阅读说明：本技术 脱细胞化组织制品的制备方法、及具备脱细胞化组织制品的移植片 (Method for producing decellularized tissue product, and graft having decellularized tissue product ) 是由 岸田晶夫 舩本诚一 桥本良秀 根岸淳 桑总一郎 江间崇夫 小林国治 于 2012-09-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供能够一边抑制构成脱细胞化组织的支持组织的结构的变化,一边在脱细胞化组织中填充液体的脱细胞化组织制品的制备方法、及具备脱细胞化组织制品的移植片。脱细胞化组织制品的制备方法包括使来自动物的脱细胞化组织材料和液体在减压条件下接触的减压工序及/或在加压条件下接触的加压工序。另外,移植片具有通过该制备方法制备的脱细胞化组织制品。(The invention provides a method for producing a decellularized tissue product, which can fill a liquid into a decellularized tissue while suppressing a change in the structure of a supporting tissue constituting the decellularized tissue, and a graft having the decellularized tissue product. The method for producing a decellularized tissue product comprises a pressure reduction step of bringing a decellularized tissue material derived from an animal into contact with a liquid under reduced pressure and/or a pressure step of bringing the decellularized tissue material into contact under pressurized conditions. In addition, the graft has a decellularized tissue product prepared by the preparation method.)

脱细胞化组织制品的制备方法、及具备脱细胞化组织制品的 移植片

本申请是申请日为2012年09月03日、申请号为201280042750.4(国际申请号为PCT/JP2012/072374)、发明名称为“脱细胞化组织制品的制备方法、及具备脱细胞化组织制品的移植片”的发明申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及脱细胞化组织制品的制备方法、及具备脱细胞化组织制品的移植片。

背景技术

近年来，在移植医疗等领域中，进行了与生物体组织的相容性优异的人工原料的开发。作为所述人工原料，可以举出例如将从生物体组织中除去细胞而残留的支持组织即脱细胞化组织作为移植片使用的技术(例如，专利文献1)。

构成生物体组织的支持组织(胶原等)在其内部具有各种大小的空隙。通常，所述空隙被生物体物质、水分等填满。近年来，尝试通过在所述空隙中填充蛋白质、多糖、酶、合成高分子等功能物质，来对生物体组织赋予功能性，利用其作为生物体组织材料。

作为所述尝试，已知将生物体组织浸渍在含有功能物质等的液体中的方法。但是，基于浸渍的方法中，仅在生物体组织的表层部固定功能物质等，难以在整个生物体组织直至生物体组织的内部填充液体。

另外，还考虑通过热、微波、超声波等在生物体组织中填充液体的方法，但是由于采用所述方法时，构成生物体组织的支持组织被改性、破坏等，因此难以作为生物体组织材料使用。

因此，期望开发能够一边抑制构成生物体组织的支持组织的结构的变化，一边在生物体组织中填充液体的方法。

专利文献1：WO2008/111530号说明书

发明内容

本发明的目的在于提供能够一边抑制构成生物体组织的支持组织的结构的变化，一边在生物体组织中填充液体的脱细胞化组织制品的制备方法、及具备脱细胞化组织制品的移植片。

本发明人等发现通过使来自动物的脱细胞化组织材料和液体在减压条件下接触的减压工序及/或在加压条件下接触的加压工序，能够一边抑制构成生物体组织的胶原等结构的变化一边在组织中填充液体，从而完成了本发明。具体而言，本发明提供以下方案。

(1)脱细胞化组织制品的制备方法，包括使来自动物的脱细胞化组织材料和液体在减压条件下接触的减压工序及/或在加压条件下接触的加压工序。

(2)(1)所述的制备方法，上述减压工序在0～－0.101MPa的真空度下进行。

(3)(1)或(2)所述的制备方法，在上述减压工序之后，还包括上述加压工序。

(4)(1)至(3)中任一项所述的制备方法，上述脱细胞化组织材料是经冷冻干燥的脱细胞化组织。

(5)(4)所述的制备方法，上述脱细胞化组织材料是在处理溶液中浸渍后经冷冻干燥的脱细胞化组织。

(6)(1)至(5)中任一项所述的制备方法，上述液体含有功能性赋予剂。

(7)一种移植片，是移植到动物的移植片，所述移植片具备通过(1)至(6)中任一项所述的制备方法制备的脱细胞化组织制品。

根据本发明，通过使来自动物的脱细胞化组织材料和液体在减压条件下接触的减压工序及/或在加压条件下接触的加压工序，能够一边抑制构成生物体组织的支持组织的结构的变化一边在组织中填充液体。

