阅读说明：本技术 一种γ-聚谷氨酸生物有机肥的制备及应用方法 (Preparation and application method of gamma-polyglutamic acid biological organic fertilizer ) 是由 闫志英 房俊楠 刘杨 许力山 姬高升 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物化肥领域,具体涉及一种γ-聚谷氨酸生物有机肥的制备及应用方法。具体技术方案为：一种γ-聚谷氨酸生物有机肥,具体由枯草芽孢杆菌8-2发酵制备得到,所述枯草芽孢杆菌8-2保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物保藏中心,保藏编号为CGMCC No.17215。本发明以农业废弃物秸秆和豆粕为主要基质、利用微生物固体发酵生产γ-PGA,有效减少了发酵成本,同时把发酵结束后含有γ-PGA的固体发酵基质直接用作生物有机肥料,既简化了下游的分离提纯步骤,又减少了化学肥料的使用,同时还能显著促进农作物的生长；为解决农业废弃物资源化利用问题及减少化肥使用量提供了新思路。(The invention belongs to the field of biological fertilizers, and particularly relates to a preparation and application method of a gamma-polyglutamic acid biological organic fertilizer. The specific technical scheme is as follows: the gamma-polyglutamic acid bio-organic fertilizer is prepared by fermenting bacillus subtilis 8-2, wherein the bacillus subtilis 8-2 is preserved in China general microbiological culture Collection center with the preservation number of CGMCC No. 17215. The invention takes agricultural waste straws and bean pulp as main substrates, utilizes the solid fermentation of microorganisms to produce the gamma-PGA, effectively reduces the fermentation cost, and simultaneously directly uses the solid fermentation substrate containing the gamma-PGA after the fermentation is finished as the biological organic fertilizer, thereby simplifying the downstream separation and purification steps, reducing the use of chemical fertilizers and obviously promoting the growth of crops; provides a new idea for solving the problem of resource utilization of agricultural wastes and reducing the using amount of chemical fertilizers.)

一种γ-聚谷氨酸生物有机肥的制备及应用方法

技术领域

本发明属于生物化肥领域，具体涉及一种γ-聚谷氨酸生物有机肥的制备及应用方法。

背景技术

我国农业资源丰富，在农业生产过程中产生了大量的固体有机废弃物，其中最主要的是农作物秸秆和畜禽粪便。据农业部不完全统计，每年我国产生的畜禽粪便高达40亿吨、农作物秸秆高达10亿吨。而与之相对的，我国对这类固体有机废弃物的利用率很低，存在严重的不完全利用带来的资源浪费和环境污染问题。与此同时，随着化学肥料在农业生产中使用量的增加，农业面源污染也变成我国农业生产与农业可持续发展面临的严峻挑战之一。

多年来，为了提高化肥的利用效率，同时也为了减少化肥的使用量，人们对肥料增效剂进行了大量的研究。其中，具有水溶性高、吸附性强、生物相容性好，无毒、无害、无残留，能促进作物养分吸收的增效剂γ- 聚谷氨酸(下文简称γ-PGA)受到国内外学者的重视。γ-PGA可增加作物产量，对肥料和水分起到很好的缓释作用，同时还可改善土壤的保水性能及团粒结构，增强农作物的抗病能力，具有显著的保水保肥、增产节肥效果。

γ-PGA作为一种优良的环保型高分子材料，主要由微生物通过液体发酵或固体发酵得来。但目前γ-PGA的制备存在发酵碳氮源成本高、需氧量大、提取纯化困难等众多问题，导致γ-PGA制备成本高昂，严重限制了其在农业中的应用。因此，寻找经济廉价的农用γ-PGA高效发酵制备技术显得尤为重要。现有技术中，γ-PGA的使用方法多为：先对农业废弃物进行堆肥处理，随后再外加成品γ-PGA。但由于γ-PGA 成品价格昂贵，利用该方法制得的γ-PGA有机肥成本极高。且γ-PGA 是外源添加的，还可能存在混合不均匀、与堆肥存在拮抗反应等缺陷。因此，寻找到一种廉价、高效的γ-PGA生物有机肥制作方法显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种γ-聚谷氨酸生物有机肥及应用方法。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种γ-聚谷氨酸生物有机肥，所述γ-聚谷氨酸生物有机肥由枯草芽孢杆菌8-2发酵制备得到，所述枯草芽孢杆菌8-2保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏编号为CGMCC No.17215。

