一种基于均相化学发光免疫竞争法检测犬c-反应蛋白的试剂盒
阅读说明：本技术 一种基于均相化学发光免疫竞争法检测犬c-反应蛋白的试剂盒 (Kit for detecting C-reactive protein of dog based on homogeneous chemiluminescence immune competition method ) 是由 曹丹 于 2019-12-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒,其中,所述试剂盒包括DNA1-cCRP抗原偶联物、DNA2-cCRP抗体偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。利用本发明的试剂盒进行检测,其操作简单、结果准确、耗时短、精密度高,并且能够定量检测；样本无需稀释,不存在HOOK效应。(The invention discloses a kit for detecting canine C-reactive protein based on a homogeneous chemiluminescence immune competition method, wherein the kit comprises a DNA1-cCRP antigen conjugate, a DNA2-cCRP antibody conjugate, DNA3 for marking Acridinium Ester (AE) and Graphene Oxide (GO) combined Antioxidant (AOD). The kit disclosed by the invention is used for detection, is simple to operate, accurate in result, short in time consumption and high in precision, and can be used for quantitative detection; the sample did not need to be diluted and there was no HOOK effect.)
技术领域
本发明涉及化学发光免疫分析法技术领域，特别是涉及一种基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒。
背景技术
近年来由于人CRP对于临床疾病诊断、病程的检测和预后具有非常重要的作用，CRP的研究已经成为当下人类临床医学研究的热点。尽管在人类医学中CRP的应用已经非常广泛和深入，其检测技术也非常成熟，但CRP并没有广泛运用到兽医临床的常规检测中，对疾病时CRP浓度变化的研究也只是停留在实验室研究阶段。在国外，早在上世纪七十年代就已经开展了犬临床CRP的研究，在国内却少有文献记载。
据文献记载，和人CRP—样，犬CRP是犬血清中一种急性时相蛋白。正常犬血清CRP含量很少，一般都低于5mg/L，机体的炎症反应和病变时，巨唾细胞分泌的炎性细胞因子，白细胞介素6和肿瘤坏死因子会使血清CRP的含量升高一百多倍。犬发生炎症、感染和组织损伤时CRP浓度都会升高，例如钩端螺旋体病，巴贝斯虫病，细小病毒感染，手术创伤，淋巴瘤和血管肉瘤这些恶性肿瘤，子宫蓄脓，急性胰腺炎，免疫介导的溶血性贫血，关节炎，肾小球肾炎，实验性炎症。由于犬的CRP有急性期的蛋白的性质，所以它不仅仅提供一个鉴别诊断的辅助方法，它还是临床兽医学中的炎症标志，同时也是研究人急性期蛋白质时人CRP的试验模型。因此对犬CRP的研究具有重要的意义。
国内外许多实验室已经研发出许多犬CRP的检测方法，例如免疫比浊法，酶联免疫吸附实验法，胶体金免疫层析法，荧光免疫层析法，以及日本研发的一种犬专用的激光比浊免疫分析法(LNIA)等等。免疫比浊法受干扰因素影响较大；ELISA由于其检测方法耗时耗力，所以该方法只适合实验室研究，不适合用于临床诊断；胶体金和荧光免疫层析法属于定性和半定量检测，结果准确度不高。迫切需要精准、快速和定量的犬CRP检测产品，化学发光法是最好的选择，尤其是均相化学发光法。
由此可见，上述现有的犬C-反应蛋白(cCRP)在检测方法与使用上，显然仍存在有不便与缺陷，而亟待加以进一步改进。为了解决犬CRP的检测方法中存在的问题，相关厂商莫不费尽心思来谋求解决之道，但长久以来一直未见适用的设计被发展完成，而一般方又没有适切的方法能够解决上述问题，此显然是相关业者急欲解决的问题。
有鉴于上述现有的犬CRP的检测方法中存在的缺陷，本发明人基于从事此类产品设计制造多年丰富的实务经验及专业知识，并配合学理的运用，积极加以研究创新，以期创设一种新的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，能够改进一般现有的检测方法，使其更具有实用性。经过不断的研究、设计，并经反复试作及改进后，终于创设出确具实用价值的本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于，克服现有的检测方法中存在的缺陷，而提供一种新的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，所要解决的技术问题是使其检测结果精准、快速并且能够定量，从而更加适于实用，且具有产业上的利用价值。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。
依据本发明提出的一种基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其中，所述试剂盒包括DNA1-cCRP抗原偶联物、DNA2-cCRP抗体偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。
