阅读说明：本技术 蛋白质ZmPT3在调控植物磷含量中的应用 (Application of protein ZmPT3 in regulation and control of phosphorus content in plants ) 是由 陈益芳 武维华 王芳 于 2018-07-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了蛋白质ZmPT3在调控植物磷含量中的应用。向玉米自交系B73中导入蛋白质ZmPT3的编码基因,得到转基因玉米OE-1和OE-2。在幼苗期,与玉米自交系B73相比,OE-1和OE-2的幼叶和茎的磷含量和生物量均显著增加；在散粉期,与玉米自交系B73相比,OE-1和OE-2的穗位叶和雌穗的磷含量显著增加。因此,蛋白质ZmPT对于进一步阐明植物磷营养的分子机理并通过基因工程的技术手段培育磷营养高效的作物新品种具有重要的理论意义和实践意义。本发明具有重大的应用价值。(The invention discloses application of protein ZmPT3 in regulation and control of phosphorus content in plants. The coding gene of protein ZmPT3 is introduced into a maize inbred line B73 to obtain transgenic maize OE-1 and OE-2. At the seedling stage, compared with the maize inbred line B73, the phosphorus content and biomass of the young leaves and stems of OE-1 and OE-2 are both significantly increased; in the pollen-dispersing period, the phosphorus content of ear position leaves and female ears of OE-1 and OE-2 is obviously increased compared with that of the maize inbred line B73. Therefore, the protein ZmPT has important theoretical significance and practical significance for further clarifying the molecular mechanism of plant phosphorus nutrition and cultivating new crop varieties with high phosphorus nutrition efficiency by a technical means of genetic engineering. The invention has great application value.)

蛋白质ZmPT3在调控植物磷含量中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质ZmPT3在调控植物磷含量中的应用。

背景技术

磷是植物必需大量元素之一，参与植物的细胞构成、生长发育、物质代谢和能量代谢等。植物主要通过根系从土壤中吸收无机磷，进而转移到地上部，参与植物的生长发育。土壤溶液中有效磷的浓度极低，一般低于10μM。而植物细胞的磷浓度一般维持在毫摩尔(mM)水平，因此，植物经常面临低磷胁迫。为保证植物正常生长和提高产量，人们大量施用磷肥。磷肥施入土壤后，容易被土壤中的重金属等固定，成为不容易被植物吸收的磷，磷肥当季利用效率一般低于30％，磷肥大量被浪费，同时还污染环境。因此，植物的磷吸收效率低成为农业生产的重要限制因素。

玉米是禾本科草本植物，学名玉蜀黍。中国各地都有种植，尤以东北、华北和西南各省较多。玉米是粗粮中的保健佳品，食用玉米对人体健康颇为有利。玉米在我国粮食安全中起着极其重要的作用，是重要的饲料作物，又是食品、化工、燃料、医药等行业的重要原料。磷对玉米的生长发育、籽粒产量和质量有重要作用。磷素充足时，玉米早熟，籽粒色泽和品质好，产量高。玉米幼苗期缺磷，会导致玉米生长缓慢，硝态氮积累，蛋白质合成受阻，叶片呈现***。雌雄穗分化时缺磷，则果穗发育受阻，穗顶绕缩，易形成空秆。授粉期缺磷，则授粉不良，果穗卷曲，导致缺行、缺粒或秃尖，品质下降。

提高玉米的磷吸收和再分配效率将有助于提高玉米对磷肥的利用效率，减少磷肥的施用，减少环境污染。

发明内容

本发明的目的是促进植物在低磷条件下对磷的吸收和再分配。

本发明首先保护蛋白质ZmPT3的应用，可为如下X1)至X6)中的至少一种；

X1)调控植物的磷含量；

X2)调控植物的生长；

X3)调控植物的生物量；

X4)调控植物的磷元素转移；

X5)调控植物在低磷条件下的磷吸收；

X6)培育磷含量增加和/或促进生长和/或生物量增加和/或促进磷元素向生长中心转移和/或耐低磷的植物。

上述应用中，所述蛋白质ZmPT3可为a1)或a2)或a3)：

a1)氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白质；

a2)在序列表中序列1所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到具有相同功能相关的蛋白质。

其中，序列表中序列2由535个氨基酸残基组成。

为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列1所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1.标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
FLAG	8	DYKDDDDK
			Strep-tag II	8	WSHPQFEK
c-myc	10	EQKLISEEDL