优选的，所述γ-聚谷氨酸生物有机肥的发酵基质包括：玉米秸秆、大豆豆粕和味精粕。

优选的，按质量比，所述玉米秸秆：大豆豆粕：味精粕＝5:5:1。

优选的，所述发酵温度为25～30℃。

相应的，所述γ-聚谷氨酸生物有机肥的制备方法，包括如下步骤：

(1)将发酵基质自然风干、粉碎、混匀；

(2)使用E型发酵培养基培养枯草芽孢杆菌8-2至OD₆₀₀≥1，获得种子接种液；

(3)将所述种子接种液接入发酵基质中，混匀发酵，即得所需γ- 聚谷氨酸生物有机肥。

优选的，所述发酵基质中，按质量比，所述玉米秸秆：大豆豆粕：味精粕＝5:5:1。

优选的，所述种子接种液在发酵基质中的接种量为3～11％，所述接种量指种子接种液的体积与发酵基质的质量之比。

优选的，所述发酵pH为7.0～8.0。

优选的，所述发酵基质的初始含水量为60％～70％。

优选的，所述发酵温度为25～30℃。

本发明具有以下有益效果：

1、本发明提供了一种全新的枯草芽孢杆菌，具有在特定条件下高产γ-PGA的能力。并同时提供了一种利用该枯草芽孢杆菌高效生产的γ-PGA生物有机肥及制备方法。

2、生产成本低，有利于大规模示范应用。本发明使用的发酵原料均为工农业废弃物。通过微生物固体发酵的方式，将玉米秸秆、大豆豆粕以及味精粕转变为高附加值产量达到变废为宝的目的，不仅有利于农业废弃物的资源化利用，同时也降低了固体发酵成本，更为环境保护提供了一种新思路，促进了农业生产的可持续发展。

3、操作工艺流程简单。本发明以工农业废弃物为原料，利用γ-PGA 生产菌株固体发酵生产γ-PGA，随后又将发酵结束后的固体发酵基质直接作为生物有机肥。无需外源添加γ-PGA，也没有γ-PGA分离、提取及纯化过程，大大简化了发酵工艺流程，过程简单，便于操作。

4、有机肥营养均衡。农作物玉米秸秆以及大豆豆粕中均含有大量的有机质、氮、磷、钾以及丰富的微量元素。同时不灭菌的发酵过程也保留了大量有益的微生物菌群，可与添加的菌株8-2产生一定的协同植物促生作用。再加上γ-PGA的肥料增效作用，对土壤改良、巩固肥力、促进作物生长以及改善作物品种具有重要作用。

5、绿色环保，有利于环境保护。本发明制备的γ-PGA生物有机肥成分简单，主要为玉米秸秆、大豆豆粕和味精粕以及发酵产物，均为天然可再生原料，且在制备过程中没有外源化学肥料的加入，因此，在该有机肥使用过程中不存在对环境污染的问题，更有利于环境保护。

综上，本发明以农业废弃物秸秆和豆粕为主要基质、利用微生物固体发酵生产γ-PGA，有效减少了发酵成本，同时把发酵结束后含有γ-PGA的固体发酵基质直接用作生物有机肥料，既简化了下游的分离提纯步骤，又减少了化学肥料的使用，同时还能显著促进农作物的生长；为解决农业废弃物资源化利用问题及减少化肥使用量提供了新思路。

