阅读说明：本技术 一种基于上转化发光技术的心脏节律与功能的光控制系统 (Optical control system for heart rhythm and function based on up-conversion luminescence technology ) 是由 王晞 程玥 王龙 饶盼盼 于 2018-08-10 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于上转换发光技术的心脏节律与功能的光控制系统。该系统包括光敏蛋白表达系统、光学控制系统、心脏功能监测系统、中央控制系统。光敏蛋白表达系统包括光敏蛋白、病毒载体或非病毒载体、启动子及示踪荧光蛋白；光学控制系统包括上转换发光材料混合高分子材料形成的膜形结构和光输出装置；心脏功能监测系统指监测心脏节律和舒缩功能的装置；中央控制系统指接受心脏功能监测系统信号并根据程序控制向光学控制系统发放指令的装置；该系统以心脏为靶器官,实现光敏蛋白的心肌特异性表达,利用上转换发光材料结合近红外光程控输出,实施对心脏节律与功能的光学控制,进行心血管疾病机制及防治策略的研究与应用。(The invention discloses a light control system for heart rhythm and function based on an up-conversion luminescence technology. The system comprises a photosensitive protein expression system, an optical control system, a heart function monitoring system and a central control system. The photosensitive protein expression system comprises photosensitive protein, viral vector or non-viral vector, promoter and tracing fluorescent protein; the optical control system comprises a film-shaped structure formed by mixing an up-conversion luminescent material and a high polymer material and an optical output device; the heart function monitoring system refers to a device for monitoring heart rhythm and relaxation function; the central control system is a device which receives the signals of the heart function monitoring system and sends instructions to the optical control system according to program control; the system takes the heart as a target organ to realize the myocardial specific expression of photosensitive protein, and utilizes the up-conversion luminescent material in combination with the near infrared light program control output to implement the optical control on the heart rhythm and function and carry out the research and application of cardiovascular disease mechanism and prevention strategy.)

一种基于上转化发光技术的心脏节律与功能的光控制系统

技术领域

本发明属于医疗器械领域，具体涉及一种基于上转换发光技术进行心脏节律与功能的光控制系统。

背景技术

光遗传学是近年来倍受瞩目的一项生物工程技术，一项整合了光学、软件控制、基因操作技术等多学科交叉的生物工程技术。其主要原理是首先采用基因操作技术将光敏蛋白基因(如ChR2，eBR，NaHR3.0，Arch或OptoXR等)转入到特定类型的细胞中进行特殊离子通道或G蛋白偶联受体的表达。光感离子通道在不同波长的光照刺激下会分别对阳离子或者阴离子的通过产生选择性，从而造成细胞膜两边的膜电位发生变化，达到对细胞选择性地兴奋或者抑制的目的。光遗传学技术充分结合了光学与遗传学的优势，即基因编辑技术的细胞精确性，特定单色光的微米级聚焦性，光敏通道电流微秒级的瞬变性，光传播的非介质依赖性。

光遗传学技术应用于心脏研究领域的关键步骤主要包括四个方面：①光敏感蛋白的选择，每一种光敏感蛋白均有其特定波长的活化光波，可引起细胞状态发生相应的功能变化，因此选择合适的光敏感蛋白可实现对心肌细胞兴奋和收缩的调控。②将光敏感蛋白表达于心脏，可采用病毒转染、非病毒转染、转基因动物、cre-依赖的表达体系等遗传学方法将光敏感蛋白表达于靶细胞。③光学控制技术的实施，以波长、功率、脉冲宽度、脉冲间歇、脉冲重复率等参数，确定调控靶细胞的最佳光控条件。④生物学效应评估，利用现有生物电记录技术、心脏收缩功能评价技术等评估光照对心肌细胞或心脏功能的调控效应。

心血管疾病是一种严重威胁人类健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点。目前的治疗手段主要包括药物治疗、介入治疗、手术治疗及植入性电子装置等。其中植入性电子装置通过脉冲发生器定时发放一定频率的脉冲电流，通过导线和电极传输到电极所接触的心肌，使局部心肌细胞受到外来电刺激而产生兴奋，并通过细胞间的缝隙连接或闰盘连接向周围心肌传导，导致整个心房或心室兴奋并进而产生收缩活动。然而，该装置需要导线介质，在植入导线介质时会产生疼痛，也无法实现对心脏节律、同步收缩等的精准调控。

