具体实施方式

下面结合附图及本发明的实施例对本发明的离心式微流控芯片作进一步详细的说明。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本申请的实施方式例如能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

为了便于描述，在这里可以使用空间相对术语，如“在……之上”、“在……上方”、“在……上表面”、“上面的”等，用来描述如在图中所示的一个器件或特征与其他器件或特征的空间位置关系。应当理解的是，空间相对术语旨在包含除了器件在图中所描述的方位之外的在使用或操作中的不同方位。例如，如果附图中的器件被倒置，则描述为“在其他器件或构造上方”或“在其他器件或构造之上”的器件之后将被定位为“在其他器件或构造下方”或“在其他器件或构造之下”。因而，示例性术语“在……上方”可以包括“在……上方”和“在……下方”两种方位。该器件也可以其他不同方式定位(旋转90度或处于其他方位)，并且对这里所使用的空间相对描述作出相应解释。

如图1-图12所示，该离心式微流控芯片，包括：稀释组件1、第一过滤组件2、第二过滤组件4、缓冲组件3、第一洗脱组件6、第二洗脱组件7、分液组件5、滤液收集组件8和洗脱液收集组件9；

所述稀释组件1出口端连接第一过滤组件2，所述第一过滤组件2的出口端连接缓冲组件3，所述缓冲组件3的出口端连接分液组件5，所述分液组件5的还连接所述第二洗脱组件7的出口端，所述分液组件5的出口端分别连接滤液收集组件8和洗脱液收集组件9；

所述稀释组件1、第一过滤组件2、第二过滤组件4、缓冲组件3、第一洗脱组件6、第二洗脱组件7、分液组件5和滤液收集组件8和洗脱液收集组件9均为环槽结构。

在一种实施例中：

稀释组件1包括：添加和存储稀释液的第一储液槽11；添加和存储样本的样本槽12，所述第一储液槽11和样本槽12的出口端连接第一过滤组件2。

所述第一储液槽11和样本槽12均为环形结构，且相邻设置；在所述第一储液槽11和样本槽12相互靠近位置开设出口，并与所述第一过滤组件2连接。

样本槽12上端设置有样本加液孔121

所述第一过滤组件2包括：第一滤膜槽21，所述第一滤膜槽21一端与所述稀释组件1导通连接，所述第一滤膜槽21另一端开设有通孔22与所述缓冲组件3连接，在所述通孔22靠近第一滤膜槽21的端部设置有去杂滤膜23。

所述通孔22靠近第一滤膜槽21端部的侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为30-150°。

所述通孔22靠近第一滤膜槽21端部的侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为120°。

所述去杂滤膜23的孔径为0.22-0.03微米的超滤膜。

所述通孔22的直径为0.5-3mm。

在一种实施例中：

缓冲组件3包括：混合槽31、储存缓冲液的第二储液槽32；所述混合槽31的入口端导通连接所述第一过滤组件2的出口端，所述第二储液槽32的出口端连接所述混合槽31。

所述混合槽31的深度为1-5mm。

所述第二过滤组件4包括：第二滤膜槽41；所述第二滤膜槽41的入口端通过第一虹吸流道42连接缓冲组件3的出口端，所述第二滤膜槽41的出口端连接分液组件5；

所述滤膜槽的出口端设置有生物分子过滤膜。

所述第二滤膜槽41的出口端侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为30-150°。

所述第二滤膜槽41的出口端侧壁呈倾斜设置，与底面之间的夹角为120°。

所述第一虹吸流道42的宽度为0.1-0.5mm，第一虹吸流道42的深度为0.1-0.5mm。

所述第一洗脱组件6包括：第三储液槽61，所述第三储液槽61的出口端连接第二滤膜槽41。

所述第二洗脱组件7包括：第四储液槽71、过渡槽72；所述第四储液槽71与过渡槽72之间通过毛细阀73导通连接，所述过渡槽72的出口端通过第四虹吸流道74与所述第二滤膜槽41导通连接。

