阅读说明：本技术 一种利用柱层析从牡丹籽油中分离高纯度α-亚麻酸的方法 (Method for separating high-purity α -linolenic acid from peony seed oil by utilizing column chromatography ) 是由 刘政安 王占忠 舒庆艳 于 2019-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用柱层析从牡丹籽油中分离高纯度α-亚麻酸的方法,包括如下步骤：(1)将牡丹籽油初提得到纯度在60±2％的初提α-亚麻酸；(2)固定相负载银离子的氧化铝的制备；(3)装柱；(4)洗脱；(5)分别收集洗脱液,每个梯度分别收集一份,依次命名为F0,F1,F2,F3,F4,F5,将F5减压蒸馏,用石油醚溶解,加入饱和NaCl水溶液去除Ag<Sup>+</Sup>,在有机相中加入无水硫酸钠,抽滤后减压蒸馏石油醚,即得高纯度α-亚麻酸。本发明根据柱层析法的分离原理即物质在固定相上吸附力不同而使物质得到分离,本方法提取到的α-亚麻酸纯度较高,为98％以上。满足分析、医药、保健品等行业的需要。(The invention discloses a method for separating high-purity α -linolenic acid from peony seed oil by using column chromatography, which comprises the following steps of (1) primarily extracting peony seed oil to obtain primarily extracted α -linolenic acid with the purity of 60 +/-2%, (2) preparing alumina with a fixed phase loaded with silver ions, (3) filling a column, (4) eluting, (5) respectively collecting eluent, and respectively collecting one part of each gradient, wherein the parts are sequentially named as F0, F1, F2, F3, F4 and F5, distilling F5 under reduced pressure, dissolving with petroleum ether, and adding saturated petroleum ether to dissolveAnd NaCl aqueous solution to remove Ag + The invention separates the substances according to the separation principle of column chromatography, namely, different adsorption forces of the substances on a fixed phase, and the purity of the extracted α -linolenic acid is higher and more than 98 percent, thereby meeting the requirements of industries such as analysis, medicine, health care products and the like.)

一种利用柱层析从牡丹籽油中分离高纯度α-亚麻酸的方法

技术领域

本发明涉及亚麻酸的制备方法，特别的涉及一种利用柱层析从牡丹籽油中分离高纯度α-亚麻酸的方法。

背景技术

牡丹，芍药科、芍药属植物，油用牡丹是一种重要的油料资源，由牡丹籽提取出的植物油—牡丹籽油是我国特有的木本坚果油，它营养丰富而独特，且具有良好的医疗保健功效，因而被有关专家称为“世界上最好的油”。牡丹籽油是植物油中的珍品，其于2011年3月22日正式获批成为我国新资源食品。已有研究表明，牡丹籽油具有体内外抗氧化作用，降血脂、降血糖和防晒等生理活性，其开发和应用引起了广泛关注。经检测分析，牡丹籽油中不饱和脂肪酸含量高达91.73％，其中油酸含量为22.83％左右，亚油酸含量为26.69％左右，α-亚麻酸含量占油脂总含量的40％左右，是橄榄油的数倍。

随着医学、生物、食品等领域快速发展，亚麻酸受到了愈来愈广泛的关注。α-亚麻酸与动物的生长、发育紧密相关，是生物活性物质***素和白三烯的前体,是生物膜尤其是视网膜、大脑的重要脂质成分。动物试验和临床观察结果表明:α-亚麻酸具有很强的增长智力，保护视力，降低血脂，胆固醇，抗血栓，延缓衰老，抗过敏，抑制癌症的发生和转移等功效。然而α-亚麻酸是人和哺乳动物体内不能合成的不饱和脂肪酸，因此从植物油脂中提取分离α-亚麻酸具有潜在的应用价值。