上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

本发明还保护编码所述蛋白质ZmPT3的核酸分子的应用，可为如下X1)至X6)中的至少一种；

X1)调控植物的磷含量；

X2)调控植物的生长；

X3)调控植物的生物量；

X4)调控植物的磷元素转移；

X5)调控植物在低磷条件下的磷吸收；

X6)培育磷含量增加和/或促进生长和/或生物量增加和/或促进磷元素向生长中心转移和/或耐低磷的植物。

上述应用中，编码所述蛋白质ZmPT3的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是序列表中序列2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmPT3的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmPT3的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列2由1608个核苷酸组成，编码序列表中序列1所示的氨基酸序列。

上述任一所述的应用中，所述调控植物的磷含量可为增加植物的磷含量。所述调控植物的生长可为促进植物的生长。所述调控植物的生物量可为增加植物的生物量。所述调控植物的磷元素转移可为促进植物的磷元素转移。所述调控植物在低磷条件下的磷吸收可为促进植物在低磷条件下的磷吸收。

本发明还保护一种培育转基因植物的方法，可包括向受体植物中导入提高所述蛋白质ZmPT3的表达量和/或活性的物质，得到转基因植物的步骤；

所述转基因植物满足如下(d1)至(d5)的至少一种表型：

(d1)磷含量高于所述受体植物；

(d2)生物量高于所述受体植物；

(d3)耐低磷性高于所述受体植物；

(d4)生长速度快于所述受体植物；

(d5)磷元素向生长中心转移程度高于所述受体植物。

上述方法中，所述“向受体植物中导入提高所述蛋白质ZmPT3的表达量和/或活性的物质”可通过向受体植物中导入编码蛋白质ZmPT3的核酸分子实现。

上述方法中，所述编码蛋白质ZmPT3的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：

b1)编码区是序列表中序列2所示的DNA分子；

b2)核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

b3)与b1)或b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmPT3的DNA分子；

b4)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，来源于玉米且编码所述蛋白质ZmPT3的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

其中，序列表中序列2由1608个核苷酸组成，编码序列表中序列1所示的氨基酸序列。

上述方法中，所述“向受体植物中导入编码蛋白质ZmPT3的核酸分子”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体***编码蛋白质ZmPT3的核酸分子得到的重组质粒。

所述重组载体具体可为重组质粒UBI:ZmPT3。重组质粒UBI:ZmPT3具体可为向载体pCXUN的限制性内切酶XcmI的识别位点***序列表的序列2所示的双链DNA分子，得到的重组质粒。

本发明还保护一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质ZmPT3的表达量和/或活性，从而提高植物的磷含量和/或生物量和/或耐低磷性和/或生长速度和/或磷元素向生长中心转移程度。

上述植物育种方法中，所述“增加植物中所述蛋白质ZmPT3的表达量和/或活性”可通过多拷贝、改变启动子、调控因子、转基因等本领域熟知的方法，达到增加植物中所述蛋白质ZmPT的含量和/或活性的效果。

上述任一所述磷含量可为无机磷含量和/或总磷含量。

上述任一所述生物量可为根部干重和/或冠部干重。

上述任一所述磷元素转移可为磷元素向生长中心转移。

上述任一所述植物可为c1)或c2)或c3)或c4)或c5)或c6)：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)玉米；c4)玉米自交系B73；c5)十字花科植物；c6)拟南芥。

上述任一所述方法在植物育种中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述增加植物的磷含量可为增加玉米幼苗期时幼叶或茎的磷含量。

