初始条件下体外多酶催化10g/L淀粉合成昆布二糖情况，其中，图3A为初始条件下体外多酶催化淀粉合成昆布二糖的反应进程曲线；图3B为初始条件下体外多酶催化淀粉合成昆布二糖的高效液相色谱分析结果。

图4为初始条件下体外多酶催化10g/L IA处理过的淀粉合成昆布二糖情况。

图5为最优条件下体外多酶催化10g/L IA处理过的淀粉合成昆布二糖的反应进程曲线。

图6为最优条件下体外多酶催化高浓度IA处理过的淀粉合成昆布二糖的反应进程曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

本发明实施例中用到如下材料

可溶性淀粉，ACROS公司产品，产品编号：424490020；

pET20b载体，Novagen，Madison，WI；

大肠杆菌表达菌BL21(DE3)，Invitrogen，Carlsbad，CA；

本发明中的所有酶均能在Sigma公司购买得到，所有酶也都可以按照基因工程方法通过原核表达获得。

实施例1体外多酶催化将淀粉转化为昆布二糖

通过体外多酶催化体系将淀粉转化为昆布二糖的催化途径见图1。其中涉及的关键酶与关键步骤包括：(1)淀粉磷酸化酶(αGP，EC 2.4.1.1)，用于从淀粉上释放出葡萄糖-1-磷酸；(2)葡萄糖苷酶(AG，EC 3.2.1.20)，用于从淀粉上释放出葡萄糖；(3)昆布二糖磷酸化酶(LBP，EC 2.4.1.31)，用于催化葡萄糖-1-磷酸和葡萄糖生成昆布二糖。

在本实施例中，淀粉磷酸化酶来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)，其基因在KEGG上的编号为TM1168；葡萄糖苷酶来源于淡紫色拟青霉(Paecilomyces lilacinus)，其基因在KEGG上的编号为QAQ81244；昆布二糖磷酸化酶来源于类芽孢杆菌(Paenibacillussp.)，其基因在KEGG上的编号为BAJ10826。这些基因组DNA都可从ATCC的官方网站(www.atcc.org)上获得。这两个基因分别用F1/R1、F2/R2和F3/R3从相应的基因组DNA中通过PCR获取，其中，F1：GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAGTGCTGGAGAAACTTCCCGA G，R1：GTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTCAGAGAACCTTCTTCCAGAC，F2:CATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCTTGAAAAAAACATGGTGGAAAGAAG，R2:GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTCTTTCCAGATGTAT ACGCG CGCC，F3：GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGTCAGAAAGGCTG GAAATTTC，R3：CAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGACTAATATTACG GCCCAGGGTCAC，并通过Simple Cloning(YouC,Zhang XZ,Zhang Y-HP.2012.Simple cloning via direct transformation of PCRproduct(DNA Multimer)to Escherichia coli and Bacillussubtilis.Appl.Environ.Microbiol.78(5):1593-5.)的方法克隆至pET20b载体(Novagen,Madison,WI)中，获得相应的表达载体pET20b-TmαGP，pET20b-PlAG和pET20b-PsLBP。然后，将这两个质粒分别转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。

随后反应体系中含有100mM HEPES缓冲液(pH 6.5)，5mM的二价锌离子，20mM的磷酸钾(pH 6.5)，1U/mL淀粉磷酸化酶，1U/mL葡萄糖苷酶，2U/mL昆布二糖磷酸化酶，10g/L淀粉，在50℃进行催化反应，反应时间为12个小时。

高效液相色谱检测昆布二糖的浓度。取反应样品94.5μL，加入5.5μL 10％的硫酸终止反应。离心取上清，采用HPLC检测昆布二糖出峰面积和峰高计算昆布二糖的浓度。

液相结果如图3B所示，昆布二糖响应强度逐渐增加。经标准曲线斜率计算，昆布二糖的终浓度(图3A)是12.1mM，相对淀粉(10g/L，约55.5mM葡萄糖当量，2分子葡萄糖当量合成1分子昆布二糖)转化率为43.6％。

实施例2通过添加促进淀粉水解的酶，提高昆布二糖的得率

淀粉磷酸化酶不能完全水解淀粉，如图1所示，异淀粉酶可辅助水解淀粉，即在反应体系中增加能够帮助淀粉水解的异淀粉酶(IA，EC 3.2.1.68)能够提高昆布二糖的得率。