目前分离不饱和脂肪酸的方法主要有：尿素包合法、超临界流体萃取法、分子蒸馏法、银离子配位法、吸附分离法等，其中低温结晶法、尿素包合法等传统分离方法，具有投资少、工艺简单等优点，但存在产品纯度低等问题，达不到高纯度α亚麻酸的应用要求，极大限制其在保健品及医药品中的应用及附加值的提升。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种利用柱层析从牡丹籽油中分离高纯度α-亚麻酸的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种利用柱层析从牡丹籽油中分离高纯度α-亚麻酸的方法，包括如下步骤：

(1)将牡丹籽油初提得到纯度在60±2％的初提α-亚麻酸；

(2)固定相负载银离子的氧化铝的制备；

(3)按比例，将30-50克固定相加入90-150mL***和石油醚的混合溶液中，所述***和石油醚的体积比为1-3：1，搅拌排除气泡，静置1-2h，置于避光(黑纸包裹)的层析柱内，静置1-2h，得到负载银离子的氧化铝层析柱；

(4)称取步骤(1)获得的初提α-亚麻酸，滴入到负载银离子的氧化铝层析柱上，使用梯度流动相进行洗脱，流速为1-2.5mL/min；所述梯度流动相为混合液二与混合液一的体积比依次为0％、1％、2％、3％、4％、5％的溶液；所述混合液一由体积比为1-3：1的***与石油醚组成；所述混合液二为体积比为2～4：8～6的乙酸乙酯与丙酮组成；

(5)分别收集洗脱液，每个梯度分别收集一份，依次命名为F0，F1，F2，F3，F4，F5，将F5在真空度为-0.05MPa～-0.1MPa，温度为45℃～55℃条件下减压蒸馏10min～30min除去流动相有机溶剂，用石油醚溶解，加入饱和NaCl水溶液去除Ag⁺，在有机相中加入无水硫酸钠，抽滤后减压蒸馏石油醚，即得高纯度α-亚麻酸。

步骤(4)初提α-亚麻酸与层析柱内的负载银离子的氧化铝的质量比为1：12。

层析柱内的负载银离子的氧化铝质量与每个梯度流动相体积的比例(3-5)g：(20-32)mL。

本发明的优点：

本发明根据柱层析法的分离原理即物质在固定相上吸附力不同而使物质得到分离，同时利用银化氧化铝柱层析中银离子能与不饱和脂肪酸的碳-碳双键形成络合物来分离提取α-亚麻酸，本方法提取到的α-亚麻酸纯度较高，为98％以上。满足分析、医药、保健品等行业的需要。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

将牡丹籽油初提得到纯度在60±2％的初提α-亚麻酸：

将牡丹籽油样品与质量浓度为3％的NaOH溶液混合，NaOH溶液的溶剂为体积浓度为90％乙醇水溶液，皂化。减压蒸馏除去乙醇，再加入10％的H₂SO₄水溶液，搅拌均匀，分离油相，水洗3次至中性，用无水硫酸钠干燥后得到混合脂肪酸。将混合脂肪酸加入丙酮溶解，用冷冻结晶法-10℃下结晶离心除去饱和度较低脂肪酸后制得纯度在60％左右(60±2％)的α-亚麻酸。

实施例2

固定相负载银离子的氧化铝的制备；

避光条件下，将5gAgNO₃溶于25mL体积浓度70％的乙醇水溶液，加入100g中性氧化铝(商品)，搅拌10min，减压蒸馏除去乙醇，将固体避光、在120±2℃放置10小时，冷却至室温，得到负载银离子的氧化铝，为固体相；储存在棕色干燥器备用。

实施例3

一种利用柱层析从牡丹籽油中分离高纯度α-亚麻酸的方法，步骤如下：

(1)将牡丹籽油初提得到纯度在62％的初提α-亚麻酸(实施例1方法制备)；

(2)固定相负载银离子的氧化铝的制备(实施例2)；

(3)装柱：将30g固定相加入到90mL体积比为1：1***和石油醚混合液中，搅拌排除气泡，静置1h使其充分溶胀，将其置于黑纸包裹的避光的层析柱内，静置1h溶胀沉淀，得到负载银离子的氧化铝层析柱；