上述任一所述增加植物的磷含量可为增加玉米散粉期是穗位叶或雌穗的磷含量。

上述任一所述低磷可为磷含量低于10μM。

向玉米自交系B73中导入ZmPT3基因，得到转基因玉米OE-1和OE-2。在幼苗期，与玉米自交系B73相比，OE-1和OE-2的幼叶和茎的磷含量和生物量均显著增加；在散粉期，与玉米自交系B73相比，OE-1和OE-2的穗位叶和雌穗的磷含量显著增加。因此，蛋白质ZmPT对于进一步阐明植物磷营养的分子机理并通过基因工程的技术手段培育磷营养高效的作物新品种具有重要的理论意义和实践意义。

附图说明

图1为转基因玉米的鉴定。

图2为转基因玉米的表型和生物量检测。

图3为转基因玉米的无机磷含量和总磷含量检测。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

玉米自交系B73记载于如下文献中：Wei et al.Thephysical and geneticframework of the maize B73 genome.PLoS Genetics 2009，5：e1000715。玉米自交系B73在该文献中的名称为Maize B73。

农杆菌EHA105记载于如下文献中：Nyaboga et al.Agrobacterium-mediatedgenetic transformation of yam(Dioscorearotundata)：an important tool forfunctional study of genes and crop improvement.Frontiers in PlantScience2014，5：463。

Hogaland营养液(记载于如下文献中：Liang and Li,Differences in cluster-root formation and carboxylate exudation inLupinusalbusL.under differentnutrient deficiencies.Plant and Soil 2003，248:221–227)：溶剂为水；溶质及其浓度如下：0.75mMK₂SO₄，0.25mM KH₂PO₄，0.1mM KCl，0.65mM MgSO₄，2mM Ca(NO₃)₂，0.1mMFeNaEDTA，1μM H₃BO₃，1μM MnSO₄，1μM ZnSO₄，4μM CuSO₄，5μM(NH₄)₆Mo₂O₄。

5×Phusion HF Buffer、Phusion DNA Polymerase和限制性内切酶XcmI均为NEB公司的产品。SUPERSCRIPT^II和Trizol均为Invitrogen公司的产品。10×PCR缓冲液为TaKaRa公司的产品。

实施例1、ZmPT3蛋白及其编码基因的发现

采用Trizol提取玉米自交系B73幼苗的总RNA(约100-200mg)，经甲醛变性RNA琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性。按照SUPERSCRIPT^II的使用说明合成单链cDNA。将合成的单链cDNA稀释10倍并作为模板DNA，采用ZmPT3-F和Primer 2组成的引物对进行PCR反应。

ZmPT3-F：5'-tataagcttATGGCACACGATCACAAGGT-3'；

Primer 2：5'-gctctagaTTATTCACTCAAATCTGTCGGCAC-3'。

PCR体系(50μL)：10μL 5×Phusion HF Buffer，4μL dNTP mix(dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为2.5mM)，2.5μL ZmPT3-F水溶液(浓度为10μM)，2.5μLPrimer 2水溶液(浓度为10μM)，1μL模板DNA，1.5μL DMSO，0.5μLPhusion DNA Polymerase(浓度为2U/μL)，余量为水。

PCR程序：98℃预变性3min；98℃15s，63℃30s，72℃1min20s，35个循环；72℃延伸10min。

回收约1620bp的PCR产物，连接到pMD18-T载体，依次进行酶切和测序鉴定。测序结果表明，PCR产物中具有序列表的序列2所示的开放阅读框，编码序列表的序列1所示的蛋白质。

将序列表的序列1所示蛋白质命名为ZmPT3蛋白。将ZmPT3蛋白的编码基因命名为ZmPT3基因，其开放阅读框如序列表的序列2所示。ZmPT3连接到pMD18-T载体上构建的重组质粒命名为pMD18-ZmPT3。

实施例2、利用ZmPT3基因培育磷含量增加的转基因植物

一、重组表达载体的构建

1、以pMD18-ZmPT3重组质粒作为模板DNA，采用ZmPT3-F和ZmPT3-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