附图说明

[图1]是表示将经冷冻干燥的脱细胞化角膜通过浸渍或含浸进行复原后的角膜的剖面的图。

[图2](A)是表示将经冷冻干燥的脱细胞化大动脉通过浸渍或含浸进行复原后的大动脉的剖面的图。(B)是表示将经冷冻干燥的脱细胞化大动脉通过浸渍或含浸进行复原后的大动脉的含水量的图。

[图3](A)是表示将经冷冻干燥的脱细胞化皮肤通过浸渍或含浸进行复原后的皮肤的剖面的图。(B)是表示将经冷冻干燥的脱细胞化皮肤通过浸渍或含浸进行复原后的皮肤的含水量的图。

[图4]是表示将经冷冻干燥的脱细胞化大动脉浸渍或含浸在肝素溶液中后的大动脉的剖面的图。

[图5]是表示将经冷冻干燥的脱细胞化大动脉浸渍或含浸在肝素溶液中后实施的、肝素的溶出试验的结果的图。

[图6]是表示将经冷冻干燥的脱细胞化角膜浸渍或含浸在β－葡聚糖溶液中后的角膜的剖面的图。

[图7]是表示将经冷冻干燥的脱细胞化角膜通过含浸进行复原，将其移植到日本白色家兔中一个月后的角膜的剖面的图。(A)表示基于苏木精—伊红染色的染色结果。(B)表示基于马森三色染色(Masson trichrome stain)的染色结果。

[图8]是表示将改变冷冻干燥时的冷冻条件进行了冷冻干燥的脱细胞化大动脉在罗丹明溶液或罗丹明标记化PEG溶液中浸渍或含浸后的大动脉的剖面的图。

[图9]是表示将改变冷冻干燥时的冷冻条件进行了冷冻干燥的脱细胞化大动脉在肝素溶液中含浸后的大动脉的剖面的图。

[图10]是表示将改变冷冻干燥时的冷冻条件进行了冷冻干燥的脱细胞化角膜通过含浸进行复原后的角膜的剖面的图。

具体实施方式

以下，说明本发明的实施方式，但并非要限定本发明。

＜减压工序及/或加压工序＞

本发明的制备方法包括使来自动物的脱细胞化组织材料和液体在减压条件下接触的减压工序及/或在加压条件下接触的加压工序。以下，将本发明的在减压或加压条件下在脱细胞化组织材料中填充液体的状态称为“含浸”。

(减压工序)

在构成脱细胞化组织材料的支持组织(胶原等)中，存在大量空隙。在该空隙的内部，存在水分、生物体物质、气体等。本发明的制备方法中，构成脱细胞化组织材料的支持组织中的空隙内部的水分等与导入的液体接触时，可以在脱细胞化组织材料的内部与外部之间产生渗透压差。在这种情况下，在减压条件下，可以将构成脱细胞化组织材料的支持组织中的空隙内部的水分等与导入的液体进行物理置换。导入的液体一旦进入支持组织中的空隙内部，则液体向脱细胞化组织材料的含浸加速进行。另外，本发明的制备方法中，构成脱细胞化组织材料的支持组织中的空隙内部的气体等与导入的液体可以在减压条件下进行物理置换。在减压条件下脱细胞化组织材料中的空气从组织中排出而减少时，脱细胞化组织材料的空隙成为与脱细胞化组织材料周围同等的减压状态。推测导入的液体随后浸透至脱细胞化组织材料中的空隙。

通过上述作用中的任一者或两者，可以将液体令人满意地含浸在脱细胞化组织材料中。另外，根据本发明的制备方法，通过上述作用，能够一边抑制构成脱细胞化组织材料的支持组织的结构的变化一边使液体均匀地含浸在脱细胞化组织材料中。另外，能够将与脱细胞化组织材料的相容性低的液体令人满意地含浸在脱细胞化组织材料中。另外，上述作用可以通过进一步进行下述加压工序而被促进。

减压工序中，在脱细胞化组织材料中含浸液体的过程中，至少进行一次减压即可。例如，可以将脱细胞化组织材料的气氛进行减压，一边保持减压状态一边注入液体等，由此使脱细胞化组织材料与液体接触；也可以使脱细胞化组织材料与液体通过浸渍等接触后，进行减压。

