阅读说明：本技术 皮肤护理组合物 (Skin care compositions ) 是由 瑟尔维亚·诺威克 于 2018-04-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及皮肤护理组合物，特别是局部用组合物以及制备所述组合物的方法，所述皮肤护理组合物包含来自植物落地生根(Kalanchoe pinnata)的提取物或汁液。本发明还涉及用于施用至人类皮肤的局部用组合物，所述组合物包含来自落地生根和大叶落地生根(Kalanchoe daigremontiana)植物的提取物。组合物治疗有效地用于皮肤水合和调理以改善皮肤状况，并且另外显示出有效治疗一些皮肤状况或皮肤紊乱，特别是银屑病、特应性皮炎、过敏性接触性皮炎、痤疮和疱疹病毒感染。(The present invention relates to skin care compositions, particularly topical compositions, comprising extracts or juices from plant rootstocks (Kalanchoe pinnata), and methods of making such compositions. The present invention also relates to a topical composition for application to human skin comprising extracts from the plant Ficus bengalensis and Ficus macrophylla (Kalanchoe daigremontiana). The compositions are therapeutically effective for skin hydration and conditioning to improve skin conditions and additionally have been shown to be effective in treating certain skin conditions or skin disorders, particularly psoriasis, atopic dermatitis, allergic contact dermatitis, acne and herpes virus infections.)

具体实施方式

和说明性组合物广泛变化。

本发明可以通过以下优选的实例组合物来说明：

包含落地生根的实施例

实施例1

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-28％w/w的蜂蜡

35-75％w/w的脱矿质水

来自落地生根的提取物是来源于植物的任何部分、优选叶片的水性提取物和/或来自叶片的汁液和/或来自植物或植物生物质的其他部分(诸如茎)的汁液。

生产过程从制备脂肪开始，其中单硬脂酸甘油酯和蜂蜡被加热到高达30-75℃的温度，并进行搅拌直到混合物变得顺滑。

将脱矿质水加热到高达30-75℃。

然后将脂肪添加至加热的脱矿质水，搅拌并均质化，直到混合物顺滑。

将脂肪和水的混合物冷却到20-30℃的温度。

将落地生根提取物添加至混合物，进行搅拌并均质化以产生顺滑的乳膏。

实施例2

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-28％w/w的蜂蜡

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程按照实施例1完成，除了在最后阶段，在添加落地生根提取物并进行搅拌后，添加防腐剂(苯氧乙醇)。

然后将所得混合物进行搅拌并均质化。

实施例3

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例1中所提供，但是使用如以上指定的替代性脂肪组合。

实施例4

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例1中所提供的进行，但是使用以上替代性脂肪组合，并且在最后阶段，在添加落地生根提取物并进行搅拌之后，添加防腐剂(苯氧乙醇)。

然后将所得混合物进行搅拌并均质化。

实施例5

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

2-25％w/w的鲸蜡醇

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3中所提供。

实施例6

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

2-25％w/w的鲸蜡醇

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程根据实施例4完成。

实施例7

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

2-10％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3中所提供。

实施例8

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

2-10％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程根据实施例4完成。

实施例9

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

0.25-0.5％w/w的尿囊素

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3中所提供，除了在将脂肪添加到加热的脱矿质水之前，将尿囊素添加到加热的脱矿质水中。

实施例10

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

0.25-0.5％w/w的尿囊素

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4中所提供，除了在将脂肪添加到加热的脱矿质水之前，将尿囊素添加到加热的脱矿质水中。