ZmPT3-F：5'-tataagcttATGGCACACGATCACAAGGT-3'；

ZmPT3-R：5-gactagtTTATTCACTCAAATCTGTCGGCAC-3’。

2、使用Taq酶对步骤1得到的PCR扩增产物的平末端进行补A，使其具有A粘末端。

3、采用限制性内切酶XcmI酶切载体pCXUN(GenBank：FJ905215.1)，使其线性化并具有T粘末端。

4、通过TA克隆方法，将步骤2的产物与步骤3的产物连接，得到重组质粒UBI:ZmPT3。

根据测序结果，对重组质粒UBI:ZmPT3进行结构描述如下：在载体pCXUN的XcmI酶切位点***了序列表的序列2所示的双链DNA分子。

二、转基因玉米的获得

1、将重组质粒UBI:ZmPT3导入农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

2、用步骤1得到的重组农杆菌对受体材料的胚性愈伤组织进行遗传转化(Frameand Wang,Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation ofmaizeembryosusing a standard binary vector system.Plant Physiology 2002，129：13-22)，得到转基因玉米。受体材料为玉米自交系B73。

OE-1和OE-2为随机选取的两个纯合转基因玉米株系。

三、转基因玉米的鉴定

待测植株为OE-1的T₃代植株、OE-2的T₃代植株或玉米自交系B73的植株。

(一)ZmPT3***鉴定

1、将待测植株培养至三叶一心期，剪取叶片并提取基因组DNA。

2、以步骤1提取的基因组DNA为模板，采用Ubip-F和ZmPT3-R组成的引物对(靶序列约为1600bp)进行PCR扩增。

Ubip-F：5’-TTGATCTTGATATACTTGGATG-3’；

ZmPT3-R：5’-gactagtTTATTCACTCAAATCTGTCGGCAC-3’。

PCR扩增的反应体系(20μL)：10×PCR缓冲液2μL，0.4μL dNTP mix(dATP、dTTP、dGTP和dCTP的浓度均为2.5mM)，0.4μLUbip-F水溶液(浓度为10μM)、0.4μL ZmPT3-R水溶液(浓度为10μM)、0.2μLTaq DNA聚合酶(浓度为15U/μL)，余量为水。

PCR扩增的反应条件：95℃预变性5min；95℃30s，63℃30s，72℃1min40s，35个循环；72℃延伸10min。

按照上述步骤，将Ubip-F替换为ZmPT3-F，其它步骤均不变。

部分PCR扩增结果见图1中A。OE-1和OE-2均为转ZmPT3基因玉米，***了重组质粒UBI:ZmPT3。

(二)ZmPT3基因表达鉴定

1、将待测植株培养至三叶一心期，取整株，提取总RNA并反转录为cDNA。

2、以步骤1得到的cDNA为模板，采用ABI公司7500型Real-Time PCR System(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)、ABI POWER SYBR GREEN PCR MASTER MIX试剂盒、Primer 4和Primer 5组成的引物对，进行实时定量PCR(qRT-PCR)。ZmUBQ基因为内参基因。

Primer 4：5’-ATGGCACACGATCACAAGGT-3’；

Primer 5：5’-GTCCGAGTAGTAGATGCGGC-3’。

部分检测结果见图1中B。qRT-PCR结果显示，OE-1、OE-2中ZmPT3基因的表达量均显著高于玉米自交系B73。

四、转基因玉米的表型检测

磷充足培养基：取

caly矿石(Goron，T.L.，Watts，S.，Shearer，C.andRaizada，M.N.2015，Growth in

clay permits root hair phenotyping alongthe entire crown root in cereal crops and demonstrates that root hair growthcan extend well beyond the root hair zone.BMC Res.Notes.8，143.)加入0.43g尿素、0.11g KCl、0.38gKH₂PO₄、0.25g MgSO₄·7H₂O、1mL1000×微量(含1mM H₃BO₃、1mM MnSO₄、1mMZnSO₄、4mM CuSO₄和5mM(NH₄)₆Mo₂O₄的水溶液)和10mL100×铁盐(含10mM FeNaEDTA的水溶液)，得到磷充足培养基。