附图说明

图1为本发明提供枯草芽孢杆菌在培养皿中生长情况示意图；

图2为本发明提供枯草芽孢杆菌的电镜扫描图。

具体实施方式

本发明涉及的培养基如下：

1、E型分离培养基：甘油50g/L、柠檬酸10g/L，谷氨酸钠10g/L， (NH₄)₂SO₄ 6g/L，K₂HPO₄ 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeCl₃·6H₂O 0.02g/L， CaCl₂ 0.2g/L，MnSO₄·H₂O0.05g/L，琼脂20g/L，pH为7.2～7.5。

2、E型发酵培养基：柠檬酸16g/L，谷氨酸50g/L，硫酸铵12g/L，甘油50g/L，K₂HPO₄2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，FeCl₃·6H₂O 0.02g/L， MnSO₄·H₂O 0.1g/L，CaCl₂ 0.2g/L，溶剂为水，pH＝7.0。

3、斜面活化培养基：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，溶剂为水，pH为7.0～7.4；所述的活化培养条件为：在25～37℃培养24～ 48h。

4、种子培养基：酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH＝7.0。

实施例一：获取发酵用菌株

本发明所用的γ-PGA生产菌株为枯草芽孢杆菌。筛选方法为：利用E型分离培养基分离、筛选自四川省成都市长安垃圾填埋场，随后利用E型发酵培养基对其生产γ-PGA的产量进行验证，将其命名为8-2 (下文简称菌株8-2)。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为：CGMCC No.17215。经测序，其16Sr DNA序列如SEQ IDNO 1所示。

实施例二：发酵条件的优选

1、准备发酵原料：将从农田中收集到的农作物秸秆(例如玉米秸秆、小麦秸秆等，本实施例中统一使用玉米秸秆)晾晒、自然风干以去除其水分，粉碎至长度为3mm左右。同时从当地农产品市场购买大豆豆粕与味精粕。使用E型发酵培养基活化菌株8-2，培养菌株8-2浓度至OD₆₀₀值为1.0左右，作为接种种子液。

以玉米秸秆和大豆豆粕为主要的发酵基质，味精粕作为补充营养成分，将各发酵组分利用灭菌玻璃棒充分搅拌均匀。500mL锥形瓶中装样量为30g，发酵试验在恒温培养箱中进行。

2、γ-PGA含量的检测

本实施例中涉及到γ-PGA含量检测时，均按如下步骤利用真空水解 -高效液相色谱法进行：

(1)液体发酵的测定方法：发酵结束后，取发酵液，加入6mol/L 盐酸调节pH值至3以下，过滤除菌体，再加入6mol/L氢氧化钠将pH 调节至中性。加入液体总体积3～4倍体积预冷的无水乙醇，沉淀过夜， 10000g离心10min，获得γ-PGA粗沉淀。随后向γ-PGA粗沉淀中加入10mL ddH₂O，重悬γ-PGA，10000g离心10min去除不溶物，上清液4℃保存，获得γ-PGA水溶液，以待后续分析。取所述γ-PGA水溶液2mL酸水解(加入10mL 6M HCl，真空条件下110℃水解12～24h)，水解完成后定容至100mL，随后加入氨基酸衍生液(2，4-二硝基氟苯，DNFB)，室温条件下静止衍生30min，衍生液过0.45um膜过滤，使用氨基酸分析仪或高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)定量检测谷氨酸含量，再换算为γ-PGA的产量。

(2)固体发酵的测定方法：发酵结束后，向发酵底物中加入100mL ddH₂O，室温下置于180rpm摇床上震荡1h。用纱布过滤，取30mL悬浊液置于离心管中，1000g离心20min去除菌体与发酵基质中的固体颗粒物。再取10mL上清液转移至新的50mL离心管中，之后的纯化、检测步骤与液体发酵一致。

将菌株8-2接种到斜面活化培养基中，35℃培养12h进行活化。将活化的菌株接种于种子培养基，摇床转速180rpm，35℃培养12h，获得活化的种子液。将所述活化的种子液接入摇瓶发酵培养基中，接种量5％ (v/v)，摇瓶装液量为60mL/500mL,摇床转速220rpm，在28℃下发酵24h。发酵结束后，取发酵液，按上述方法(1)测定γ-PGA产量，结果为55g/L。