实施例11

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

2-10％w/w的乳木果油

0.25-0.5％w/w的尿囊素

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例9中所提供。

实施例12

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-30％w/w的椰子油

2-10％w/w的乳木果油

0.25-0.5％w/w尿囊素

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例10中所提供。

实施例13

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的***(Hemp)籽油

2-10％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3中所提供。

实施例14

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的***(Hemp)籽油

2-10％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4中所提供。

实施例15

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

4-40％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3中所提供。

实施例16

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

4-40％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4中所提供。

实施例17

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

4-40％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3中所提供。

实施例18

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

4-40％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4中所提供。

实施例19

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-40％w/w的***(Hemp)籽油

2-30％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

乳膏生产过程如实施例3中所提供。

实施例20

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

4-40％w/w的***(Hemp)籽油

2-10％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4中所提供。

包含落地生根和大叶落地生根的组合的实施例

实施例1a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-28％w/w的蜂蜡

35-75％w/w的脱矿质水

来自落地生根的提取物和来自大叶落地生根的提取物是来源于植物的任何部分，优选叶片的水性提取物和/或来自叶片的汁液和/或来自植物或植物生物质的其他部分诸如茎的汁液。

生产过程从制备脂肪开始：将单硬脂酸甘油酯和蜂蜡加热至高达30-75℃的温度，并进行搅拌直到混合物变得顺滑。

将脱矿质水加热至高达30-75℃。然后将脂肪添加至加热的脱矿质水，搅拌并均质化，直到混合物顺滑。

将脂肪和水的混合物冷却至20-30℃的温度。

将大叶落地生根的提取物添加到混合物中，搅拌并均质化，得到顺滑的乳膏。

实施例2a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-28％w/w的蜂蜡

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程按照实施例1a完成，除了在最后阶段，在添加落地生根的提取物并搅拌后，添加防腐剂(苯氧乙醇)。

然后将所得混合物进行搅拌并均质化。

实施例3a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例1a中所提供，但是使用如以上指定的替代性脂肪组合。

实施例4a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例1a中所提供，但是使用以上的替代性脂肪组合，并且在最后阶段，在添加落地生根提取物并进行搅拌之后，添加防腐剂(苯氧乙醇)。

然后将所得混合物搅拌并均质化。

实施例5a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

2-25％w/w的鲸蜡醇

35-75％w/w脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3a中所提供。

实施例6a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

2-25％w/w的鲸蜡醇

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程根据实施例4a完成。

实施例7a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

2-10％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3a中所提供。

实施例8a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

2-10％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程根据实施例4a完成。

实施例9a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

0.25-0.5％w/w的尿囊素

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3a中所提供，除了在脂肪被添加到加热的脱矿质水之前，将尿囊素添加到加热的脱矿质水中。

实施例10a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

0.25-0.5％w/w的尿囊素

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4a中所提供，除了在脂肪被添加到加热的脱矿质水之前，将尿囊素添加到加热的脱矿质水中。

