阅读说明：本技术 一种光学复合金属纳米材料的制备方法和应用 (Preparation method and application of optical composite metal nano material ) 是由 王晓英 金鑫 宫苗 吕良瑞 李淋雨 陈晴晴 顾璇 于 2019-11-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种光学复合金属纳米材料的制备方法和应用,该方法步骤为：先将壳聚糖、重金属盐、氢氧化钠、联吡啶钌和分散剂在室温下混合研磨,然后加入氯金酸/氯铂酸/氯钯酸溶液或其盐溶液继续研磨,直至产物颜色变为棕色,将产物离心洗涤即得XRuY光学复合金属纳米材料。本发明通过研磨制得的光学复合金属纳米材料尺寸较小且均一,制备过程耗时较少,该法可在室温下进行,不需要额外条件,简便、快速且环保；且本发明制备的光学复合金属纳米材料具有非常好的稳定性,发光效率显著增高、导电性能和生物相容性良好,可应用于电致化学发光生物传感器,作为电极修饰或标记材料,为生物分子的分析检测提供新途径。(The invention discloses a preparation method and application of an optical composite metal nano material, wherein the method comprises the following steps: firstly, mixing and grinding chitosan, heavy metal salt, sodium hydroxide, bipyridyl ruthenium and a dispersing agent at room temperature, then adding chloroauric acid/chloroplatinic acid/chloropalladite solution or salt solution thereof, continuously grinding until the color of the product becomes brown, and centrifugally washing the product to obtain the XRuY optical composite metal nano material. The optical composite metal nano material prepared by grinding has small and uniform size, the time consumption of the preparation process is less, the method can be carried out at room temperature, additional conditions are not needed, and the method is simple, convenient, rapid and environment-friendly; the optical composite metal nano material prepared by the invention has good stability, obviously improved luminous efficiency and good conductivity and biocompatibility, can be applied to an electrochemiluminescence biosensor, can be used as an electrode modification or labeling material, and provides a new path for analysis and detection of biomolecules.)

一种光学复合金属纳米材料的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种光学复合金属纳米材料的制备方法以及该方法制备的光学复合金属纳米材料用作ECL生物传感器生物分子标记物的应用，属于光电材料制造领域。

背景技术

联吡啶钌(Ru(bpy)₃ ²⁺，缩写为Ru)具有化学性能稳定、应用pH范围宽，发光效率高及电化学行为可逆等特点，是应用最广泛的电致化学发光(Electrochemiluminescence,ECL)活性物。近年来，Ru(bpy)₃ ²⁺及其类衍生物的固定材料研究较热。固定材料有由金属、半导体、碳及聚合物等制成的纳米材料及其复合物等。其中，金属纳米材料具有表面等离子体共振以及较好的导电性，可以增强Ru(bpy)₃ ²⁺的发光强度，从而提高ECL生物传感器的灵敏度，是当前固载Ru(bpy)₃ ²⁺较流行的载体。

金属纳米材料可以分为单金属和多金属复合物。多金属复合物是由两种或两种以上金属至少在一个方向以纳米级大小(1～100nm)复合而成的。因此光学复合金属纳米材料是将多金属复合物与Ru(bpy)₃ ²⁺结合，具有以下的优势：(1)既能保持单一金属纳米材料的优势，又能很好地表现出几种纳米材料的协同作用；(2)具有较大的比表面积，能够扩大Ru(bpy)₃ ²⁺的固载量；(3)易于吸收能量而产生激发态，从而放大Ru(bpy)₃ ²⁺信号。因此光学复合金属纳米材料已经广泛应用于ECL生物传感器研究中。

目前，光学复合金属纳米材料的合成方法有共混法、原位聚合法、溶胶-凝胶法和包裹沉淀法等，这些方法需要在溶液中进行，且制备程序复杂，生产成本较高，对环境有一定的污染。

发明内容

发明目的：针对现有的合成方法均需在溶液中进行、制备程序复杂、生产成本高、污染环境等问题，本发明提供一种光学复合金属纳米材料的制备方法，还提供了一种该方法制备的光学复合金属纳米材料的应用。