本实施例下述各试验中，均采用固体发酵，故γ-PGA产量的测定方法为上述方法(2)；下述各γ-PGA产量的单位均为g/kg。

3、基质初始含水量的优化

玉米秸秆、大豆豆粕、味精粕的添加质量比为5：5：1(本文中，未特定说明处均为质量比)，接种量5％(v/w，实施例二获得的接种种子液菌液体积与基质总质量之比)，pH＝7.0、发酵温度30℃。利用pH 7.0 的磷酸缓冲液调节基质的含水量，设置45％、50％、55％、60％、65％、70％以及75％七个梯度(v/w：添加缓冲液体积与固体基质干物质之比)。结果如表1所示。

表1发酵基质不同含水量对γ-PGA产量的影响

发酵基质含水量	γ-PGA产量
		45％	30.44±1.98
50％	46.45±2.88
		55％	72.73±2.60
60％	91.73±5.84
		65％	105.30±0.36
70％	86.26±1.57
		75％	61.97±3.43

从表1可以看出，发酵基质中不同初始含水量对γ-PGA产量的影响不同，当初始含水量为65％时，γ-PGA的产量最大。因此，后续试验中，将发酵基质的初始含水量设置为65％。

4、接种量的优化

玉米秸秆、大豆豆粕、味精粕的添加质量比为5：5：1，基质初始含水量为65％，pH为7.0、发酵温度为30℃。为了研究菌株8-2不同接种量对γ-PGA产量的影响，设置1％、3％、5％、7％、9％、11％共计六个接种梯度(v/w：接种种子液的菌液体积与基质总质量之比)，结果如表2 所示。

表2不同接种量对γ-PGA产量的影响

接种量	γ-PGA产量
		1％	60.99±6.20
3％	106.94±11.56
		5％	112.2±1.93
7％	119.03±2.27
		9％	109.49±0.07
11％	105.80±8.03

试验结果表明：接种量为7％时产量最高，接种量为5％时次之。但综合考虑到成本问题，将5％的接种量作为后续试验中的接种量。

5、初始pH的优化

pH是影响微生物生长繁殖的重要因素，因此研究pH对菌株8-2发酵生产γ-PGA的影响显得尤为重要。玉米秸秆、大豆豆粕、味精粕的添加质量比为5：5：1，基质初始含水量为65％，菌株8-2的接种量为 5％，发酵温度为30℃。分别设置pH＝5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、 8.0、8.5共计8个pH梯度，pH利用1M NaOH与1M HCl进行调节。结果如表3所示。

表3不同pH对γ-PGA产量的影响

结果显示：当初始pH为7.5时，γ-PGA产量最高。故在后续试验中，初始pH设为7.5。

6、发酵温度的优化

玉米秸秆、大豆豆粕、味精粕的添加质量比为5：5：1，基质初始含水量为65％，菌株8-2的接种量为5％，初始pH为7.5。设置20℃、 23℃、25℃、28℃、30℃、33℃、35℃共计七个温度梯度，发酵试验在恒温培养箱中进行，保证发酵过程温度维持设定温度。结果如表4所示。

表4不同温度对γ-PGA产量的影响

发酵温度	γ-PGA产量
		20℃	41.36±7.65
23℃	99.45±2.51
		25℃	112.55±5.78
28℃	127.36±3.57
		30℃	101.00±4.64
33℃	64.21±8.57
		35℃	32.80±8.72

当发酵温度在20℃～28℃间变化时，γ-PGA的产量逐渐提高；当温度大于28℃时，γ-PGA的产量则逐渐下降。可以看出，菌株8-2可以在较低温度下实现γ-PGA的大量生产，后续试验中，将28℃作为菌株8-2发酵生产γ-PGA的最适温度。

7、玉米秸秆与大豆豆粕的比例优化

按质量比，设置玉米秸秆：大豆豆粕＝0：10、1：9、2：8、3：7、4：6、5：5、6：4、7：3、8：2、9：1、10：0共计11个比例梯度，味精粕质量为玉米秸秆和大豆豆粕总质量的1/10。发酵试验条件设置为：发酵温度28℃、基质含水量65％、菌株接种量为7％，基质pH 7.0。结果如表5所示。