减压条件只要是低于大气压的压力即可，只要能够维持0～－0.101MPa的真空度即可。本发明中的“真空度”以表压表示。该值表示以大气压为零，以怎样的程度接近理想的真空状态(绝对真空)。本发明中的理想的真空状态是－0.101MPa的真空度，越接近于该值越接近理想的真空状态。另外，所谓本发明中压力的“维持”，并不需要在整个减压工序使压力在上述范围，只要至少在一定时间(例如0.01秒～24小时)在上述压力范围能够将脱细胞化组织材料进行减压即可。在上述压力范围进行减压时，液体向脱细胞化组织材料中的浸透变得均匀。

另外，压力范围可以根据含浸时使用的液体进行适当调整。例如，脱细胞化组织材料含有水分等的情况下，该水分等与导入的液体接触时，可以在脱细胞化组织材料的内部与外部之间产生渗透压差。此时，使用接近绝对真空的压力时，存在在水分等与导入的液体通过渗透压差物理置换前水分、液体等发生气化的可能性。气化了的水分等在脱细胞化组织材料的表面冷冻等，可能破坏脱细胞化组织材料的表面结构，或者妨碍液体向脱细胞化组织材料中的含浸。因此，在这种情况下，优选使其为接近大气压的压力，或者预先将液体冷却、或者预先出于调整蒸汽压的目的混合添加剂等。

另外，脱细胞化组织材料为经干燥的材料时，想要使含有高分子等的液体含浸在该脱细胞化组织材料中的情况下，使用接近于绝对真空的压力时，存在下述可能性：脱细胞化组织材料中急剧地吸入液体，另一方面，高分子等堆积在脱细胞化组织材料的表面，其结果脱细胞化组织材料的支持组织变形，妨碍液体向脱细胞化组织材料中含浸。在这种情况下，为了使液体均匀地含浸在脱细胞化组织材料中，优选使其为接近大气压的压力，或者在使脱细胞化组织材料与液体接触后分阶段地制成高真空状态等。

减压时间没有特别限定，可以为1秒～60分钟、优选为5秒～10分钟。根据本发明，由于在减压条件下进行含浸，所以与浸渍等在大气压下进行的方法相比，即使脱细胞化组织材料与液体的接触时间为短时间，液体也含浸至脱细胞化组织材料的内部。

使脱细胞化组织材料与液体在减压条件下接触后，可以解除减压条件，使压力升高至大气压(约0.1MPa)左右，回收脱细胞化组织制品。此时，通过压力的升高，能够促进液体向脱细胞化组织材料中的含浸。

(加压工序)

本发明的制备方法中，使导入的液体在加压条件下向脱细胞化组织材料的空隙内部浸透。推测通过加压，液体被压入脱细胞化组织材料的空隙内部，液体进行浸透。由此，一边抑制构成脱细胞化组织材料的支持组织的结构的变化，一边使液体均匀地含浸在脱细胞化组织材料中。另外，即使脱细胞化组织材料与液体的相容性低，也能够令人满意地将液体含浸在脱细胞化组织材料中。

作为在加压条件下、使脱细胞化组织材料与液体接触的加压工序，可以使用在脱细胞化组织材料中含浸液体的过程中至少加压一次的方法。例如，可以通过将脱细胞化组织材料的气氛加压，一边保持加压状态一边注入液体等，来使脱细胞化组织材料与液体接触，也可以在通过浸渍等使脱细胞化组织材料与液体接触后进行加压。

加压条件只要是比大气压高的压力即可，以大气压为0气压的情况下，只要能够维持0.1～10000气压、优选0.1～1000气压、特别优选0.1～100气压即可。另外，气压为1000气压以上时，常驻菌的细胞被充分破坏，脱细胞化组织材料中的常驻菌的残留被抑制。压力可以对应于液体中含有的成分、液体向脱细胞化组织材料中含浸的程度等进行适当调整。此处所谓的压力的维持，无需在整个加压工序使压力为所述范围，只要能够至少在一定时间(例如0.01秒～24小时)在所述压力范围对脱细胞化组织材料进行加压即可。所述加压可以对应于为了加压而使用的压力的值等，通过使用例如日本劳动安全卫生法中规定的第一种压力容器、第二种压力容器、小型压力容器等设备进行。

加压时间没有特别限定，可以进行1秒至24小时、优选1分钟至60分钟。根据本发明，由于在加压条件下进行含浸，所以与浸渍等在大气压下进行的方法相比，即使脱细胞化组织材料与液体的接触时间为短时间，液体也含浸至脱细胞化组织材料的内部。