(4)洗脱：将层析柱中溶剂从柱底排出，直到距固定相面0.5cm，称取2.5g步骤(1)获得的初提α-亚麻酸，滴入到负载银离子的氧化铝层析柱上，使用梯度流动相进行洗脱，流速为1mL/min；所述梯度流动相为混合液二与混合液一的体积比依次为0％、1％、2％、3％、4％、5％的溶液；所述混合液一由体积比为1：1的***与石油醚组成；所述混合液二为体积比为2：8的乙酸乙酯与丙酮组成；每一梯度梯度流动相为200mL；

(5)分别收集洗脱液，每个梯度分别收集一份，依次命名为F0，F1，F2，F3，F4，F5，将F5在真空度为-0.05MPa，温度为45℃条件下减压蒸馏30min除去流动相有机溶剂，用石油醚溶解，加入饱和NaCl水溶液去除Ag⁺，在有机相中加入无水硫酸钠，抽滤后减压蒸馏石油醚，即得高纯度α-亚麻酸。

(6)α-亚麻酸含量测定：利用气相色谱-质谱(gas chromatography massspectrometry，GC-MS)对产物α-亚麻酸含量进行测定，所得α-亚麻酸纯度为98％。

α-亚麻酸含量测定具体步骤如下：

脂肪酸的甲酯化：

1)试管中加入1.0mL硫酸甲醇溶液(5％硫酸+95％甲醇)，充满氮气后密封。90℃水浴1h。

2)置于室温下冷却后，在试管中加入1.5mL正戊烷和1.0mL水，振荡混匀，终止甲基化反应。

3)振荡后2500rpm，离心10min，收集上清液1.0mL，氮气浓缩后加入5.0mL重蒸的正己烷。

4)取980μL提取液样品，加入20μL内标(十七烷酸)迅速混匀，用0.22um有机相微孔滤器过滤到样品瓶中，用于GC-MS分析。

标准品的制备：标准品包括混合脂肪酸中5个主要成分棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸(均购自美国Sigma-Aldrich公司(Shanghai，China))，以牡丹籽油中不存在的十七烷酸(购自美国Sigma-Aldrich公司(Shanghai，China))作为内标。将标准品配成一系列不同浓度的标准溶液，浓度梯度包括0.015625mg/mL，0.03125mg/mL、0.0625mg/mL L、0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL和1.0mg/mL，取980μL不同浓度的该标准溶液，分别加入20μL内标物，密封在样品瓶中，-20℃储存备用。

脂肪酸甲酯的GC-MS分析：

测试标准品与分析样品所用的分析系统为Agilent GC-MS，色谱柱为HP-88聚硅氧烷聚合物色谱柱，30m×0.25mm，0.20μm，(Agilent，美国)。所用的升温程序如下：100℃保持2min，然后以15℃/min升至230℃，保持5min，进样口温度250℃，分流进样，分流比为10:1，进样体积1μL，载气为高纯氦气，流速1.0mL/min；电离方式为EI，电子能量70eV，传输线温度280℃，离子源温度230℃，四级杆温度150℃，质量扫描范围(m/z)：30～450u，采用NIST05Library标准谱库检索和与标准品比对定性。

脂肪酸的定量分析：

利用内标标准曲线法进行线性回归定量。首先分别测试加入内标的一系列标准品，以标准品浓度为横坐标(x)，相对应的标准品与内标物峰面积比为纵坐标(y)，进行线性回归，制作标准曲线。然后在相同的色谱条件下测出待测样品和内标物的峰面积之比，由此比值可在标准曲线上查出样品中待测组分的浓度，进而可以计算出待测组分在样品中的α-亚麻酸的含量。