表5不同基质对γ-PGA产量的影响

玉米秸秆：大豆豆粕	γ-PGA产量
		0:10	18.23±7.18
1:9	35.37±3.36
		2:8	79.85±6.27
3:7	117.09±1.43
		4:6	130.61±2.03
5:5	142.80±6.90
		6:4	106.99±1.17
7:3	24.51±7.68
		8:2	10.23±3.36
9:1	5.66±3.06
		10:0	2.61±1.64

最后的试验结果得出，当玉米秸秆与大豆豆粕的添加比例为5：5 时，γ-PGA的产量可以达到最大(表5)。所以在之后的试验过程中，将玉米秸秆与大豆豆粕的添加的比例设置为5：5。

7、发酵时间的优化

玉米秸秆、大豆豆粕与味精粕的质量比为5:5:1，基质初始含水量为65％，菌株8-2的接种量为5％，初始pH为7.5，发酵温度为28℃，每组设置三个重复。每隔6h对γ-PGA的产量进行检测，观察当γ-PGA 产量达到最大时的发酵时间点，则在后续试验中将该时间点作为γ-PGA 最适发酵时间。试验结果表明，当发酵时间为60h，γ-PGA的产量可以达到最大。

由上述试验结果得出，该固体发酵的最适发酵条件为：玉米秸秆、大豆豆粕与味精粕的添加质量比为5:5:1，基质含水率为65％，接种量为5％，pH为7.5，发酵温度为28℃，最适发酵时间为60h。

实施例三：扩大发酵并制备γ-PGA生物有机肥

1、在实施例二的基础上，进行150L固体发酵罐的扩大试验。装样量为30kg(按质量比，玉米秸秆、大豆豆粕与味精粕的添加比例为 5:5:1)，初始基质含水量为65％，初始pH为7.5，菌株8-2接种量为5％，搅拌速度为20rpm，通空气速率为6m³/h，在28℃下发酵60h，γ-PGA 的产量最高为102.48±3.30g/kg。该数据由农场放大实验获得，比实验室中在瓶子内发酵数据略有降低。

2、发酵60h后，收集全部发酵基质。为了保证γ-PGA生物有机肥能够长期保存，需要控制发酵基质的含水量在10％。如果发酵基质含水量过大，则进行自然风干处理。随后，使用真空压缩袋进行分装，以便后续利用。

实施例四：γ-PGA生物有机肥对小白菜的促生作用

1、盆栽试验

利用盆栽试验验证γ-PGA生物有机肥对小白菜的促生作用。每盆装土2kg，各种植一株培育5天的小白菜幼苗，15天后收获。各处理间差异不显著。共设置三组：对照组、1％化肥组(尿素化肥，产自济南鸿磊化工有限公司)、1％γ-PGA生物有机肥组，每组五个平行。在种植小白菜幼苗之前，应将土与肥料混合均匀。其中，所述1％是指化肥/γ-PGA 生物有机肥的添加量占土壤总质量的1％。

2、小白菜幼苗的分析检测方法

基本性状的测定：采用卷尺测量株高及茎叶长度。从根部到生长点的距离为株高，根长为根部到根尖的距离。生物量的测定：利用分析天平直接称量测定小白菜的鲜重，鲜重测定完毕后的样品105℃杀青30min，随后置于70℃烘箱中烘至恒重、称量所得到的结果即为小白菜干重。叶绿素含量的测定：取新鲜小白菜叶片，擦净组织表面污物，去除中脉后剪碎。称取剪碎的样品2g，放入研钵中，加入少量的石英砂和碳酸钙粉末，及无水乙醇，进行研磨，研磨中再加入少量无水乙醇，继续研磨直至叶片组织变白，静置3～5min。随后将匀浆定容至100mL，混合均匀，利用紫外分光光度计法检测叶绿素提取液在665nm、645nm 和652nm处的吸收峰，其中95％乙醇作为对照。