技术方案：本发明所述的一种光学复合金属纳米材料的制备方法，其步骤为：聚糖、重金属盐、氢氧化钠、联吡啶钌和分散剂在室温下混合研磨，然后加入氯金酸/氯铂酸/氯钯酸溶液或其盐溶液继续研磨，直至产物颜色变为棕色，将产物离心洗涤即得XRuY光学复合金属纳米材料；其中，重金属盐为金属X的盐类，X为密度在4.5g/cm³以上的重金属，Y为金、铂或钯。由于材料中含有联吡啶钌，需将该材料避光保存。

XRuY光学复合金属纳米材料中，Ru为联吡啶钌的缩写，其作为电致化学发光(ECL)活性物质，是ECL信号的来源。X为重金属，可负载发光物联吡啶钌，并可增强材料的导电性，优选的，X可为银、铜、铁等，相应的，提供X的原料重金属盐为银盐、铜盐及铁盐，如硝酸银、氯化银、硝酸铜、硫酸铁等。Y(金、铂或钯)可负载发光物联吡啶钌、增强材料导电性、提供材料的生物相容性，其是由氯金酸/氯铂酸/氯钯酸或其盐类来提供的，由于氯金酸/氯铂酸/氯钯酸或其盐类容易潮解，将其分别配制成氯金酸溶液、氯铂酸溶液、氯钯酸溶液或氯金酸、氯铂酸、氯钯酸的盐溶液来使用。

其中，重金属盐、联吡啶钌与氯金酸/氯铂酸/氯钯酸或其盐类的质量比优选为1～40:1～15:1～50。进一步的，重金属盐、联吡啶钌与氯金酸/氯铂酸/氯钯酸或其盐类的质量比为1～10:1～5:1～15。此处比例以溶质氯金酸/氯铂酸/氯钯酸或其盐类的质量计，而非配制成溶液后的氯金酸/氯铂酸/氯钯酸溶液或其盐溶液的质量。优选的，氯金酸/氯铂酸/氯钯酸溶液或其盐溶液的浓度不低于1g/mL，其加入量不超过50μL。

较优的，按质量百分数计，各原料的加入量为：壳聚糖粉末47～69％、重金属盐粉末0.4～16％、氢氧化钠粉末20～29％、联吡啶钌粉末0.4～6％、分散剂0.3～0.5％，氯金酸/氯铂酸/氯钯酸或其盐类0.4～20％。

其中，分散剂为带负电的表面活性剂，联吡啶钌携带正电荷，分散剂可吸附裹覆于金属颗粒的表面，防止其团聚；分散剂优选采用十二烷基磺酸钠等烷基磺酸盐，烷基磺酸盐吸附裹覆于金属颗粒的表面，经正负电荷静电作用，有利于进一步固载联吡啶钌。

研磨时，壳聚糖、重金属盐、氢氧化钠、联吡啶钌与分散剂混合研磨的时间最好不小于7min，加入氯金酸/氯铂酸/氯钯酸溶液或其盐溶液后研磨的时间最好不少于13min。

本发明所述上述方法制备的光学复合金属纳米材料的应用，是将上述方法制备的光学复合金属纳米材料用作ECL生物传感器生物分子标记物。

本发明中相关简写说明如下：

纳米金属X(XNPs)

纳米金属Y(YNPs)

氯金酸(HAuCl₄)、氯铂酸(HPtCl₄)、氯钯酸(HPdCl₄)

光学复合金属纳米材料(XNPs-Ru(bpy)₃ ²⁺-YNPs，缩写为XRuY)

电致化学发光共反应物三丙胺(TPrA)

循环伏安扫描(CV)

电致化学发光扫描(ECL)

银-氯化银参比电极(Ag/AgCl)

透射电镜(TEM)

场发射扫描电镜(FESEM)

荧光倒置显微镜(IFM)