低磷培养基：仅将磷充足培养基中0.38gKH₂PO₄替换为0.076gKH₂PO₄，其余与磷充足培养基的成分和含量完全一致。

待测种子为OE-1的T₃代种子、OE-2的T₃代种子或玉米自交系B73的种子。

(一)转基因玉米的表型检测

1、取在湿润滤纸上萌发36h的待测种子，播种至装有5Kg磷充足培养基或低磷培养基的花盆，25±2℃培养45天，得到待测植株。

2、完成步骤1后，观察待测植株的冠部和根部并分别拍照。

部分待测植株的冠部见图2中A。部分待测植株的根部见图2中C。结果表明，在磷充足的条件下，玉米自交系B73、OE-1和OE-2的冠部的表型无显著差异；在低磷胁迫条件下，与玉米自交系B73相比，OE-1和OE-2冠部明显较大、具有显著的生长优势；在磷充足的条件下和低磷胁迫条件下，与玉米自交系B73相比，OE-1和OE-2的根部均明显较大。

上述结果表明，提高ZmPT3基因的表达量能促进玉米苗期生长。

(二)转基因玉米根部和冠部的生物量检测

实验重复三次取平均值，每次重复的待测种子数为30粒。

取在湿润滤纸上萌发36h的待测种子，播种至装有5Kg磷充足培养基或低磷培养基的花盆，25±2℃培养45天，得到待测植株。对待测植株的冠部生物量(DW)和根部生物量(DW)进行统计分析。待测植株的冠部生物量(DW)为待测植株的冠部在烘箱中80℃烘干至恒重，放入干燥器内冷却后的质量。待测植株的根部生物量(DW)为待测植株的根部在烘箱中80℃烘干至恒重，放入干燥器内冷却后的质量。

部分待测植株的冠部生物量(DW)统计结果见图2中B。部分待测植株的根部的生物量(DW)统计结果见图2中D。结果表明，在磷充足的条件下，玉米自交系B73、OE-1和OE-2的冠部生物量(DW)无显著差异，但OE-1和OE-2根部的生物量(DW)显著大于玉米自交系B73；在低磷胁迫条件下，OE-1和OE-2根部的生物量(DW)和冠部的生物量(DW)均显著大于玉米自交系B73。

上述结果表明，提高ZmPT3基因的表达量能提高玉米的根部的生物量(DW)和冠部的生物量(DW)。

(三)转基因玉米无机磷含量检测

EP管的规格为10mL。

显色反应储液：向3.5g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O和23.39mL 98％硫酸中加入适量去离子水，充分溶解，然后用去离子水定容至1L。

显色反应工作液：取显色反应储液，加入抗坏血酸，得到显色反应工作液；显色反应工作液中抗坏血酸的浓度为1.4％(m/v)。显色反应工作液需要现用现配。

无机磷提取液：将5mL 1M Tris-HCl缓冲液(pH8.0)、1mL 0.5M EDTA(pH8.0)、2.92g NaCl、35μLβ-巯基乙醇、5mL PMSF溶于水，然后用水定容至500mL。

实验重复三次取平均值，每次重复的待测种子数为30粒。

1、取在湿润滤纸上萌发36h的待测种子，播种至装有5Kg磷充足培养基或低磷培养基的花盆，25±2℃培养45天，得到待测幼苗。

2、完成步骤1后，分别取待测幼苗的各个叶片(叶片按照生长次序从下往上计数，第1片叶为从下往上第1片，第2片叶为从下往上第2片，依次类推)和茎，记录每组样品的鲜重值，投入液氮中冻存，用研磨机粉粹样品。