前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其中，所述DNA1-cCRP抗原偶联物的浓度为1～5nM；所述DNA2-cCRP抗体偶联物的浓度为5～20nM；所述标记吖啶酯(AE)的DNA3的浓度为0.05～0.2μM；以及所述氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)的浓度为20μg/ml。
前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其中，所述DNA1-cCRP抗原偶联物的浓度为1nM；所述DNA2-cCRP抗体偶联物的浓度为10nM；所述标记吖啶酯(AE)的DNA3的浓度为0.1μM。
前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其中，所述DNA1含有54个碱基，3’端修饰NH2C7，通过偶联剂二(磺基琥珀)辛二酸(BS3)，与cCRP抗原上的氨基共价结合，形成DNA1-cCRP抗原偶联物。
前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其中，所述DNA2含有52个碱基，5’端修饰NH2C6，通过偶联剂BS3与cCRP抗体上的氨基共价结合，形成DNA2-cCRP抗体偶联物。
前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其中，所述DNA3含有21个碱基，5’端修饰吖啶酯衍生物(AE)；所述DNA3从5’端开始的3-10与所述DNA2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基互补；所述DNA3从3’端开始的5-12与所述DNA1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基互补。
前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其中，所述DNA1与所述DNA2有7个碱基互补。
前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其中，所述DNA3分别有8个碱基与所述DNA1、所述DNA2互补。
前述的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其中，所述DNA1的序列(5’-3’)如下：ACGCTGAGTTATCAACGACTTTTTTTATCACATCAGGCTCTAGCGTATGCTATTG-NH2C7；
所述DNA2序列(5’-3’)如下：NH2C6-TACGTCCAGAACTTTACCAAACCACACCCTTTTTTTGTCGTTGGCTGAGATTC；
所述DNA3序列(5’-3’)如下：AE-NH2C6-CGATCTCAGCAACTCAGCAGCG。
本发明的目的及解决其技术问题还采用以下的技术方案来实现。
依据本发明提出的一种应用如上所述的试剂盒检测犬C-反应蛋白的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
(1)将不同浓度的校准溶液或者含有cCRP全血样本与试剂盒中的检测液按照体积比为1:10的量混合，混合液置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃下温育5min；
(2)在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s，根据记录的化学发光值(RLU)，获得cCRP的校准曲线和待测样本中cCRP的浓度。
借由上述技术方案，本发明(名称)至少具有下列优点：本发明的试剂盒操作简单，可以全血上样，在5分钟左右出检测报告，大大缩短了临床检验标本周转时间(TAT)，适合兽医急诊检测需求。使用本发明的试剂盒在基于均相化学发光免疫竞争法的基础上检测犬C-反应蛋白，能够实现样品的定量检测，其结果准确，精密度高，耗时短。本发明的样品在进行检测时，无需稀释，不存在HOOK效应。
综上所述，本发明特殊的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，能够有效解决现有技术中检测犬C-反应蛋白的方法中存在的检测结果准确度不高、灵敏度不够的问题。其具有上述诸多的优点及实用价值，并在同类方法中未见有类似的设计公开发表或使用而确属创新，其不论在方法上或功能上皆有较大的改进，在技术上有较大的进步，并产生了好用及实用的效果，且较现有技术具有增进的多项功效，从而更加适于实用，而具有产业的广泛利用价值，诚为一新颖、进步、实用的新设计。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
本发明的具体方法及组成由以下实施例及其附图详细给出。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1示出了本发明基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒检测犬C-反应蛋白的原理图；
图2示出了本发明中DNA3和DNA1、DNA2互补配对图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明提出的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒其具体实施方式、方法、步骤、结构、特征及其功效，详细说明如后。
如本文所述，本发明的基于均相化学发光免疫竞争法检测犬C-反应蛋白的试剂盒，其包括DNA1-cCRP抗原偶联物、DNA2-cCRP抗体偶联物、标记吖啶酯(AE)的DNA3和氧化石墨烯(GO)结合抗氧化剂(AOD)。