实施例11a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的椰子油

2-10％w/w的乳木果油

0.25-0.5％w/w的尿囊素

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例9a中所提供。

实施例12a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-30％w/w的椰子油

2-10％w/w的乳木果油

0.25-0.5％w/w的尿囊素

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例10a中所提供。

实施例13a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的***(Hemp)籽油

2-10％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3a中所提供。

实施例14a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-40％w/w的***(Hemp)籽油

2-10％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4a中所提供。

实施例15a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

4-40％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3a中所提供。

实施例16a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

4-40％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4a中所提供。

实施例17a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

4-40％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

乳膏生产过程如实施例3a中所提供。

实施例18a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

4-40％w/w的乳木果油

35-75％w/w的脱矿质水

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4a中所提供。

实施例19a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-40％w/w的***(Hemp)籽油

2-30％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

乳膏生产过程如实施例3a中所提供。

实施例20a

1-30％w/w的来自落地生根的提取物或汁液

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-40％w/w的***(Hemp)籽油

2-10％w/w的椰子油

35-75％w/w的脱矿质水

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

1-5％w/w的鲸蜡醇

0.5-1％w/w的苯氧乙醇

乳膏生产过程如实施例4a中所提供。

包含大叶落地生根的实施例

实施例1b

1-30％w/w的来自大叶落地生根的提取物或汁液

4-20％w/w的单硬脂酸甘油酯

4-28％w/w的蜂蜡

35-75％w/w的脱矿质水

来自大叶落地生根的提取物是来源于植物的任何部分，优选叶片的水性提取物和/或来自叶片的汁液和/或来自植物或植物生物质的其他部分诸如茎的汁液。

生产过程从制备脂肪开始：将单硬脂酸甘油酯和蜂蜡加热到高达30-75℃的温度并进行搅拌直到混合物变得顺滑。

将脱矿质水加热至高达30-75℃。然后将脂肪添加到加热的脱矿质水，进行搅拌并均质化，直到混合物顺滑。

将脂肪和水的混合物冷却到20-30℃的温度。

将大叶落地生根的提取物添加到混合物中，搅拌并均质化，得到顺滑的乳膏。

结果

进行了乳膏制剂的患者试验，所述乳膏制剂包含单独的落地生根的提取物或汁液、单独的大叶落地生根的提取物或汁液(专门用于痤疮)，或两种提取物的组合。

测试的乳膏包括在本文提供的实施例中指定的范围内的制剂，特别是见于实施例6、6a和1b中的制剂。

剂量方案包括连续应用至少2天，但最优选5天、7天或长达28天，每天两次的方案，这取决于特定试验。

患者依从性

乳膏具有均质乳剂的形式，具有适当选择的稠度(consistency)，在试验参与者看来，这使他们能够将乳膏均匀地应用在身体部位。试验参与者对乳膏稠度和皮肤应用的容易性评价很高，他们能够将乳膏顺滑地涂布在各处皮肤上。参与者认为，乳膏(在1至3分钟内)被皮肤均匀且快速地吸收，留下可察觉的膜，并且在应用之处不会引起黏腻感(stickiness)或厚重感(heaviness)。

水合作用

该乳膏显著提高皮肤水合作用，且不会引起皮肤牵拉感，但软化皮肤并使皮肤光滑，同时减少皮肤粗糙、瘙痒、皮肤刺激、发红、红斑痤疮和鳞屑。在应用乳膏一次后，皮肤变得柔软且触摸更为舒适。

照片证据

试验1

以下详细提供了在下列症状患者中实现的临床结果。

支持这些治疗主张(therapeutic claim)的照片文件在图1至图4中提供，说明了应用根据实施例6包含治疗量的落地生根的乳膏的效果，在该情况下包括：9.6g落地生根的提取物/汁液；7g单硬脂酸甘油酯；5g鲸蜡醇；34.4g椰子油；43g脱矿质水；和1g苯氧乙醇。

图1

患者：31岁女性

状况/症状：手部特应性接触性皮炎，持续31年

结果：28天治疗(每天两次)

可见症状的95％清除

图2

患者：65岁女性

状况/症状：耳后/头皮皮肤银屑病，持续16年

结果：28天治疗(每天两次)

可见症状的100％清除

图3

患者：65岁女性

状况/症状：内耳银屑病，持续16年

结果：7天治疗(每天两次)

可见症状的100％清除

图4

患者：23岁女性

状况/症状：手掌/手部过敏性接触性皮炎，持续11年

结果：用实施例X的产品治疗7天(每天两次)

可见症状的95％清除

试验2

支持治疗主张的另外的照片文件在图5至图11中提供，图5至图11说明了应用根据实施例6a的包含治疗量的落地生根和大叶落地生根两者的乳膏的效果。在该特定情况下，用于所有患者的制剂包含：4.8g落地生根的提取物/汁液；4.8g大叶落地生根的提取物/汁液；7g单硬脂酸甘油酯；5g鲸蜡醇；34.4g椰子油；43g脱矿质水；1g苯氧乙醇。

图5

患者：22岁女性

状况/症状：背部痤疮病变

结果：使用组合产品治疗6天(每天两次)

可见症状的85％减少

图6和图7

患者：41岁女性

状况/症状：手部和手臂上的银屑病，持续3年—大的块状(patch-like)银屑病斑块，与健康皮肤明显区分，覆盖有鳞屑。

结果：用组合产品治疗21天(每天两次)

可见症状的100％清除

图8和图9

患者：34岁女性

状况/症状：头皮和腿部上的银屑病，持续17年

结果：用组合产品治疗19天(每天两次)

可见症状的100％清除

图10

患者：23岁女性

状况/症状：手指上的过敏性接触性皮炎，持续8年，先前的类固醇不成功。

结果：2天(每天两次)-用组合产品

可见症状的95％减少

图11

患者：38岁女性

状况/症状：手指上的特应性接触性皮炎，持续33年，先前的类固醇不成功。

结果：使用组合产品10天(每天两次)