发明原理：本发明采用研磨法将两种或两种以上的纳米粒子进行复合，在研磨过程中，母粒子在多种作用力的作用下产生循环变形，颗粒中大角度晶界会重新组合，使粉末的组织结构逐步细化，最终达到不同组元的原子互相渗入和扩散的目的。壳聚糖作为还原剂，可以先将金属X离子还原成X单质，X原子形成后可进一步与Y原子结合；此外，壳聚糖具有氨基和羟基，因此具有吸附性和聚阳离子性，所以使得用其制备出的金属X吸附大量的Ru(bpy)₃ ²⁺，从而形成XRuY；

相对于YNPs结构，XY吸附更多带正电荷的Ru(bpy)₃ ²⁺，因此吸附在XY结构上的Ru(bpy)₃ ²⁺的量增加可导致更多的复合物参与电极表面上的ECL反应，从而使得ECL信号增强；而且，通过双金属界面的快速电子迁移可使Ru(bpy)₃ ²⁺的能垒减小，以促进Ru(bpy)₃ ²⁺激发态的形成，导致ECL起始电压显著负偏移，使光电效率增强；

而且，XRuY保留了XNPs和YNPs的优异电子传递能力，XNPs和YNPs组分之间的取向连接，为通过双金属界面的快速电子迁移提供电子“高速公路”，加快了电子转移速率，因此具有良好的导电性能；

另外，该光学复合金属纳米材料中含有X和Y两种金属，因此其比表面积比单金属较大。同时，由于金属与生物分子之间存在共价偶连作用，因此无需添加任何偶联剂就可直接与生物分子结合，解决了Ru(bpy)₃ ²⁺无官能团可交联生物分子的缺陷。因此，该材料具有较好的生物相容性，可广泛用作标记材料。

有益效果：与现有技术相比，本发明的优点为：(1)本发明通过研磨制得的光学复合金属纳米材料尺寸较小且均一，制备过程耗时较少，而且，该方法可以在室温下进行，不需要额外条件，简便，快速，环保；(2)本发明的方法制备的光学复合金属纳米材料具有非常好的稳定性好，其ECL信号经30次CV循环扫描，几乎没有变化；将其作为标记固定在电极上时，4℃下保存在磷酸缓冲液中保存15天后，ECL信号几乎不变，在17天后降到90％以下；(3)本发明所得光学复合金属纳米材料所获的光学复合金属纳米材料将多种金属纳米材料优势叠加，可克服现存方法的缺陷，获得发光效率显著增高(比如AgRuAu的ECL信号较同条件下单金属掺钌纳米材料的ECL信号放大约1.3倍)、导电性能和生物相容性良好的新型光电材料，可应用于ECL生物传感器，作为电极修饰或标记材料，为生物分子的检测提供了一种途径。

附图说明

图1为实施例1制备的AgRuAu的ECL、DPV和TEM表征图谱；

图2为实施例1制备的AgRuAu和Ru(bpy)₃ ²⁺的XRD图像；

图3中曲线a～d分别为AgAu、AgRu、AuRu和AgRuAu在1.0mM TPrA-10mM PBS(pH7.3)中的ECL图谱；

图4为AgRuAu作为标记固定在电极上的稳定性数据结果。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的技术方案作进一步说明。

本发明的光学复合金属纳米材料的制备方法，采用小型的研钵进行固相研磨制备光学复合金属纳米材料，该方法可以在室温下进行，不需要额外条件，如加热；而且制备的光学复合金属纳米材料尺寸较小且均一，制备过程耗时较少。所以该方法简便，快速，环保。

实施例1

称取质量分数为68.5％的壳聚糖，0.9％的AgNO₃，28.8％的NaOH，0.9％的Ru(bpy)₃ ²⁺和0.45％的十二烷基磺酸钠在室温下研磨7分钟，再加入质量分数为0.45％的HAuCl₄溶液继续研磨13分钟。产物颜色变为棕色，表明AgRuAu的形成。将AgRuAu粉末离心洗涤后避光保存。(质量比AgNO₃:Ru(bpy)₃ ²⁺:HAuCl₄＝2:2:1)