加压温度只要脱细胞化组织材料不改性即可，没有特别限定，可以为－20～30℃，优选为－10～25℃。

在本发明的制备方法中，也可以组合减压工序及加压工序。减压工序及加压工序中，先进行任何一个工序均可，但是在减压工序之后进行加压工序时，由于可以在减少脱细胞化组织材料中的空气之后，使液体向脱细胞化组织材料中的浸透加速，因此，可以在整个组织中迅速地实现均匀的含浸，从这方面考虑特别优选。

＜脱细胞化组织材料＞

脱细胞化组织材料可以通过现有公知(例如，WO2008/111530号说明书)的方法制备。

脱细胞化组织材料可以是维持在被制备出的状态，也可以是实施了通常进行的保存处理(冷冻干燥处理、冷冻处理、干燥处理等)的状态。根据本发明的制备方法，无论有无脱细胞化组织材料的保存处理，在上述减压工序中，通过构成脱细胞化组织材料的支持组织中的空隙内部的水分、气体等与导入的液体的物理置换均可以促进含浸。从尤其是能促进利用构成脱细胞化组织材料的支持组织中的空隙内部的气体等与导入的液体的物理置换进行的含浸这方面考虑，脱细胞化组织材料优选经冷冻干燥的材料。另外，如果脱细胞化组织材料是经冷冻干燥的材料，则即使想要导入的液体中含有高分子等，由于高分子等不易堆积在脱细胞化组织材料的表面，因此能够使液体令人满意地含浸在脱细胞化组织材料中。根据本发明，能够一边抑制实施了保存处理的脱细胞化组织材料的结构的变化一边将脱细胞化组织材料复原。

作为将脱细胞化组织材料冷冻干燥的方法，没有特别限定，可以举出下述方法：通过向液氮的浸渍、基于干冰的快速冷冻干燥、使用冷冻装置(NIHON FREEZER公司制等)在－80℃～－4℃下的缓慢冷冻干燥、使用程序冷冻装置(program freezer)在－10℃～－80℃下的控制冷冻等，使脱细胞化组织冷冻后，在真空状态下干燥的方法。

另外，脱细胞化组织材料可以是在为了保存脱细胞化组织材料而通常使用的任意溶剂中浸渍后经冷冻干燥的材料，但是特别优选在处理溶液中浸渍后经冷冻干燥的材料。作为处理溶液，可以举出分别单独含有或组合含有下述物质的溶液，或者将下述物质溶解于水、缓冲液、生理盐水等而得的溶液等，所述物质为蔗糖、海藻糖、乳糖、麦芽糖、纤维素二糖等二糖类、棉籽糖、松三糖、麦芽三糖等三糖类、丙三醇、核糖醇、半乳糖醇、木糖醇、山梨醇、赤藓醇、甘露糖醇、麦芽糖醇等。所述处理溶液不会与脱细胞化组织材料中的自由水结合、导致脱细胞化组织材料中渗透压的升高以及蛋白质的改性及膨润，能够从脱细胞化组织材料中适当地除去水分。由此，能够抑制脱细胞化组织材料的支持组织的变化。通过在冷冻干燥前进行向所述处理溶液的浸渍，即使经过冷冻干燥，也能够一边抑制脱细胞化组织材料的本来的结构的变化一边长期保存。

在溶剂中浸渍的条件可以是在4℃～30℃下浸渍30分钟～1天。

用作本发明中的脱细胞化组织材料的来源的动物没有特别限定，可以举出猪、牛、马、山羊、绵羊、家兔、袋鼠、猴、人等哺乳类动物。

作为本发明中的经脱细胞化的组织没有特别限定，可以举出角膜、心脏瓣膜、血管、皮肤、软骨、骨、腱、肌肉、膀胱、小肠、心脏、肝脏、肺、气管、食道、水晶体、玻璃体、视网膜、神经、脂肪组织、脑、硬膜、胸膜、横膈膜、尿管、肾脏、胰脏、胆囊、牙龈、牙周膜、牙齿、胎盘、生殖器等器官。

＜液体＞

与脱细胞化组织材料接触并含浸的液体只要是接触时为液体即可，没有特别限定。可以使用溶液、浆液、分散液等液体。

所述液体可以含有功能性赋予剂。所谓功能性赋予剂，是指含有对生物体的生理功能起作用的物质的制剂。作为功能性赋予剂没有特别限定，可以举出例如低分子药物(阿司匹林等)、天然药效物质(抗生素等)、蛋白质(生长因子等)、聚合性单体、多糖类(肝素、β－葡聚糖等)、核酸(质粒等)、合成高分子(聚乙二醇(PEG)等)、脂质(胆固醇等)、表面活性剂等及它们的组合。另外，功能性赋予剂可以为液体或固体中的任一种，也可以是它们的混合物。