3、取EP管，先加入4.3mL冰醋酸。

4、取样品管，加入70mg样品和700μL无机磷提取液(比例为10mg：100μL)，上下颠倒混匀，得到混合液。

5、取完成步骤3的EP管，加入步骤4得到的混合液。

6、取完成步骤5的样品管，加入1mL冰醋酸，上下颠倒清洗，然后转移至完成步骤5的EP管中。

7、取完成步骤6的样品管，加入1mL冰醋酸，上下颠倒清洗，然后转移至完成步骤6的EP管中。

8、完成步骤7后，取所述EP管，小心颠倒混匀，42℃水浴30min，然后4℃、4000rpm离心15min，收集上清液。

9、磷标准曲线的制作

(1)分别取KH₂PO₄标准品的母液(即KH₂PO₄标准品水溶液，浓度为1mM)0μL、5μL、10μL、20μL、40μL、60μL、80μL和100μL，用ddH₂O补至300μL，再加700μL显色反应工作液，颠倒混匀，得到磷浓度依次为0μM、5μM、10μM、20μM、40μM、60μM、80μM和100μM的稀释液。

(2)取步骤(1)得到的稀释液，42℃水浴30min，得到反应液。

(3)完成步骤2后，将200μL反应液置于酶标板，利用酶标仪检测在820nm处的吸光值。

以稀释液的浓度为横坐标，相应的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

10、用钒钼蓝法测定无机磷含量

(1)取150μL步骤8收集的上清液，加入350μL显色反应工作液，颠倒混匀，42℃水浴30min，得到反应液1。

(2)将200μL反应液1置于酶标板，利用酶标仪检测在820nm处的吸光值。

根据标准曲线，计算步骤8收集的上清液中的无机磷含量，进而得到样品中的无机磷含量。

部分实验结果见图3中A(6L为第6片叶，7L为第7片叶，8L为第8片叶，9L为第9片叶，10L为第10片叶)。结果表明，在玉米幼苗期，OE-1和OE-2的幼叶和茎的无机磷含量均显著高于玉米自交系B73。由此可见，在玉米幼苗期，与玉米自交系B73相比，OE-1和OE-2的幼叶和茎的无机磷含量显著增加。

(四)转基因玉米的总磷含量检测

实验重复三次取平均值，每次重复的待测种子数为30粒。

(1)将待测种子播种至吉林省公主岭市吉林省农科院实验基地，田间常规培养，待生长至散粉期，取下位叶、上位叶、穗位叶、雄穗和雌穗作为样品。

(2)完成步骤(1)后，取样品(下位叶、上位叶、穗位叶、雄穗或雌穗)，在烘箱中80℃烘干至恒重，放入干燥器内冷却，称量并记录干重值。

(3)完成步骤(2)后，取样品，小心放入坩埚中，先在马弗炉中300℃碳化10h，再调至575℃灰化14h，冷却后加入适量0.1N盐酸溶解过夜。

(4)取步骤(3)得到的溶解过夜的样品，按照步骤(三)3至10的方法进行检测，得到样品的总磷含量。

部分实验结果见图3中B。结果表明，在散粉期，OE-1和OE-2的穗位叶和雌穗的总磷含量均显著高于玉米自交系B73。由此可见，在散粉期，与玉米自交系B73相比，OE-1和OE-2的穗位叶和雌穗的总磷含量显著增加；提高ZmPT3基因的表达量能促进磷素向玉米生长中心转移。

<110> 中国农业大学

<120> 蛋白质ZmPT3在调控植物磷含量中的应用

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 535

<212> PRT

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 1

Met Ala His Asp His Lys Val Leu Asp Ala Leu Asp Ala Ala Lys Thr

1 5 10 15

Gln Trp Tyr His Phe Thr Ala Val Val Val Ala Gly Met Gly Phe Phe

20 25 30

Thr Asp Ala Tyr Asp Leu Phe Ser Ile Ser Leu Val Thr Lys Leu Leu

35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Tyr Ser Asp Pro Ser Ser Lys Thr Pro Gly Ser Leu