其中，DNA1含有54个碱基，3’端修饰NH2C7，通过偶联剂二(磺基琥珀)辛二酸(BS3)，与cCRP抗原上的氨基共价结合，形成DNA1-cCRP抗原偶联物；DNA2含有52个碱基，5’端修饰NH2C6，通过偶联剂BS3与cCRP抗体上的氨基共价结合，形成DNA2-cCRP抗体偶联物；DNA3含有21个碱基，5’端修饰吖啶酯衍生物(AE)；所述DNA3从5’端开始的3-10与所述DNA2从3’端开始的3-10碱基位点的碱基完全互补；所述DNA3从3’端开始的5-12与所述DNA1从5’端开始的3-10碱基位点的碱基完全互补。DNA1与DNA2有7个碱基互补；DNA3分别有8个碱基与DNA1、DNA2互补。抗氧化剂(AOD)包括但不限于***二酚、维生素C、维生素E、茶多酚、谷胱甘肽等。氧化石墨烯偶联AOD：氧化石墨烯上的羧基通过氧化亚砜缩合剂与AOD上羟基结合；氧化石墨烯上的羧基通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化与AOD上氨基结合。
具体而言，DNA1的序列(5’-3’)如下：ACGCTGAGTTATCAACGACTTTTTTTATCACATCAGGCTCTAGCGTATGCTATTG-NH2C7；DNA2序列(5’-3’)如下：NH2C6-TACGTCCAGAACTTTACCAAACCACACCCTTTTTTTGTCGTTGGCTGAGATTC；DNA3序列(5’-3’)如下：AE-NH2C6-CGATCTCAGCAACTCAGCAGCG。
具体的检测方法如下：
1、将全血//血清/血浆/其它样本和检测试剂混合，并在37℃条件下温育5-10分钟；
2、加入化学发光底物，通过化学发光检测仪中PMT检测模块进行光信号采集；
3、仪器自动调用标准曲线，从而报出样品中物质的浓度。
实施例1
配置检测试剂：将DNA1-cCRP抗原偶联物(cCRP Ag)、DNA2-cCRP抗体偶联物(cCRPAb)、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为1nM、5nM、0.05μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、5、15、30、60、100、200mg/L)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得cCRP的校准曲线和待测样本中cCRP的浓度。具体结果见表1。
实施例2
配置检测试剂：将DNA1-cCRP抗原偶联物(cCRP Ag)、DNA2-cCRP抗体偶联物(cCRPAb)、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为5nM、10nM、0.1μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、5、15、30、60、100、200mg/L)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得cCRP的校准曲线和待测样本中cCRP的浓度。具体结果见表1。
实施例3
配置检测试剂：将DNA1-cCRP抗原偶联物(cCRP Ag)、DNA2-cCRP抗体偶联物(cCRPAb)、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为1nM、10nM、0.1μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、5、15、30、60、100、200mg/L)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得cCRP的校准曲线和待测样本中cCRP的浓度。具体结果见表1。
实施例4
配置检测试剂：将DNA1-cCRP抗原偶联物(cCRP Ag)、DNA2-cCRP抗体偶联物(cCRPAb)、修饰AE的DNA3、GO-AOD混合，使它们的最终浓度分别为5nM、20nM、0.2μM和20μg/ml。将20μL不同浓度(0、5、15、30、60、100、200mg/L)的校准溶液与200μL检测溶液混合，置于HSCL-10000化学发光仪中，并在37℃条件下温育5分钟。在温育后，通过HSCL-10000化学发光仪加入200μL化学发光底物，并立即通过光电倍增管(PMT)检测该溶液的化学发光信号，检测时间3s。根据记录的化学发光值(RLU)，获得cCRP的校准曲线和待测样本中cCRP的浓度。具体结果见表1。
表1.不同试剂盒检测液浓度下，不同浓度的标准溶液所得到的RLU(发光值)及信号抑制率数据比较。
基于表1的数据可知，利用本发明的试剂盒并结合均相化学发光免疫竞争法技术，即：在同一检测液浓度的情况下，随着检测样品溶液的浓度的增加，RLU(发光值)呈下降趋势，信号抑制率呈上升趋势；在同一检测样品溶液浓度的情况下，检测液中各物质浓度分别为1nM、10nM、0.1μM和20μg/ml的情况下，RLU(发光值)和信号抑制率数据最优。
综上所述，本发明的试剂盒操作简单，可以全血上样，在5分钟左右出检测报告，大大缩短了临床检验标本周转时间(TAT)，适合兽医急诊检测需求。使用本发明的试剂盒在基于均相化学发光免疫竞争法的基础上检测犬C-反应蛋白，能够实现样品的定量检测，其结果准确，精密度高，耗时短。本发明的样品在进行检测时，无需稀释，不存在HOOK效应。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述揭示的方法及技术内容作出些许的更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。