第三储液槽61的深度为3-5mm，出口流道的宽度为3-5mm，出口流道的深度与第三储液槽61深度相同；

所述毛细阀73的宽度为0.1-0.2mm，深度为0.1-0.2mm，长度为2-5mm。

在一种实施例中：

所述分液组件5包括：分液槽51，所述分液槽51的入口端连接第二过滤组件4的出口端，所述分液槽51的两端分别通过第二虹吸流道52和第三虹吸流道53连接滤液收集组件8和洗脱液收集组件9。

所述第二过滤组件4出口端的孔径为直径为0.5-3mm。

所述第二虹吸流道52的亲水指数小于第三虹吸流道53。

所述滤液收集组件8包括：滤液收集槽81、滤液收集池82，所述滤液收集槽81的入口端连接第二虹吸流道52，所述滤液收集槽81的溢流口连接滤液收集池82。

所述滤液收集槽81为废液定量结构，所述废液定量结构的定量大小为100-300μl的废液。

所述洗脱液收集组件9包括：提取槽91，所述提取槽91一端第四虹吸流道74连接，所述提取槽91一端开设有取液孔92。

在一种实施例中：

所述稀释组件1、第一过滤组件2、第二过滤组件4、缓冲组件3、第一洗脱组件6、第二洗脱组件7、分液组件5、滤液收集组件8和洗脱液收集组件9分别中心对称设置有两个。

图1是立体结构示意图，芯片总体结构分为上、下两层，芯片上层设置各种槽结构、加液孔、取液孔92、各种流道和气孔，芯片下层为聚酯薄膜。芯片上层带流道面向下与芯片下层紧密键合，芯片可容纳多个检测单元，可同时进行多个样本的外泌体提取，图中举例了2个检测单元，可同时进行2个样本的外泌体提取。当然亦可以是3个、4个、5个等设计。

图2是芯片上层单个单元平面结构图。包括有：样本槽12、第一储液槽11、第二储液槽32、第三储液槽61、第四储液槽71、过渡槽72、第一滤膜槽21、第二滤膜槽41、混合槽31、分液槽51、滤液收集槽81、提取槽91、第一虹吸流道42、第二虹吸流道52、第三虹吸流道53、第四虹吸流道74、毛细阀73、样本加液孔121和取液孔92。其中各虹吸流道需要做表面亲水处理，特别的第二虹吸流道52的亲水指数小于第三虹吸流道53。

图3是芯片内置滤膜剖面图，以去杂滤膜23为例，去杂滤膜23通过超声焊接、激光焊接或胶粘法键合在第一滤膜槽21侧壁面。第一滤膜槽21侧壁面与底面的夹角90°-150°，图示中优选为120°。第一滤膜槽21与混合槽31之间通过贯穿侧壁面的通孔22连接，通孔22直径0.5-3mm，优选为2mm。

图4是芯片废液和提取液分液原理图。芯片分液结构包括：第二滤膜槽41、分液槽51、第二虹吸流道52、第三虹吸流道53、滤液收集槽81、提取槽91。其中滤液收集槽81内包含：废液定量结构和废液溢流池。当混合液(样本+稀释液+缓冲液)通过第二滤膜槽41中的生物分子过滤膜进入分液槽51成为废液时，由于第二虹吸流道52的亲水指数小于第三虹吸流道53，废液会优先填充满第二虹吸流道52，而第三虹吸流道53由于亲水性相对较差，在短时间见内无法填充满。再次离心后，废液会经过第二虹吸流道52进入滤液收集槽81，并且填充满滤液收集槽81内的废液定量结构，多余的废液则进入废液溢流池。

使用洗脱液对生物分子过滤膜上富集的外泌体进行洗脱时，洗脱液通过生物分子过滤膜进入分液槽51成为提取液，由于第二虹吸流道52出口处连接的滤液收集槽81内的废液定量结构内已充满液体，导致第二虹吸流道52内的空气柱无法排出，因此第二虹吸流道52无法打开，成为常闭阀。而当提取液填充满第二虹吸流道52时，再次离心提取液则会经过第三虹吸流道53进入提取槽91，至此芯片上分液结构完成废液和提取液的分离至两个不同槽。