3、结果分析

结果如表6所示。

表6各组对小白菜生长的影响作用对比表

测试项目	对照组	1％化肥组	1％γ-PGA有机肥组
				株高/mm	60.07±1.11	66.15±0.13	71.18±0.36
跟长/mm	21.37±0.12	21.09±0.27	22.37±0.97
				鲜重/g	1.20±0.18	1.32±0.07	1.45±1.02
干重/g	0.37±0.23	0.51±0.35	0.57±0.15
				叶绿素含量/mg·g<sup>-1</sup>	0.43±0.01	0.47±0.15	0.51±0.17

从表6可以看出，与对照组相比，使用普通化肥和γ-PGA生物有机肥之后，小白菜幼苗的株高、根长、鲜重、干重及叶绿素含量均有显著提高，γ-聚谷氨酸生物有机肥对小白菜幼苗的促生作用更明显。由此可见，γ-聚谷氨酸生物有机肥的肥效效果显著，对小白菜幼苗的生长有很好的促进作用，能明显改善作物品质。

实施例五：γ-PGA生物有机肥对玉米幼苗的促生作用

1、盆栽试验

利用盆栽试验来验证γ-PGA生物有机肥对玉米幼苗的促生作用。每盆装土2kg，各种植一株培育7天的玉米幼苗，30天后收获。共设置三组，包括对照组、1％化肥组以及1％γ-PGA生物有机肥组，每组五个平行。在种植玉米幼苗之前，应将土与肥料混合均匀。

2、玉米幼苗的分析检测方法

基本性状的测定：采用卷尺测量株高及茎叶长度。从根部到生长点的距离为株高，根长为根部到根尖距离。生物量的测定：利用分析天平直接称量测定玉米幼苗的鲜重，鲜重测定完毕后的样品105℃杀青 30min，随后置于70℃烘箱中烘至恒重、称量所得到的结果即为玉米幼苗干重。可溶性蛋白的测定：称取0.5g玉米叶片于研钵中，随后加入 5mL磷酸缓冲液，快速充分研磨后将匀浆转移至离心管中4℃离心取上清。随后取0.1mL上清液、0.9mL的去离子水及5mL的考马斯亮蓝G-250 于离心管中混合均匀，放置5min后利用紫外分光光度计测量其在595nm 处的吸光值。可溶性糖的测定：取0.2g玉米幼苗干样于试管，随后加入5mL的去离子水在沸水中水溶加热30min，加热期间不断搅拌，取出稍冷却后，再加入5mL的去离子水继续沸水浴30min，之后定容至25mL。取2mL滤液于比色管中，加入1mL浓度为9％的苯酚溶液，摇匀后再加入 5mL的浓硫酸，再摇匀，放置至室温，利用紫外分光光度计测量其在485nm 处的吸光值。

3、结果分析

结果如表7所示。

表7各组对玉米幼苗生长的影响作用对比表

试验组	对照组	1％化肥组	1％γ-PGA有机肥组
				株高/cm	35.21±0.18	37.22±0.71	40.01±0.32
根长/cm	6.05±0.78	7.11±0.23	7.81±0.19
				鲜重/g	20.05±1.12	22.17±0.27	25.67±0.31
干重/g	2.35±0.36	2.51±0.73	2.61±0.12
				可溶性蛋白/mg·g<sup>-1</sup>	13.11±0.47	13.88±0.48	14.47±0.16
可溶性糖/mg·g<sup>-1</sup>	20.21±0.13	23.17±0.57	25.61±0.07

从表7可以看出，与对照组相比，使用普通化肥和γ-PGA生物有机肥之后对玉米幼苗的株高、根长、鲜重、干重、可溶性蛋白以及可溶性糖含量均有显著提高，γ-PGA生物有机肥对玉米幼苗的促生作用更明显。由此可见，γ-PGA生物有机肥的肥效效果显著，对玉米幼苗的生长有很好的促进作用，能够明显改善作物品质。