作为功能性赋予剂含有多种反应性物质(聚合性单体等)的情况下，也可以在向脱细胞化组织材料中含浸后，使上述反应性物质彼此进行化学反应。

对于本发明的制备方法来说，由于不论液体的物性如何，均能够将液体令人满意地含浸在脱细胞化组织材料中，因此，可以将例如粘度高的物质(β－葡聚糖等)、与脱细胞化组织材料的相容性差的物质(例如肝素等疏水性物质)、高分子物质(聚乙二醇等)令人满意地含浸在脱细胞化组织材料中。

＜脱细胞化组织制品＞

是否得到了在脱细胞化组织材料中含浸有液体的脱细胞化组织制品，可以通过对于脱细胞化组织制品测定对应于导入的液体的指标而获知。例如，在脱细胞化组织材料中含浸有水溶液的情况下，通过测定脱细胞化组织制品的含水率等而获知。另外，含浸有特定物质的情况下，通过利用能够对该物质进行染色的试剂对脱细胞化组织制品进行染色而获知。

＜移植片＞

由本发明的制备方法得到的脱细胞化组织制品作为被移植到动物中的移植片的构成有用。即，本发明的移植片具有上述脱细胞化组织制品。

[实施例]

＜实施例1；经冷冻干燥的脱细胞化角膜的复原－I＞

[角膜的脱细胞化]

从猪眼球中取下角膜，用PBS溶液清洗。制作将M199培养基与MEMα培养基以1比1混合得到的基础培养基(以下，称为“Mα培养基”)，加入10质量％丙三醇。将角膜与该溶液一同放入聚乙烯制膜的袋内使其润湿，用热封机进行密封。将该袋载置于“Dr.CHEF”(株式会社神户制钢所制)的腔室内，将温度维持在10℃，同时施加10分钟6000气压的超高静水压。加压/减压速度为1200气压/分钟。

之后，将施加后的角膜在清洁环境下移至灭菌杯(200mL)中，加入50mL清洗用Mα培养基(在Mα培养基中加入0.02质量％脱氧核糖核酸酶(Dnase)、3.5质量％葡聚糖)，在23℃下清洗24小时，接着，更换清洗液，进而在23℃下清洗24小时，除去角膜内部的细胞，得到脱细胞化角膜。

[脱细胞化角膜的冷冻干燥]

将上述脱细胞化角膜在处理溶液(使用蔗糖)中在20℃下浸渍90分钟。接着，使用液氮使脱细胞化角膜冷冻。将经冷冻的脱细胞化角膜使用冷冻干燥机(东京理化器械株式会社制)在真空状态下干燥，得到经冷冻干燥的脱细胞化角膜。

[经冷冻干燥的脱细胞化角膜的复原]

(基于浸渍的复原)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化角膜在生理盐水中在20℃下浸渍6小时。

(基于含浸的复原)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化角膜放入不锈钢真空管，利用真空泵使不锈钢真空管内的真空度为－0.09MPa。进而，在不锈钢真空管中注入生理盐水，将真空度维持5分钟。使不锈钢真空管在大气压下开放，将脱细胞化角膜与生理盐水一同放入聚乙烯袋子中，进行密封。使用冷等静压装置(株式会社神户制钢制)对经密封的脱细胞化角膜在25℃下施加15分钟的100气压的高静水压。

(复原的评价)

将通过浸渍或含浸复原的脱细胞化角膜进行伊红染色。通过利用伊红对角膜染色，胶原等细胞外基质被染色。其结果示于图1。通过浸渍被复原的脱细胞化角膜的剖面未被均匀地染色，复原时生理盐水未均匀地浸透。另外，角膜的胶原结构瓦解。另一方面，通过含浸被复原的脱细胞化角膜被均匀地染色，复原时生理盐水均匀地浸透。另外，角膜的胶原结构的变化被抑制。

＜实施例2；经冷冻干燥的脱细胞化大动脉的复原＞

除了使用猪大动脉作为来自动物的组织以外，与实施例1同样地进行脱细胞化处理及冷冻干燥，得到经冷冻干燥的脱细胞化大动脉。

[经冷冻干燥的脱细胞化大动脉的复原]

(基于浸渍的复原)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化大动脉在生理盐水中在室温下浸渍6小时。

(基于含浸的复原)