具体的，采用以下步骤进行样本的外泌体进行提取：

如图5所示，向芯片的样本槽12内加入100μl样本，第一储液槽11内加入100μL稀释液，第二储液槽32内加入200μL缓冲液。

如图6所示，进行芯片第一次离心，转速7000rpm，离心5min，样本和稀释液在第一滤膜槽21内混合，并通过去杂滤膜23进入混合槽31。稀释后的样本通过去杂滤膜23后，样本内的杂质和杂蛋白被过滤，并与缓冲液在混合槽31内混合。

如图7所示，当混合液(样本+稀释液+缓冲液)充满第一虹吸流道42后，再次离心，3400rpm，离心1min。混合液穿过生物分子过滤膜进入分液槽51成为废液，混合液中的外泌体已富集在生物分子过滤膜上。

如图8所示，由于芯片分液结构的作用(具体原理已在图4详细说明)，再次离心，3400rpm，离心1min，废液进入滤液收集槽81内，并填充满滤液收集槽81内的废液定量结构，多余的废液则进入废液溢流池。

如图9所示，芯片上第三储液槽61内加入第一洗脱液，第四储液槽71内加入第二洗脱液，准备对富集在生物分子过滤膜上的外泌体进行洗脱。

如图10所示，芯片进行低转速离心，300rpm，离心1min。由于第三储液槽61出口处不设阀，洗脱液在低转速下进入第二滤膜槽41，但无法穿过生物分子过滤膜，使第一洗脱液与生物分子过滤膜上的外泌体充分接触一段时间，起到孵育的作用。而第四储液槽71出口处设置毛细阀73，毛细阀73宽度0.1-0.3mm，深度0.1-0.3mm，优选宽度0.2mm，深度0.1mm，在低转速下洗脱液2无法突破毛细阀73，仍然停留在第四储液内。

如图11所示，芯片在低转速离心1min后，转速立即升至3400rpm，离心1min。第一洗脱液将生物分子过滤膜上的外泌体大部分洗脱下来后穿过生物分子过滤膜进入分液池成为提取液，第二洗脱液突破毛细阀73进入过渡槽72，停止离心后，第一洗脱液填充满第三虹吸流道53，第二洗脱液填充满第四虹吸流道74。

如图12所示，芯片进行高速离心，8800rpm，离心1min，第二洗脱液穿过生物分子过滤膜，将生物分子过滤膜上剩余的外泌体洗脱下来，由于第三虹吸流道53已经打通，第一洗脱液与第二洗脱液会一起进入提取槽91，通过提取槽91上端的取液孔92，可将带有外泌体的提取液吸出盘片，用于后续分析检测。

本发明的离心式微流控芯片，盘片使用时只需操作人员加入对应的样本和试剂，盘片将自动完成：

1.样本的前处理，包括样本的稀释，稀释样本过超滤膜，去除细胞碎片和杂质、过滤后的样本与缓冲液混合；

2.外泌体富集，包括将外泌体富集在滤膜上，样本中的废液穿过滤膜；

3.外泌体洗脱，包括洗脱液与滤膜孵育，充分洗脱滤膜上的外泌体以及多次洗脱确保将滤膜上的外泌体全部洗脱下来，并且洗脱液不与废液接触，确保提取的外泌体纯度高。

整个外泌体的提取过程包括：样本的前处理、外泌体富集、外泌体洗脱，15Min内即可完成，并且无需大型的冷冻离心设备，无需专业的实验人员进行手工操作，整个提取流程高度自动化，重复性好。

商品化的外泌体提取试剂盒需要大型冷冻离心机，并且操作步骤多，耗时长，需要专业实验人员进行手工操作，并且操作过程中容易出错，导致提取的外泌体量不足、外泌体纯度不够等问题。

为了克服人样本中外泌体的提取操作复杂、提取外泌体量不足，提取的外泌体纯度不够等问题，本发明提供了一种外泌体提取离心式微流控芯片，芯片集成多种微阀和滤膜，整个提取过程15Min内即可完成，并且无需大型的冷冻离心设备，无需专业的实验人员进行手工操作，整个提取流程高度自动化，重复性好。

上述实施例以提取外泌体为例对本发明做了说明，本发明的离心式微流控芯片也可用于其他生物分子的提取，包括所有用滤膜富集的循环肿瘤细胞、外泌体、特别蛋白等。

以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。