实施例六：γ-PGA生物有机肥对番茄幼苗的促生作用

1、盆栽试验

利用盆栽试验来验证γ-PGA生物有机肥对番茄幼苗生长的促进作用，每盆装土2kg，各种植一株培育7天的番茄幼苗，30天后收获。设置三个组，包括对照组、1％化肥组以及1％γ-PGA生物有机肥组，每组五个平行。在种植番茄幼苗之前，应将土与肥料混合均匀。

2、番茄的分析检测方法

基本性状的测定：采用卷尺测量株高及茎叶长度。从根部到生长点的距离为株高，从根部到根尖的距离为根长。生物量的测定：利用分析天平直接称量测定番茄苗的鲜重，鲜重测定完毕后的样品105℃杀青 30min，随后置于70℃烘箱中烘至恒重、称量所得到的结果即为番茄苗干重。叶绿素含量的测定：去新鲜番茄叶片，擦净组织表面污物，去除中脉剪碎。称取剪碎的样品2g，放入研钵中，加入少量的石英砂和碳酸钙粉末以及无水乙醇进行研磨，进行研磨，研磨中再加入少量无水乙醇，继续研磨直至叶片组织变白，静置3～5min。随后将匀浆定容至100mL，混合均匀，利用紫外分光光度计法检测叶绿素提取液在665nm、645nm 和652nm处的吸收峰，其中95％乙醇作为对照。

3、结果分析

结果如表8所示。

表8各组对番茄生长的影响作用对比表

试验组	对照组	1％化肥组	1％γ-PGA有机肥组
				株高/cm	129.18±3.70	139.04±1.27	142.40±1.09
根长/cm	4.38±0.47	4.92±0.39	5.34±0.72
				鲜重/g	45.17±0.56	49.37±0.26	51.33±0.12
干重/g	4.53±1.07	4.51±0.37	4.13±0.17
				叶绿素/mg·g<sup>-1</sup>	0.59±0.13	0.74±0.35	0.81±0.57

从表8可以看出，与对照组相比，使用普通化肥和γ-PGA生物有机肥，对番茄苗的株高、根长、鲜重、干重以及叶绿素均有显著提高，γ-PGA生物有机肥对番茄幼苗的促生作用更明显。由此可见，γ-PGA 生物有机肥的肥效效果显著，对番茄幼苗的生长有很好的促进作用，能够明显改善作物品质。

序列表

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种γ-聚谷氨酸生物有机肥的制备及应用方法

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1452

<212> DNA

<213> 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)

<400> 1

ccactgcgca tgcctataca tgcagtcgag cggacagatg ggagcttgct ccctgatgtt 60

agcggcggac gggtgagtaa cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg 120

aaaccggggc taataccgga tggttgtttg aaccgcatgg ttcagacata aaaggtggct 180

tcggctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240

ccaaggcaac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300

ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360

ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aagctctgtt gttagggaag 420

aacaagtgcc gttcaaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480

actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540

gtaaagggct cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600

gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660

ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720

ctgacgctga ggagcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780

ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttagggg gtttccgccc cttagtgctg cagctaacgc 840

attaagcact ccgcctgggg agtacggtcg caagactgaa actcaaagga attgacgggg 900

gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca acgcgaagaa ccttaccagg 960

tcttgacatc ctctgacaat cctagagata ggacgtcccc ttcgggggca gagtgacagg 1020

tggtgcatgg ttgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1080

caacccttga tcttagttgc cagcattcag ttgggcactc taaggtgact gccggtgaca 1140

aaccggagga aggtggggat gacgtcaaat catcatgccc cttatgacct gggctacaca 1200

cgtgctacaa tggacagaac aaagggcagc gaaaccgcga ggttaagcca atcccacaaa 1260

tctgttctca gttcggatcg cagtctgcaa ctcgactgcg tgaagctgga atcgctagta 1320

atcgcggatc agcatgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac 1380

accacgagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc ttttaggagc cagccgccga 1440

agtgacagaa tg 1452