按照下述三种方法将经冷冻干燥的脱细胞化大动脉含浸在生理盐水中。

(1)基于减压的含浸

将经冷冻干燥的脱细胞化大动脉放入不锈钢真空管中，利用真空泵使不锈钢真空管内的真空度为－0.09MPa。在不锈钢真空管内中注入生理盐水，将真空度维持5分钟。

(2)基于加压的含浸

将经冷冻干燥的脱细胞化大动脉与生理盐水一同放入聚乙烯袋子中，进行密封。使用冷等静压装置(株式会社神户制钢制)，在25℃下对经密封的脱细胞化大动脉施加15分钟100气压的高静水压。

(3)基于减压及加压的含浸

将经冷冻干燥的脱细胞化大动脉放入不锈钢真空管中，利用真空泵使不锈钢真空管内的真空度为－0.09MPa。接着，在不锈钢真空管中注入生理盐水，将真空度维持5分钟。使不锈钢真空管在大气压下开放，将脱细胞化大动脉与生理盐水一同放入聚乙烯袋子中，进行密封。使用冷等静压装置(株式会社神户制钢制)在25℃下对经密封的脱细胞化大动脉施加15分钟100气压的高静水压。

(基于伊红染色的复原的评价)

将通过浸渍或含浸复原的脱细胞化大动脉进行伊红染色。其结果示于图2(A)。通过浸渍被复原的脱细胞化大动脉未被均匀地染色，复原时生理盐水未均匀地浸透。另外，大动脉的胶原结构瓦解。另一方面，通过含浸被复原的脱细胞化大动脉被均匀地染色，复原时生理盐水均匀地浸透。另外，大动脉的胶原结构的变化被抑制。特别是，通过基于减压及加压的含浸被复原的脱细胞化大动脉被均匀地染色，并且，胶原结构的空隙、纹理整齐，胶原结构被极好地维持。

(基于含水率的复原的评价)

用滤纸将过量的液体除去后测定通过浸渍或含浸复原的脱细胞化大动脉的质量。该测定值称为“湿重量”。接着，将各脱细胞化大动脉在真空中冷冻干燥后测定质量。将该测定值称为“干燥重量”。各脱细胞化大动脉的含水率基于下述式算出。

含水率(质量％)＝{(湿重量－干燥重量)/湿重量}×100

其结果示于图2(B)。通过含浸被复原的脱细胞化大动脉的含水率等于或大于通过浸渍被复原的脱细胞化大动脉的含水率。特别是，通过基于减压及加压的含浸被复原的脱细胞化大动脉的含水率与天然的(native)大动脉的含水率基本没有变化，被极好地复原。

＜实施例3；经冷冻干燥的脱细胞化皮肤的复原＞

除了使用猪皮肤作为来自动物的组织以外，与实施例1同样地进行脱细胞化处理及冷冻干燥，得到经冷冻干燥的脱细胞化皮肤。

[经冷冻干燥的脱细胞化皮肤的复原]

(基于浸渍的复原)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化皮肤在生理盐水中在室温下浸渍30分钟。

(基于含浸的复原)

将经冷冻干燥的皮肤放入不锈钢真空管中，利用真空泵使不锈钢真空管内的真空度为－0.01MPa、－0.05MPa、或－0.09MPa。在不锈钢真空管内中注入生理盐水，将真空度维持5分钟。接着，将经冷冻干燥的皮肤与生理盐水一同放入聚乙烯袋子中，进行密封。使用冷等静压装置(株式会社神户制钢制)在25℃下对经密封的脱细胞化皮肤施加15分钟100气压的高静水压。

(基于伊红染色的复原的评价)

与实施例2同样地，利用伊红染色评价脱细胞化皮肤的复原。其结果示于图3(A)。通过浸渍被复原的脱细胞化角膜基本未被染色，复原时生理盐水未浸透到组织的内部。另外，胶原结构瓦解。另一方面，通过含浸被复原的脱细胞化角膜中胶原被染色，复原时生理盐水浸透至组织内部。另外，胶原结构的变化被抑制。使真空度为－0.09MPa进行含浸的情况下，胶原被均匀地染色，并且，胶原结构的空隙、纹理整齐，胶原结构被特别良好地维持。

(基于含水率的复原的评价)

与实施例2同样地，算出各脱细胞化皮肤的含水率。其结果示于图3(B)。通过含浸被复原的脱细胞化皮肤的含水率高于通过浸渍被复原的脱细胞化大动脉的含水率。使真空度为－0.09MPa经减压的情况下，含水率特别高。