发明内容

为了克服现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种利用上转换发光技术进行心脏节律与功能的光控制系统，可实施直接的或组织穿透性的心脏光学控制，将光遗传学技术运用于心脏电生理和收缩功能调控、疾病机制及防治策略的研究与应用。

为实现此目的，本发明采用以下技术方案：一种基于上转换发光技术进行心脏节律与功能的光控制系统，该系统包括表达于心脏的光敏蛋白表达系统、光学控制系统、与心脏相连的心脏功能监测系统、中央控制系统；所述光敏蛋白表达系统，包括光敏蛋白、载体、启动子及示踪荧光蛋白；所述光学控制系统包括上转换发光材料混合高分子材料形成的膜形结构和埋植于皮下或置于体外与心脏接近的光输出装置；其中中央控制系统接受心脏功能监测系统测得的心电血流信号，根据程序设定向光输出装置发放指令，近红外光即NIR直接或间接投射至上转换发光材料混合高分子材料形成的膜形结构，转换出相应波长的光波，作用于光敏蛋白表达系统靶向的心脏。

所述光敏蛋白包括光敏阳离子通道channelrhodopsin、光敏阴离子通道GtACR、光敏氯离子泵halorhodopsin、光敏氢离子泵bacteriorhodopsin、光敏代谢型受体optoXR、光敏腺苷酸环化酶photoactivated Adenylyl Cylases、生成活性氧ROS的光敏蛋白Killerred，光敏蛋白还包括前述光敏蛋白的突变体；比如选用光敏阳离子通道ChR2,则包括ChR2所有突变体(H134R、C128X、D156A、ChETA、E123T/T159C、CatCh、XXL、XXM)等。

所述载体包括病毒载体或非病毒载体，所用病毒载体包括腺病毒和腺相关病毒；其中腺相关病毒包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9多个血清型；所用非病毒载体包括脂质体复合物、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子等。

所述启动子包括特异性启动子和广谱启动子，所选用组织特异性启动子包含心肌特异性启动子αMHC、cTNT、CK1.3、CK0.4及其他心肌特异性启动子；选用广谱启动子，包括CAG、CMV、PGK1、EF1A、SV40、UBC、EFFS、c-FOS及其他广谱启动子；启动子还包括前述启动子的表达上调元件。

所述示踪荧光蛋白包括mCherry、EYFP、EGFP、dTomato及其他示踪荧光蛋白。

光敏蛋白表达系统的心脏靶向实施模式，即以心脏为靶器官，通过注射等方式利用构建好的光敏蛋白表达系统实现光敏蛋白的表达；所述心脏靶器官包括细胞和亚细胞类型含心室肌细胞、心房肌细胞、窦房结细胞、房室结细胞、成纤维细胞、浦肯野纤维、神经纤维末梢；所述注射方式包括静脉注射、心肌局部注射、冠脉介入注射及其他方式；光敏蛋白表达成功即可使心脏接受相应波长光照的调控，包括调控心脏节律、功能等，激活心脏光遗传学研究。

上转换发光材料混合高分子材料形成的膜形结构，所述上转换材料具有Anti-Stokes特性，通过多光子机制把长波辐射转换成短波辐射，在近红外光(NIR)激发下上转换材料能发出可见光；所述上转换材料包括主体材料NaYF₄、NaGdF₄，敏化剂Yb，激活剂Er、Tm、Ho，以上主体材料、敏化剂、激活剂任意百分比组合；不同组合的上转换材料可被激发多种不同波长光波；所述上转换材料包括上转换纳米颗粒(UCNPs)、上转换荧光粉(UCLPs)、上转换荧光微粒、上转换荧光粉末及其他结构的上转换材料；

所述高分子材料，包括非生物降解的材料，聚乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯、芳香聚酯、硅胶、橡胶、聚氨酯、聚醚醚酮等；可降解生物材料，胶原、脂肪族聚酯、甲壳素、纤维素、聚氨基酸、聚乙烯醇、聚乳酸、聚己内酯、聚磷腈、丝素蛋白；

所述膜形结构为上转换发光材料混合高分子材料通过3D打印、手工旋涂、丝网印刷法、浸涂法、喷墨打印法及喷雾热解法等方式形成可降解或不可降解的膜形结构。

所述光输出装置为可发出近红外波长的激光器或LED，波长范围包括近红外短波(780～1100nm)和近红外长波(1100～2526nm)；光输出装置还包括电源、集成芯片、脉冲发生器、光纤及接头；所述集成芯片接受并处理中央控制系统发出的程序指令，控制脉冲发生器，启动激光光源激光器或LED，后者通过一个或多个光纤接头与光纤相连，经光纤输出近红外光。