对本实施例制备的AgRuAu分别应用差分脉冲伏安(DPV)，电致化学发光扫描(ECL)，扫描电镜(TEM)和荧光倒置显微镜(IFM)进行表征，结果如图1；其中，图1A中两条曲线a、b分别为AgRuAu在1.0mM TPrA-10mM PBS(pH 7.3)中、及在10mM PBS(pH 7.0)中的ECL图谱；图1B中a、b、c三条曲线分别为Ru(bpy)₃ ²⁺、AgAu和AgRuAu在10mM PBS(pH 7.3)中的DPV图谱，扫描速度:50mV s^-1，扫描范围:0.5～1.4V；图1C为AgRuAu的TEM图像，其插图为AgRuAu的IFM图像。

可以看到，单独的AgRuAu仅有微弱ECL信号(图1A，曲线b)，当加入TPrA后，其ECL信号显著增强(图1A，曲线a)，即AgRuAu与TPrA的ECL反应机理与Ru(bpy)₃ ²⁺相同。在DPV曲线中，可以清楚地观察到AgRuAu分别约在+0.47V，+0.78V和+1.15V(vs.Ag/AgCl)的电位处有独立的电流峰(图1B，曲线c)；+0.47V和+0.78V电位位置处所处的峰分别是Ag和Au的特征峰(图1B，曲线b)；相同条件下对Ru(bpy)₃ ²⁺水溶液进行DPV扫描，由图1B中曲线a可以发现在+1.15V处有明显的电流峰，表明AgRuAu能够很好的保持Ru(bpy)₃ ²⁺的活性。由AgRuAu的TEM(图1C)可以看出，AgRuAu颗粒直径约在15±5nm左右，球状且很均匀，分散性好；在荧光倒置显微镜下，AgRuAu在610nm处发出明亮的Ru(bpy)₃ ²⁺的特征橙红色光，表明AgRuAu在复合结构中保持了Ru(bpy)₃ ²⁺的光学特性。

AgRuAu的XRD图谱如图2，其显示了四个较明显的和两个小的(星号标记)衍射峰。由于Ag和Au具有相近的结构性质，其衍射峰的位置近似相同。而Ru(bpy)₃ ²⁺粉末的XRD图谱在2θ角为10到35之间显示出不同的衍射峰以反映其晶体结构。凸起的两个小衍射峰(15.18°和31.30°)与文献报道一致，表明以粉末形式掺杂在复合金属纳米材料中的Ru(bpy)₃ ²⁺表现出与Ru(bpy)₃ ²⁺相同的晶体结构。

为了证明本发明制备的AgRuAu在ECL信号增强中的优势，我们分别比较了AgAu，AgRu，AuRu和AgRuAu的ECL行为，在其他条件相同的情况下，如图3，AgAu(曲线a)几乎没有信号，而AgRu和AuRu的ECL行为相似；AgRuAu的ECL信号(曲线d)比AgRu(曲线b)或AuRu(曲线c)的ECL信号高约1.3倍。这归因于：相对于AuNPs结构，AgAu吸收更多带正电荷的Ru(bpy)₃ ²⁺，因此吸附在AgAu结构上的Ru(bpy)₃ ²⁺的量增加可导致更多的复合物参与电极表面上的ECL反应，从而使得ECL信号增强；此外，AgRuAu使得Ru(bpy)₃ ²⁺发光效率提高也可以归因于AuNP和AgNPs组分之间的取向连接，其为通过双金属界面的快速电子迁移提供电子“高速公路”。通过双金属界面的快速电子迁移可使Ru(bpy)₃ ²⁺的能垒减小，导致ECL起始电压显着负偏移，使光电效率增强。因此，和AgRu，AuRu相比，AgRuAu更适合作为标记物，用于ECL信号放大。