＜实施例4；经冷冻干燥的脱细胞化大动脉的基于肝素溶液的功能化－I＞

除了将生理盐水改为肝素溶液以外，进行与实施例2同样的处理，得到被功能化的脱细胞化大动脉。将得到的脱细胞化大动脉用甲苯胺蓝染色。通过将脱细胞化大动脉用甲苯胺蓝染色，能够将脱细胞化大动脉中的肝素的分布可视化。其结果示于图4。在通过浸渍被功能化的脱细胞化大动脉中，肝素未浸透。另一方面，对于通过含浸被功能化的脱细胞化大动脉来说，肝素在组织中浸透。特别是，通过基于减压及加压的含浸被功能化的脱细胞化大动脉中，肝素在整个组织中浸透。

＜实施例5；经冷冻干燥的脱细胞化大动脉的基于肝素溶液的功能化－II＞

除了将生理盐水改为肝素溶液以外，与实施例2同样地得到经冷冻干燥的脱细胞化大动脉。

[经冷冻干燥的脱细胞化大动脉的功能化]

(基于浸渍的功能化)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化大动脉在肝素溶液中在室温下浸渍30分钟、或12小时。

(基于含浸的功能化)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化大动脉放入不锈钢真空管中，利用真空泵使不锈钢真空管内的真空度为－0.09MPa。接着，在不锈钢真空管中注入肝素溶液、或生理盐水，将真空度维持5分钟。使不锈钢真空管在大气压下开放，将脱细胞化大动脉与肝素溶液、或生理盐水一同放入聚乙烯袋子中，进行密封。使用冷等静压装置(株式会社神户制钢制)在25℃下对经密封的脱细胞化大动脉施加15分钟的100气压的高静水压。

(肝素的溶出试验)

将通过浸渍或含浸被功能化的脱细胞化大动脉浸渍在生理盐水中，在37℃下振荡。在振荡开始后1小时后、3小时后、6小时后、9小时后、12小时后、24小时后的时刻，回收生理盐水。每次回收生理盐水后，将脱细胞化大动脉移至新的容器中，重新添加生理盐水重复溶出工序。

使用回收的溶出液，进行基于Lee－White法的试验。具体而言，在经灭菌的聚乙烯管(制品名；VIOLAMO、AS ONE株式会社制)中加入猪全血(10mL)及回收的各溶出液(1mL)，在37℃下进行培养。针对各溶出液测量从培养开始至血液的血块形成的时间。其结果示于图5。通过含浸被功能化的脱细胞化大动脉显示长期的抗血栓性，表明肝素被保持在直至组织的内部。肝素为高分子量，与脱细胞化大动脉的相容性低，但是根据本发明，能够令人满意地将肝素含浸在脱细胞化大动脉中。

＜实施例6；经冷冻干燥的脱细胞化角膜的基于β－葡聚糖溶液的功能化＞

与实施例1同样地得到经冷冻干燥的脱细胞化角膜。

[经冷冻干燥的脱细胞化角膜的功能化]

(基于浸渍的功能化)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化角膜在1％β－葡聚糖溶液中在室温下浸渍6小时。

(基于含浸的功能化)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化角膜放入不锈钢真空管中，利用真空泵使不锈钢真空管内的真空度为－0.09MPa。接着，在不锈钢真空管中注入1％β－葡聚糖溶液，将真空度维持5分钟。使不锈钢真空管在大气压下开放，将脱细胞化角膜与1％β－葡聚糖溶液一同放入聚乙烯袋子中，进行密封。使用冷等静压装置(株式会社神户制钢制)对密封的脱细胞化角膜在25℃下施加15分钟100气压的高静水压。

(基于荧光增白剂染色的功能化的评价)

将通过浸渍或含浸被功能化的脱细胞化角膜利用荧光增白剂(calcofluorwhite)染色。通过基于荧光增白剂的染色，能够将脱细胞化角膜中的β－葡聚糖的分布可视化。其结果示于图6。图6的虚线表示角膜的表面。如图6所示，在通过浸渍被功能化的脱细胞化角膜中，β－葡聚糖仅在角膜的表面部浸透。另一方面，对于通过含浸被功能化的脱细胞化角膜来说，β－葡聚糖在整个组织浸透。