50 55 60

Pro Pro Asn Val Ser Ala Ala Val Asn Gly Val Ala Phe Cys Gly Thr

65 70 75 80

Leu Ala Gly Gln Leu Phe Phe Gly Trp Leu Gly Asp Lys Met Gly Arg

85 90 95

Lys Lys Val Tyr Gly Met Thr Leu Met Leu Met Ala Ile Cys Cys Leu

100 105 110

Ala Ser Gly Leu Ser Phe Gly Ser Thr Pro Lys Asp Val Met Val Thr

115 120 125

Leu Cys Phe Phe Arg Phe Trp Leu Gly Val Gly Ile Gly Gly Asp Tyr

130 135 140

Pro Leu Ser Ala Thr Ile Met Ser Glu Tyr Ala Asn Lys Arg Thr Arg

145 150 155 160

Gly Ala Phe Ile Ala Ala Val Phe Ala Met Gln Gly Phe Gly Asn Leu

165 170 175

Ala Gly Gly Ile Val Ala Ile Ala Val Ser Ala Ala Phe Lys Ser Arg

180 185 190

Phe Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Asp Asp Pro Ala Gly Ser Thr Val Pro

195 200 205

Gln Ala Asp Tyr Val Trp Arg Ile Val Leu Met Phe Gly Ala Val Pro

210 215 220

Ala Leu Leu Thr Tyr Tyr Trp Arg Met Lys Met Pro Glu Thr Ala Arg

225 230 235 240

Tyr Thr Ala Leu Val Ala Lys Asn Ala Lys Gln Ala Thr Ser Asp Met

245 250 255

Ala Arg Val Leu Asp Val Asp Leu Ala Glu Glu Arg Gln Lys Pro Val

260 265 270

Glu Glu Leu Glu Arg Arg Arg Glu Glu Phe Gly Leu Phe Ser Arg Gln

275 280 285

Phe Ala Lys Arg His Gly Leu His Leu Leu Gly Thr Thr Val Cys Trp

290 295 300

Phe Thr Leu Asp Ile Ala Phe Tyr Ser Gln Asn Leu Phe Gln Lys Asp

305 310 315 320

Met Tyr Ala Ala Val Asn Trp Leu Pro Arg Ala Asp Thr Met Asn Ala

325 330 335

Leu Glu Glu Met Phe Arg Ile Ser Arg Ala Gln Thr Leu Val Ala Leu

340 345 350

Cys Gly Thr Ile Pro Gly Tyr Trp Phe Thr Val Phe Phe Ile Asp Ile

355 360 365

Val Gly Arg Phe Ala Ile Gln Leu Gly Gly Phe Phe Phe Met Thr Ala

370 375 380

Phe Met Leu Gly Leu Ala Ile Pro Tyr His His Trp Thr Thr Pro Gly

385 390 395 400

His His Val Gly Phe Val Val Met Tyr Ala Leu Thr Phe Phe Phe Ala

405 410 415

Asn Phe Gly Pro Asn Ser Thr Thr Phe Ile Val Pro Ala Glu Ile Phe

420 425 430

Pro Ala Arg Leu Arg Ser Thr Cys His Gly Ile Ser Ser Ala Ala Gly

435 440 445

Lys Cys Gly Ala Ile Val Gly Ser Phe Gly Phe Leu Tyr Ala Ala Gln

450 455 460

Ser Thr Asp Pro Thr Lys Thr Asp Ser Gly Tyr Pro Pro Gly Ile Gly

465 470 475 480

Val Arg Asn Ser Leu Phe Met Leu Thr Gly Cys Asn Val Ile Gly Phe

485 490 495

Leu Phe Thr Phe Leu Val Pro Glu Ser Lys Gly Lys Ser Leu Glu Glu

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Leu Ser Gly Glu Asn Asp Glu Glu Ala Ala Pro Gln Gln Gln Gln Thr

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Val Pro Thr Asp Leu Ser Glu

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<210> 2

<211> 1608

<212> DNA

<213> 玉米(Zea mays L.)

<400> 2

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