所述光输出装置的光照方式及光学参数在一定范围内连续可调，参数包括光照波长、光照脉宽时间、光照频率、光照功率等。

光学控制系统的实施模式为光输出装置按照设定程序发出近红外光，直接投射或间接投射(透过生物组织)至上转换发光材料混合高分子材料形成的膜形结构，使上转换发光材料激发出相应波长的光波，该光波可激活心脏表达的光敏蛋白；近红外光波长及上转换发光材料的选择取决于上述表达在心脏的光敏蛋白的特性。

所述心脏功能监测系统是监测心电变化、心脏节律和心脏收缩功能的装置，将监测到的心电信号反馈至中央控制系统。

所述中央控制系统其输入与心脏功能监测系统相连，输出与光学控制系统中的光输出装置相连，根据监测信息生成输出控制程序，启动光输出装置调节相应光学参数。

本发明的有益效果是：利用上转换发光技术进行心脏节律与功能的光控制系统具有组织穿透性、灵活、精准、无线、无痛等优势，可以灵活控制心脏活动，实现对心脏节律、同步收缩等的精准调控，完成对心脏电生理功能调控、疾病机制及防治策略的研究与应用。

附图说明

图1为一种利用上转换发光技术进行心脏节律与功能的光学控制系统模式图。

图2为图1的实验动物利用上转换发光技术进行心脏节律与功能的光学控制系统示意图。

图3为光敏蛋白表达系统实施的示意图。

图4为光学控制系统实施的示意图，包括基于上转换材料的膜形结构和光输出装置。

图5为实施例1中980nm的近红外光经上转换材料UCNP转换后的可见光光谱图。

图6为实施例1中大鼠心率成功被程控980nm的近红外光经上转换材料UCNP转换后的可见光夺获的心电图。

其中101为中央控制系统，102为光敏蛋白表达系统，103为光学控制系统，104为心脏功能监测系统，201为构建表达光敏蛋白的病毒载体示意图，202为表达光敏蛋白的心脏，203为光敏蛋白作用的机制模式图，310为上转换发光材料混合高分子材料形成的膜形结构作用示意图，311为上转换材料，312为高分子材料，313为复合膜形结构的作用示意图，320为光输出装置，321为电源，322为集成芯片，323为激光光源，324为脉冲发生器，325为光纤接头及光纤，实验动物为500。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

如图1及图2所示，对实验动物500进行光控心脏节律和收缩功能实验，包括中央控制系统101、光敏蛋白表达系统102、光学控制系统103和心脏功能监测系统104。

所述实例的中央控制系统101其输入与心脏功能监测系统104相连，输出与光学控制系统103相连，中央控制系统101根据监测信息生成输出控制程序，控制所述光学控制系统103。

所述实例光敏蛋白表达系统102，包括载体、启动子、调控元件、光敏蛋白及荧光蛋白，通过静脉注射、心肌局部注射、冠脉介入及其他方式将光敏蛋白转染于实验动物500心脏。

所述实例光学控制系统103包括应用上转换发光材料混合高分子材料形成的膜形结构310和光输出装置320，光输出装置320接收来自中央控制系统101的信号，发射光刺激；所述心脏功能监测系统104，用于监测实验动物500的心电生理和功能变化，将检测到的信息反馈至中央控制系统101。

如图3所示，所述实例光敏蛋白表达系统102，包括向实验动物500体内通过静脉注射、心肌局部注射、冠脉介入及其他方式表达光敏感蛋白基因。

所述实例光敏蛋白表达系统102，所选用的光敏蛋白包括光敏阳离子通道channelrhodopsin、光敏阴离子通道GtACR、光敏氯离子泵halorhodopsin、光敏氢离子泵bacteriorhodopsin、光敏代谢型受体optoXR、光敏腺苷酸环化酶photoactivatedAdenylyl Cylases及相应光敏蛋白突变体；如选用光敏阳离子通道ChR2,则包括ChR2所有突变体(H134R、XXM、XXL、C128X、D156A、ChETA、E123T/T159C、CatCh)等。