可见症状的95％减少

试验3

支持治疗主张的另外的照片文件在图12中提供，图12说明了应用根据实施例1b的包含治疗量的大叶落地生根的乳膏的效果，所述乳膏用于专门治疗痤疮特别是面部痤疮。该制剂包含9.6g大叶落地生根的提取物/汁液；7g单硬脂酸甘油酯；5g鲸蜡醇；34.4g椰子油；43g脱矿质水；和1g苯氧乙醇。

图12

患者：22岁女性

状况/症状：面部和颈部痤疮病变

结果：使用单一产品6天(每天两次)

可见症状的85％减少

抗病毒作用的体外测试

病毒感染的治疗，特别是疱疹HHV-1病毒感染的治疗存在许多挑战，因为该科的病毒在宿主细胞中的发展依赖于其代谢“自动”影响宿主细胞活性，但该科的病毒即使在临床症状看起来消失后也不能完全系统地消除。

针对疱疹的最有效治疗将需要特异性作用、低毒性、无致癌作用和具有有利的药代动力学参数。目前，预防和防止HHV-1感染的一种可选药物是阿昔洛韦。阿昔洛韦是DNA复制的选择性抑制剂，并且显示出对宿主细胞的一定程度的毒性。副作用决定了这种治疗不得用于妊娠女性和哺乳期女性。其他不期望的副作用包括头痛和头晕、恶心、呕吐、腹泻、胃痛、瘙痒、皮疹、对光超敏(hypersensitivity to light)、疲劳和发热。

对许多基于植物的提取物的抗病毒特性知之甚少，并因此申请人已经设计并进行了体外模型，在大叶落地生根存在的情况下测试感染了疱疹病毒1型(HHV-1)的人类角质形成细胞培养物，并将其与已知治疗阿昔洛韦的毒性和效力进行比较。

1.细胞毒性作用

首先，确定了大叶落地生根提取物对无感染的人类角质形成细胞(HaCaT)的细胞毒性作用。将HaCaT培养物与各种稀释度的提取物一起孵育，以确定其对皮肤细胞的细胞毒性作用。提取物与培养液(culture fluid)的比例为提取物:培养液(1:0；1:2；1:4；1:9；1:11)。在该MTT测定中，测试溶液的细胞毒性活性是IC50抑制浓度(即细胞的增殖/存活力与对照相比被抑制50％的浓度)的值。

24小时和48小时后，吸光度的降低指示与阳性对照细胞相比的较低细胞存活力——见表1、表2和表3(见下文)。

表1：570nm波长处的MTT测定的吸光度值减去用630nm波长测量的背景。被去除的异常值以灰色阴影标记。

表2：上述MTT测定的平均吸光度值。校正值是减去空白测试的吸光度的值。

表3

相对于阳性对照计算的活细胞的百分比，其中阳性对照的存活力被假定为100％。

对应于IC50值的浓度被标记为灰色。大叶落地生根提取物的IC50在孵育24小时后，于1:9提取物中观察到，且在孵育48小时后，在1:0稀释度(未稀释提取物)中观察到。注意到未稀释提取物(1:0)和两种较高稀释度1:9和1:11的存活力下降最低。孵育24小时和48小时后确定的HaCaT系的细胞存活力也图示在图13中。

2.HaCaT细胞存活力

在图14的图中还示出了与相应的稀释度的大叶落地生根提取物一起孵育24小时的HaCaT细胞培养物的细胞存活力。与大叶落地生根一起孵育的角质形成细胞存活力与对照相比较低。与对照相比，在较大的稀释度中的存活力表现得整体较高，并且在1:11提取物稀释度，存活力与对照相比仅下降约25％。

接下来，采用细胞计数测定(NucleoCounter NC-3000)研究了另外存在疱疹病毒时的细胞存活力。将HHV-1悬浮液添加到HaCaT细胞系并孵育1小时，以使病毒能够吸附至细胞；然后将细胞与相应稀释比例的提取物一起孵育24小时。