实施例4

一种利用柱层析从牡丹籽油中分离高纯度α-亚麻酸的方法，步骤如下：

(1)将牡丹籽油初提得到纯度在58％的初提α-亚麻酸(实施例1方法制备)；

(2)固定相负载银离子的氧化铝的制备(实施例2)；

(3)装柱：将50g固定相加入到150mL体积比为3：1***和石油醚混合液中，搅拌排除气泡，静置2h使其充分溶胀，将其置于黑纸包裹的避光的层析柱内，静置2h溶胀沉淀，得到负载银离子的氧化铝层析柱；

(4)洗脱：将层析柱中溶剂从柱底排出，直到距固定相面0.5cm，称取2.5g步骤(1)获得的初提α-亚麻酸，滴入到负载银离子的氧化铝层析柱上，使用梯度流动相进行洗脱，流速为2.5mL/min；所述梯度流动相为混合液二与混合液一的体积比依次为0％、1％、2％、3％、4％、5％的溶液；所述混合液一由体积比为3：1的***与石油醚组成；所述混合液二为体积比为3：7的乙酸乙酯与丙酮组成；每一梯度梯度流动相为320mL；

(5)分别收集洗脱液，每个梯度分别收集一份，依次命名为F0，F1，F2，F3，F4，F5，将F5在真空度为-0.1MPa，温度为55℃条件下减压蒸馏10min除去流动相有机溶剂，用石油醚溶解，加入饱和NaCl水溶液去除Ag⁺，在有机相中加入无水硫酸钠，抽滤后减压蒸馏石油醚，即得纯度99％α-亚麻酸。

实施例5

一种利用柱层析从牡丹籽油中分离高纯度α-亚麻酸的方法，步骤如下：

(1)将牡丹籽油初提得到纯度在60％的初提α-亚麻酸(实施例1方法制备)；

(2)固定相负载银离子的氧化铝的制备(实施例2)；

(3)装柱：将30g固定相加入到90mL体积比为1：1***和石油醚混合液中，搅拌排除气泡，静置2h使其充分溶胀，将其置于黑纸包裹的避光的层析柱内，静置2h溶胀沉淀，得到负载银离子的氧化铝层析柱；

(4)洗脱：将层析柱中溶剂从柱底排出，直到距固定相面0.5cm，称取2.5g步骤(1)获得的初提α-亚麻酸，滴入到负载银离子的氧化铝层析柱上，使用梯度流动相进行洗脱，流速为2mL/min；所述梯度流动相为混合液二与混合液一的体积比依次为0％、1％、2％、3％、4％、5％的溶液；所述混合液一由体积比为2：1的***与石油醚组成；所述混合液二为体积比为4：6的乙酸乙酯与丙酮组成；每一梯度梯度流动相为200mL；

(5)分别收集洗脱液，每个梯度分别收集一份，依次命名为F0，F1，F2，F3，F4，F5，将F5在真空度为-0.1MPa，温度为55℃条件下减压蒸馏10min除去流动相有机溶剂，用石油醚溶解，加入饱和NaCl水溶液去除Ag⁺，在有机相中加入无水硫酸钠，抽滤后减压蒸馏石油醚，即得纯度99％α-亚麻酸。

本发明根据柱层析法的分离原理，结合牡丹籽油脂肪酸组成设计固定相及流动相组成。牡丹籽油脂肪酸主要组成为油酸，亚油酸及亚麻酸，三种组分双键数量依次增加，极性依次增加。因此，本发明其一利用不同饱和程度的脂肪酸在固定相氧化铝上的吸附力不同，组分极性越强，吸附力越大。其二利用银离子能与不饱和脂肪酸的碳-碳双键形成络合物，双键数量越多，络合作用力越强。即亚麻酸与层析固定相作用力最强，其次为亚油酸，最后为油酸。利用洗脱液依次洗脱各组分来分离纯化α-亚麻酸，本方法提纯的α-亚麻酸纯度较高，能很好满足分析、医药、保健品等行业的需要。

本发明将具有保健价值的牡丹籽油作为主要原料，将其中主要功效且难以分离的α-亚麻酸单独提取出来，提高了牡丹籽油的商业价值。