所述实例光敏蛋白表达系统102，所用病毒载体包括腺病毒和腺相关病毒；所述腺相关病毒包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9，实施实例选用AAV9，目标组织为心脏；所用非病毒载体包括脂质体复合物、阳离子多聚物、壳聚糖聚合物、无机纳米粒子等。

所述实例光敏蛋白表达系统102，所选用启动子为组织特异性启动子，心肌特异性启动子αMHC、cTNT、CK1.3、CK0.4及其他心肌特异性启动子；亦可选用广谱表达型启动子，包括CAG、CMV、PGK1、EF1A、SV40、UBC、EFFS、c-FOS及其他广谱启动子。

所述实例光敏蛋白表达系统102，所选用调控元件来增加启动子表达，实例选用-CS-CRM4-。

所述实例光敏蛋白表达系统102，构建表达光敏蛋白的基因(病毒载体-启动子-调控元件-光敏蛋白-荧光蛋白)201，所述实例通过静脉注射，8周后心脏能稳定表达光敏蛋白。

如203所述光敏蛋白ChR2是一种光控的非选择性阳离子通道，实验动物500心肌细胞表达ChR2，该蛋白可被470nm左右蓝光激活，促使ChR2分子构象发生变化，形成阳离子通道，一价和二价阳离子内流，细胞去极化兴奋，改变心肌细胞的膜电势产生感应电流，从而起到光控心肌电活动作用。

若光敏蛋白选用ChR2，则所述实例光输出装置光输出装置选用980nm左右波长的近红外光激光光源照射上转换发光材料混合硅胶3D打印形成的膜形结构310，激发表达在实验动物全心的ChR2，所述膜形结构贴附于心脏表面；所述光敏蛋白可选用ChR2的突变体，包括ChR2(H134R、XXM、XXL、C128X、D156A、ChETA、E123T/T159C、CatCh)等，则所述实例光输出装置亦可选用980nm左右波长的近红外光激光光源照射上转换发光材料混合硅胶3D打印形成的膜形结构310，激发表达在实验动物500全心的ChR2突变体，所述实例上转换发光材料的发光波长为470nm左右其激发波长为980nm左右。

如图4所示，所述实例光学控制系统包括上转换发光材料混合硅胶3D打印形成的膜形结构和光输出装置；所述上转换发光材料混合硅胶3D打印形成的膜形结构，用于接受来自光输出装置发出的980nm近红外光(NIR)并将其转换为480nm左右的蓝光，进一步激发表达在心脏上的光敏蛋白ChR2。

所述实例光输出装置320依次包括电源321、集成芯片322、激光光源323、脉冲发生器324、光纤接头及光纤325；所述集成芯片322接受并处理控制器发出的光信号，控制激光光源323和脉冲发生器324，通过光纤接头与光纤325相连；通过所述光纤对表达光敏感蛋白的心肌进行光控制。

一种基于上转换发光技术进行心脏节律与光功能的光控制系统，其施行过程为中央控制系统101接受心脏功能监测系统104的信号，根据程序控制向光学控制系统103发放指令，输出光投射至上转换发光材料混合高分子材料形成的膜形结构310，使上转换发光材料激发出相应波长的可见光，光输出装置320作用于光敏蛋白表达系统102靶向的心脏，ChR2分子构象发生变化，形成阳离子通道，一价和二价阳离子内流，细胞去极化兴奋，改变心肌细胞的膜电势产生感应电流，从而起到光控心肌电活动作用。

【实施例1】稀土上转换纳米颗粒介导的光遗传技术起搏大鼠心脏的研究

选择介导阳离子内流的兴奋性光敏蛋白Channelrhodopsin-2(ChR2)为工具蛋白，构建心肌特异性载体(病毒载体-启动子-调控元件-光敏蛋白-荧光蛋白)，选择光电流强的ChR2突变体H134R为转染片段，以α-肌球蛋白重链α-MHC结合表达上调元件CS-CRM4为启动子，以红色荧光蛋白mCherry为标记及转录稳定调控元件WPRE-pA包装于AAV/2-9，以此构建ChR2心脏特异性工具病毒(rAAV-CS-CRM4-αMHC-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-pa)(SEQ IDNO:1)。SD大鼠通过1ml的注射器颈静脉注射编码ChR2的病毒载体，以实现ChR2全心足量表达。