表5：感染了HHV-1并与大叶落地生根提取物(按稀释度)一起孵育的HaCaT细胞系存活力的分析。

示出感染了HHV-1并与各种稀释度的大叶落地生根提取物一起孵育的HaCaT系细胞存活力的百分比的图也在图15中示出。

与HHV-1一起孵育的HaCaT系细胞的特征为存活力降低约10％。

向感染的培养物添加大叶落地生根提取物(在培养24小时后)进一步降低它们的存活力，但使用更高稀释度的提取物时，细胞存活力更高。1:11提取物稀释度使存活力与阳性对照相比能够保持在几乎相同的水平，而1:9稀释度使存活力降低了约15％。

注意到，与通常在HHV-1感染的情况下施用的参考药物阿昔洛韦相比，阿昔洛韦使细胞存活力显著降低至25％。

3.HaCaT细胞定量存活力

采用存活力VB-48测定(NucleoCounter NC-3000)确定在与大叶落地生根提取物一起孵育24小时后，不同程度存活力的角质形成细胞的百分比估计值。

还研究了与相应稀释度的大叶落地生根提取物一起孵育(24h)的HaCaT细胞培养物并且结果在表7中提供。

表7

在与大叶落地生根提取物一起孵育24小时后，死亡、存活力降低或健康的角质形成细胞的百分比估计值也在图16中示出。

将HHV-1悬浮液添加到HaCaT细胞系并孵育1小时，使病毒能够吸附至细胞。然后，将细胞与相应稀释度的植物提取物一起孵育24小时，以评估与相应稀释度的本发明的提取物一起孵育的感染了HHV-1的角质形成细胞的存活力(与阿昔洛韦相比)。

此处，HaCaT细胞感染了HHV-1，并与未稀释的大叶落地生根提取物一起孵育。

此处，对照(+)细胞与抗病毒药物阿昔洛韦一起孵育

图17还示出了在具有对照的情况下，感染了HHV-1并在与大叶落地生根提取物一起孵育24小时后死亡、存活力降低或健康的角质形成细胞(与阿昔洛韦相比)。

角质形成细胞感染了HHV-1后，存活细胞的数目减少了20％。注意到使用大叶落地生根提取物孵育24小时的角质形成细胞的存活力降低。随着提取物稀释度的增加，死亡细胞的百分比降低，且较低存活力细胞和健康细胞的百分比增加。将提取物稀释至1:9或1:11后，约50％的细胞存活或具有降低的存活力，且约50％的细胞死亡。在培养物中应用阿昔洛韦产生仅25％的活细胞/较低存活力细胞。使用大叶落地生根提取物孵育的角质形成细胞的增殖受到抑制。发现与提取物一起孵育HHV-1感染的细胞进一步降低细胞增殖。然而，使用稀释程度越高的提取物，活性细胞和较低活性细胞的数目越多。S期和G2/M期的HaCaT细胞的数目增加，这可能表明它们相比对照细胞更强烈地增殖。

与大叶落地生根提取物一起孵育24小时的角质形成细胞显示出线粒体膜电位下降。使用1:9和1:11的体积比例的大叶落地生根提取物导致研究样品中最微弱的线粒体膜电位下降，且1:9的体积比例表现为对线粒体膜电位是最理想的。用提取物孵育导致先前感染了HHV-1的HaCaT细胞的线粒体膜电位降低。

4.HaCaT细胞形态学

将共聚焦显微术(显微镜放大-60x，数字变焦)用于观察在HHV-1感染48小时后的细胞结构状态和定位(图18)。

直接免疫荧光染色法，其中细胞核-蓝色(A)、病毒抗原-绿色(B)、肌动蛋白-红色(C)、细胞核/肌动蛋白(D),有助于进一步了解细胞的结构变化。

接下来的图19显示，当阿昔洛韦被添加到感染了HHV-1的HaCaT细胞系中时，发现较低量的病毒抗原，这表明较低的病毒复制。具有凝聚的染色质的凋亡(死亡)细胞清晰可见。

将相同的共聚焦显微术技术用于观察HHV-1感染和用大叶落地生根处理后的细胞结构状态和定位。直接免疫荧光染色法依然为细胞核-蓝色(A)、病毒抗原-绿色(B)、肌动蛋白-红色(C)、细胞核/肌动蛋白(D)。