材料的稳定性也是影响ECL性能的一个重要因素。将本实施例制得的AgRuAu作为标记固定在电极上，分别在4℃条件下保存1,3,5,7,9,11,13,15,17,19和21天后对其进行测量，获得的数据如图4。可以看到，在第一周结束时，稳定性基本没有太大变化；在15天时ECL信号值约为新鲜制备电极的90％，在第17天降至90％以下。结果表明，使用AgRuAu作为信号标记的ECL生物传感器显示出优异的稳定性。

实施例2

称取质量分数为58.5％的壳聚糖，16％的AgNO₃，24.3％的NaOH，0.4％的Ru(bpy)₃ ²⁺和0.4％的十二烷基磺酸钠在室温下研磨7分钟，再加入质量分数为0.4％的HAuCl₄溶液继续研磨13分钟。产物颜色变为棕色，表明AgRuAu的形成。将AgRuAu粉末离心洗涤后避光保存。(质量比AgNO₃:Ru(bpy)₃ ²⁺:HAuCl₄＝40:1:1)

实施例3

称取质量分数为65.4％的壳聚糖，0.4％的AgNO₃，27.4％的NaOH，6％的Ru(bpy)₃ ²⁺和0.4％的十二烷基磺酸钠在室温下研磨7分钟，再加入质量分数为0.4％的HAuCl₄溶液继续研磨13分钟。产物颜色变为棕色，表明AgRuAu的形成。将AgRuAu粉末离心洗涤后避光保存。(质量比AgNO₃:Ru(bpy)₃ ²⁺:HAuCl₄＝1:15:1)

实施例4

称取质量分数为55.5％的壳聚糖，0.4％的AgNO₃，23.4％的NaOH，0.4％的Ru(bpy)₃ ²⁺和0.3％的十二烷基磺酸钠在室温下研磨7分钟，再加入质量分数为20％的HAuCl₄溶液继续研磨13分钟。产物颜色变为棕色，表明AgRuAu的形成。将AgRuAu粉末离心洗涤后避光保存。(质量比AgNO₃:Ru(bpy)₃ ²⁺:HAuCl₄＝1:1:50)

经ECL检测，实施例2～4所制备的AgRuAu能够产生信号，但产生的信号较微弱，信号值不到实施例1制备的AgRuAu信号强度的1％，可见在各组分比例的极值点上，依然可以制备出本发明的光学复合金属纳米材料。

实施例5

称取质量分数为47％的壳聚糖，15.7％的AgNO₃，20％的NaOH，4.6％的Ru(bpy)₃ ²⁺和0.3％的十二烷基磺酸钠在室温下研磨7分钟，再加入质量分数为12.4％的HAuCl₄溶液继续研磨13分钟。产物颜色变为棕色，表明AgRuAu的形成。将AgRuAu粉末离心洗涤后避光保存。(质量比AgNO₃:Ru(bpy)₃ ²⁺:HAuCl₄＝40:15:50)

实施例6

69％的壳聚糖，0.5％的FeCl₂，29％的NaOH，0.5％的Ru(bpy)₃ ²⁺和0.5％的十二烷基磺酸钠在室温下研磨7分钟，再加入质量分数为0.5％的HAuCl₄溶液继续研磨13分钟。产物颜色变为棕色，表明FeRuAu的形成。将FeRuAu粉末离心洗涤后避光保存。(质量比FeCl₂:Ru(bpy)₃ ²⁺:HAuCl₄＝1:1:1)

实施例7

61.8％的壳聚糖，4％的AgNO₃，25.8％的NaOH，2％的Ru(bpy)₃ ²⁺和0.4％的十二烷基磺酸钠在室温下研磨7分钟，再加入质量分数为6％的Na₂PdCl₄溶液继续研磨13分钟。产物颜色变为棕色，表明AgRuPd的形成。将AgRuPd粉末离心洗涤后避光保存。(质量比AgNO₃:Ru(bpy)₃ ²⁺:Na₂PdCl₄＝10:5:15)

经ECL检测，实施例5～7制备的光学复合金属纳米材料能够产生信号，且产生的ECL信号强度为实施例1制备的AgRuAu信号强度的80％左右。