8周后，SD大鼠在麻醉状态下开胸，将不同浓度(2.5、5、10、20mg/ml)的稀土上转换纳米颗粒(UCNP，NaYF₄：Yb，Er/Tm，直径30nm)嵌入复合硅胶薄膜中，将UCNP膜附着于右心室，以光纤耦合半导体激光器提供980nm近红外光源，以TTL调制模式实现光源的脉冲刺激，以准直镜压缩光束发散角，以激光功率输出显示、激光功率计测算功率密度，对光照模式进行精确调节(光斑面积选择梯度直径0.4mm、1mm、2mm、5mm，光照功率梯度从2mW增至50mW，光脉冲宽度梯度从5ms增至50ms,光照频率梯度从4Hz增至8Hz)刺激心脏不同部位(房室顺序、左室同步、左右室顺序、左右室同步)，记录心脏电生理变化(ECG、MAP、MEA、血流动力学)来获得上转换荧光材料在心脏光起搏的有效性评价。

980nm的近红外光(功率1w)投射到封装20mg/ml的UCNP膜发出蓝色可见光，Acton通用性光谱仪SP2750测得所发出可见光的光谱图如图5所示，波峰值大部分处于450-500nm,而ChR2(134R)在400～500nm波长范围内的蓝光照射下可被激活，所用980nm投射到UCNP膜上发出的可见光可激活ChR2(134R)。

如图6所示，大鼠基础心率333次/分，程控980nm(功率2w，频率7Hz)的近红外光投射封装20mg/ml的UCNP硅胶膜上，所发出的蓝光投射在SD大鼠心脏上，表达在大鼠心脏上的ChR2(134R)分子构象发生变化，形成阳离子通道，一价和二价阳离子内流，细胞去极化兴奋，改变心肌细胞的膜电势产生感应电流，大鼠心率被程控光源所夺获，心电图示大鼠心率受光刺激控制，从而起到光起搏心脏的作用。

光遗传学是一门多学科交叉的创新技术，通过材料学和光学领域的结合，完成一种利用上转换发光技术进行心脏节律与功能的的光学控制系统，有助于对生物体的心脏电生理功能调控、疾病机制及防治策略的研究与应用。