图20示出了感染了HHV-1并用本发明的提取物1:9(稀释比例)处理24小时的HaCaT细胞系；并且图21示出了处理48小时的相同细胞。

图22示出了感染了HHV-1并用本发明的提取物1:11(稀释比例)处理24小时的HaCaT细胞系；并且图23示出了处理48小时的相同细胞。

在图22和23中，与本发明的提取物一起孵育的感染了HHV-1的角质形成细胞培养物示出了大量形状不规则和不同尺寸的细胞和致细胞病变效应(CPE)-合胞体效应的特征性迹象。

此外，用提取物孵育导致发展具有凋亡过程的视觉迹象的大量细胞。细胞凋亡变圆、核染色质凝聚、且细胞骨架解体(例如，图21、图22和图23)，表明程序细胞死亡开始。

与图18中未与本发明的提取物一起孵育的培养物相比，这些变化还伴随包含病毒抗原的细胞的数目减少。

在凋亡期间，细胞和感染病毒的蛋白质和核酸都会降解。因此，被感染的细胞的死亡防止不希望的感染扩散。在病毒机制中重要的是，抵消细胞天然破坏方法，在HHV-1的情况中，存活的机制取决于建立潜伏感染的能力和病毒通过抑制凋亡途径阻止被感染的细胞死亡的能力。

因此，在与植物提取物一起孵育后的角质形成细胞凋亡的发生表现为具有积极的影响，因为它导致HHV-1感染的细胞的消除，并因此阻止病毒潜伏扩散到健康细胞。

用提取物孵育后，先前感染了HHV-1的人类角质形成细胞的个体细胞周期阶段的比例发生了变化。较低的提取物稀释度使大多数细胞移动到亚G1期(G1 sub-phase)，在该阶段中，DNA含量最低(可能发生凋亡)。随着提取物稀释度的增加，处于亚G1期的细胞数量减少，且处于G1/G0期(生长期)的细胞数量增加。处于S期和G2/M期的细胞数量相似。

5.DNA分析

采用实时PCR进行角质形成细胞中的病毒DNA的分析。

图24中的图表显示了感染了HHV-1并在HHV-1吸附1小时后与大叶落地生根植物提取物一起孵育的HaCaT细胞(在感染后24小时和48小时)的实时PCR分析的结果。阴性对照(K-)为未感染的角质形成细胞，且阳性对照(K+)为HHV-1感染的细胞。此外，为了提供本发明的提取物及其医疗用途的直接比较，用阿昔洛韦进行另外的孵育，其中阿昔洛韦在HHV-1吸附1小时后添加。

图25中的图表显示了感染了HHV-1并且不进行1小时预吸附(在培养物感染前)而与大叶落地生根植物提取物一起孵育的HaCaT细胞(在感染后24小时和48小时)的实时PCR分析结果。阴性对照(K-)是未感染的角质形成细胞，且阳性对照(K+)是HHV-1感染细胞，如前所述。此外，为了提供本发明的提取物及其医疗用途的直接比较，用阿昔洛韦进行另外的孵育，但阿昔洛韦在培养物感染之前添加。

结果示出了，与用阿昔洛韦孵育的样品相比，施用大叶落地生根提取物后，DNA病毒拷贝的数目减少。

这些测试进一步表明，当在HHV-1培养物感染前给予提取物时，对HHV-1复制的抑制作用更大(图25)，甚至用实时方法(PCR)未检测到DNA拷贝数。因此，申请人认为根据本发明的组合物提供的大叶落地生根提取物可能能够阻碍病毒HHV-1在皮肤细胞表面的吸附过程。

总之，在本申请中公开的本发明的组合物已被示出有效防治几种皮肤状况，包括医学状况诸如皮炎、皮肤痤疮和皮肤疱疹。本发明还治疗与那些皮肤状况相关的刺激，诸如瘙痒、粗糙、表皮脱落和牵拉感及灼烧感的症状。

组合物在加速皮肤的天然保护层的再生和恢复方面有效，并因此对上述医学状况特别有效。

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