＜实施例7；被复原的脱细胞化角膜的异种移植试验＞

与实施例1同样地得到通过含浸被复原的来自猪的脱细胞化角膜。使用微型角膜刀(株式会社NIDEK制)将得到的脱细胞化角膜较薄地裁切至厚度160μm。接着，通过高静水压处理(10℃、5000气压、10分钟)进行脱细胞化角膜的灭菌。在即将移植前在清洁环境下将脱细胞化角膜加工成直径2mm的盘状，制成移植片。将日本白色家兔的角膜实质(parenchyma of cornea)切开后进行层间剥离，制作角膜移植用袋。将移植片***在该袋中。将移植一个月后的角膜进行苏木精—伊红染色及马森三色染色。其结果分别示于图7(A)及(B)。通过将角膜进行苏木精—伊红染色或马森三色染色，移植片中的胶原等被染色，可获知移植后的移植片是否脱落等。如图7所示，被复原的脱细胞化角膜在移植后未产生脱离及排斥反应等，能够移植。

＜实施例8；经冷冻干燥的脱细胞化大动脉的基于罗丹明标记化PEG溶液的功能化＞

与实施例2同样地得到经冷冻干燥的脱细胞化大动脉。

[经冷冻干燥的脱细胞化大动脉的功能化]

(基于浸渍的功能化)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化大动脉在罗丹明溶液或罗丹明标记化PEG溶液中在室温下浸渍15分钟。

(基于含浸的功能化)

将上述经冷冻干燥的脱细胞化大动脉放入真空加压含浸装置(株式会社F-COM制)中，使该装置内的真空度为－0.09MPa。接着，在该装置中注入罗丹明标记化PEG溶液，将真空度维持30秒。接着，将该装置内升压，以3气压在25℃下加压15分钟后在大气压下开放。

(基于荧光色素(罗丹明)的使用荧光显微镜的功能化的评价)

对于通过罗丹明溶液或罗丹明标记化PEG溶液被功能化的脱细胞化大动脉来说，通过荧光显微镜观察，能够将脱细胞化大动脉中的罗丹明的分布可视化。使脱细胞化大动脉中的罗丹明的分布可视化的结果示于图8(右侧的照片)。如图8(右侧的照片)所示，在通过浸渍被功能化的脱细胞化大动脉中，罗丹明在整个组织中浸透，但是罗丹明标记化PEG仅在大动脉的表面部浸透。另一方面，对于通过含浸被功能化的脱细胞化大动脉来说，罗丹明标记化PEG在整个组织中浸透。需要说明的是，冷冻时，使用冷冻装置(NIHON FREEZER公司制)使脱细胞化大动脉缓慢干燥的情况下，罗丹明标记化PEG以高浓度含浸至组织的内部。

＜实施例9；经冷冻干燥的脱细胞化大动脉的基于肝素溶液的功能化－III＞

与实施例2同样地得到经冷冻干燥的脱细胞化大动脉。并且，冷冻时，使用冷冻装置(NIHON FREEZER公司制)使其缓慢干燥，由此得到经冷冻干燥的脱细胞化大动脉。

[经冷冻干燥的脱细胞化大动脉的基于含浸的功能化]

将上述经冷冻干燥的脱细胞化大动脉放入真空加压含浸装置(株式会社F-COM制)中，使该装置内的真空度为－0.04MPa。接着，在该装置中注入肝素溶液、或生理盐水，维持真空度30秒。接着，将该装置内升压，以3气压在25℃下加压15分钟后在大气压下开放。

(基于甲苯胺蓝染色的功能化的评价)

将得到的脱细胞化大动脉用甲苯胺蓝染色。其结果示于图9。通过含浸，对于脱细胞化大动脉来说，肝素在组织中浸透。特别是，冷冻时，对于被缓慢干燥的脱细胞化大动脉来说，肝素以高浓度含浸至组织的内部。

＜实施例10；经冷冻干燥的脱细胞化角膜的复原－II＞

与实施例1同样地得到经冷冻干燥的脱细胞化角膜。

[经冷冻干燥的脱细胞化角膜的基于含浸的复原]

将上述经冷冻干燥的脱细胞化角膜放入真空加压含浸装置(株式会社F-COM制)，使该装置内的真空度为－0.09MPa或－0.04MPa。接着，在该装置中注入生理盐水，将真空度维持30秒。接着，将该装置内升压，以3气压在25℃下加压15分钟后在大气压下开放。

(复原的评价)

将通过含浸复原的脱细胞化角膜进行伊红染色。其结果示于图10。通过含浸被复原的脱细胞化角膜被均匀地染色，复原时生理盐水均匀地浸透。另外，以高真空度(－0.09MPa)含浸后的组织一方，组织间隙少，角膜的胶原结构的变化被抑制。