以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 武汉大学人民医院（湖北省人民医院）

<120> 一种基于上转化发光技术的心脏节律与功能的光控制系统

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6474

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60

gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120

actccatcac taggggttcc tgcggccgca cgcgtcccac ctccctctct gtgctgggac 180

tcacagaggg agacctcagg aggcagtctg tccatcacat gtccaaatgc agagcatacc 240

ctgggctggg cgcagtggcg cacaactgta attccagcac tttgggaggc tgatgtggaa 300

ggatcacttg agcccagaag ttctagacgg taccggcgcg ccagtagaaa aacagccaag 360

ctagggaggc tgggaggcca agccccagat accttacata gctctgctca gcctctgtct 420

cattaggaac tccattttta ggatgcagtt gtttcaggct aaaaataaat catgcaatga 480

ataaaaaagt tagatacgac actgtagagg gattcgctga tacagtctgt ccgaacgcgt 540

ggtaccccag ttgttcaact cacccttcag attaaaaata actgaggtaa gggcctgggt 600

aggggaggtg gtgtgagacg ctcctgtctc tcctctatct gcccatcggc cctttgggga 660

ggaggaatgt gcccaaggac taaaaaaagg ccatggagcc agaggggcga gggcaacaga 720

cctttcatgg gcaaaccttg gggccctgct gtcctcctgt cacctccaga gccaagggat 780

caaaggagga ggagccagga caggagggaa gtgggaggga gggtcccagc agaggactcc 840

aaatttaggc agcaggcata tgggatggga tataaagggg ctggagcact gagagctgtc 900

agagatttct ccaacccgtc gacgccacca tggactatgg cggcgctttg tctgccgtcg 960

gacgcgaact tttgttcgtt actaatcctg tggtggtgaa cgggtccgtc ctggtccctg 1020

aggatcaatg ttactgtgcc ggatggattg aatctcgcgg cacgaacggc gctcagaccg 1080

cgtcaaatgt cctgcagtgg cttgcagcag gattcagcat tttgctgctg atgttctatg 1140

cctaccaaac ctggaaatct acatgcggct gggaggagat ctatgtgtgc gccattgaaa 1200

tggttaaggt gattctcgag ttcttttttg agtttaagaa tccctctatg ctctaccttg 1260

ccacaggaca ccgggtgcag tggctgcgct atgcagagtg gctgctcact tgtcctgtca 1320

tccttatccg cctgagcaac ctcaccggcc tgagcaacga ctacagcagg agaaccatgg 1380

gactccttgt ctcagacatc gggactatcg tgtggggggc taccagcgcc atggcaaccg 1440

gctatgttaa agtcatcttc ttttgtcttg gattgtgcta tggcgcgaac acattttttc 1500

acgccgccaa agcatatatc gagggttatc atactgtgcc aaagggtcgg tgccgccagg 1560

tcgtgaccgg catggcatgg ctgtttttcg tgagctgggg tatgttccca attctcttca 1620

ttttggggcc cgaaggtttt ggcgtcctga gcgtctatgg ctccaccgta ggtcacacga 1680

ttattgatct gatgagtaaa aattgttggg ggttgttggg acactacctg cgcgtcctga 1740

tccacgagca catattgatt cacggagata tccgcaaaac caccaaactg aacatcggcg 1800

gaacggagat cgaggtcgag actctcgtcg aagacgaagc cgaggccgga gccgtgccag 1860

cggccgccgt gagcaagggc gaggaggata acatggccat catcaaggag ttcatgcgct 1920

tcaaggtgca catggagggc tccgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg 1980

agggccgccc ctacgagggc acccagaccg ccaagctgaa ggtgaccaag ggtggccccc 2040

tgcccttcgc ctgggacatc ctgtcccctc agttcatgta cggctccaag gcctacgtga 2100

agcaccccgc cgacatcccc gactacttga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg 2160

agcgcgtgat gaacttcgag gacggcggcg tggtgaccgt gacccaggac tcctccctgc 2220

aggacggcga gttcatctac aaggtgaagc tgcgcggcac caacttcccc tccgacggcc 2280

ccgtaatgca gaagaagacc atgggctggg aggcctcctc cgagcggatg taccccgagg 2340

acggcgccct gaagggcgag atcaagcaga ggctgaagct gaaggacggc ggccactacg 2400

acgctgaggt caagaccacc tacaaggcca agaagcccgt gcagctgccc ggcgcctaca 2460

acgtcaacat caagttggac atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggaacagt 2520

acgaacgcgc cgagggccgc cactccaccg gcggcatgga cgagctgtac aagtaagaat 2580

tcgatatcaa gcttatcgat aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg 2640

gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt 2700

atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc 2760

tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt 2820

ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga 2880

ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct 2940

gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaaatcat 3000

cgtcctttcc ttggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct 3060

gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc 3120

tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg 3180

cctccccgca tcgataccga gcgctgctcg agagatctac gggtggcatc cctgtgaccc 3240

ctccccagtg cctctcctgg ccctggaagt tgccactcca gtgcccacca gccttgtcct 3300

aataaaatta agttgcatca ttttgtctga ctaggtgtcc ttctataata ttatggggtg 3360

gaggggggtg gtatggagca aggggcaagt tgggaagaca acctgtaggg cctgcggggt 3420

ctattgggaa ccaagctgga gtgcagtggc acaatcttgg ctcactgcaa tctccgcctc 3480

ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagcc tcccgagttg ttgggattcc aggcatgcat 3540

gaccaggctc agctaatttt tgtttttttg gtagagacgg ggtttcacca tattggccag 3600

gctggtctcc aactcctaat ctcaggtgat ctacccacct tggcctccca aattgctggg 3660

attacaggcg tgaaccactg ctcccttccc tgtccttctg attttgtagg taaccacgtg 3720

cggaccgagc ggccgcagga acccctagtg atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct 3780

cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg 3840

gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc ctgcaggggc gcctgatgcg gtattttctc 3900

cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atacgtcaaa gcaaccatag tacgcgccct 3960

gtagcggcgc attaagcgcg gcgggtgtgg tggttacgcg cagcgtgacc gctacacttg 4020

ccagcgccct agcgcccgct cctttcgctt tcttcccttc ctttctcgcc acgttcgccg 4080

gctttccccg tcaagctcta aatcgggggc tccctttagg gttccgattt agtgctttac 4140

ggcacctcga ccccaaaaaa cttgatttgg gtgatggttc acgtagtggg ccatcgccct 4200

gatagacggt ttttcgccct ttgacgttgg agtccacgtt ctttaatagt ggactcttgt 4260

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