在本实施例中，异淀粉酶来源于硫化叶菌(Sulfolobus tokodaii)，其基因在KEGG上的编号为ST0928，该菌株的基因组DNA是从德国菌种保藏中心DSMZ上购买得到。这个基因用引物F4/R4从相应的基因组DNA中通过PCR获取，其中，F3：GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATAATGGTTTTTTCACACAAGGATAGACC，R：GTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGCTAATATTCAATCCTCCTATATACC，并通过Simple Cloning的方法克隆至pET20b载体中，获得相应的表达载体pET20b-StIA。然后，将这个质粒转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中，进行蛋白质表达与纯化，蛋白质纯化的结果如图2所示。

淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和昆布二糖磷酸化酶的制备同实施例1。

反应体系中含有5mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，0.5mM二价锌离子，5U/mL的异淀粉酶，200g/L的淀粉，在85℃进行催化反应，反应时间为3个小时。

随后反应体系中含有100mM HEPES缓冲液(pH 6.5)，5mM的二价锌离子，20mM的磷酸钾(pH 6.5)，1U/mL淀粉磷酸化酶，1U/mL葡萄糖苷酶，2U/mL昆布二糖磷酸化酶，10g/L IA处理过的淀粉，在50℃进行催化反应，反应时间为12个小时。

经标准曲线斜率计算，反应结束后，昆布二糖的终浓度(图4)是18mM，相对淀粉(10g/L，约55.5mM葡萄糖当量，2分子葡萄糖当量合成1分子昆布二糖)转化率为64.8％，相比未经IA处理的淀粉转化率有一定提高。

实施例3通过优化反应体系，进一步提高昆布二糖的得率

异淀粉酶、淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和昆布二糖磷酸化酶的制备同实施例1。

反应体系中含有5mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，0.5mM二价锌离子，5U/mL的异淀粉酶，200g/L的淀粉，在85℃进行催化反应，反应时间为3个小时。

经过逐步优化，确定最适磷酸钾浓度为20mM，最适加酶量为淀粉磷酸化酶2U/mL，葡萄糖苷酶1U/mL，昆布二糖磷酸化酶3U/mL，随后反应体系中含有100mM HEPES缓冲液(pH6.5)，5mM的二价锌离子，20mM的磷酸钾(pH 6.5)，2U/mL淀粉磷酸化酶，1U/mL葡萄糖苷酶，3U/mL昆布二糖磷酸化酶，10g/L IA处理过的淀粉，在50℃进行催化反应，反应时间为12个小时，昆布二糖的检测同实施例1。

经检测，反应结束后，昆布二糖的终浓度(图5)是22mM，对淀粉(10g/L，约55.5mM葡萄糖当量)转化率为79％，相比初始条件，转化率有明显提高，葡萄糖浓度明显下降。

实施例4提高淀粉浓度时昆布二糖的生成情况

异淀粉酶、淀粉磷酸化酶、葡萄糖苷酶和昆布二糖磷酸化酶的制备同实施例1。

反应体系中含有5mM乙酸钠缓冲液(pH 5.5)，0.5mM二价锌离子，5U/mL的异淀粉酶，200g/L的淀粉，在85℃进行催化反应，反应时间为3个小时。

随后反应体系中含有100mM HEPES缓冲液(pH 6.5)，5mM的二价锌离子，20mM的磷酸钾(pH 6.5)，10U/mL淀粉磷酸化酶，5U/mL葡萄糖苷酶，15U/mL昆布二糖磷酸化酶，50g/LIA处理过的淀粉，在50℃进行催化反应，反应时间为24个小时，昆布二糖的检测同实施例1。

反应结束后，昆布二糖的终浓度(图6)是101mM(34.5g/L)，相比10g/L淀粉来说，转化率并没有明显下降。

随后反应体系中含有100mM HEPES缓冲液(pH 6.5)，5mM的二价锌离子，10mM的磷酸钾(pH 6.5)，10U/mL淀粉磷酸化酶，5U/mL葡萄糖苷酶，15U/mL昆布二糖磷酸化酶，100g/LIA处理过的淀粉，在50℃进行催化反应，反应时间为24个小时，昆布二糖的检测同实施例1。

经检测，反应结束后，昆布二糖的终浓度(图6)是202mM(69g/L)，同样相比10g/L淀粉来说，转化率并没有明显下降。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。