阅读说明：本技术 一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法 (Separation and identification method of patinopecten yessoensis myofibrils ) 是由 孙秀俊 刘志鸿 周丽青 杨爱国 吴彪 田吉腾 于 2019-11-27 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法,属于海洋无脊椎动物的肌肉生物学领域,所述方法的具体步骤如下,用扇贝肌肉专用洗涤液洗带壳闭壳肌组织,加入扇贝肌肉松弛缓冲液,旋转搅拌3天；切取闭壳肌组织,加入扇贝肌肉松弛缓冲液,匀浆直至组织块完全消失；在4℃条件下离心,上清液加入扇贝肌肉松弛缓冲液,4℃条件下离心获得粗肌丝的沉淀物,用扇贝肌肉松弛缓冲液迅速吹打,立即进行涡旋混匀,离心获得上清液；上清液加入的扇贝肌肉松弛缓冲液,离心获得粗肌丝的沉淀物,再用扇贝肌肉松弛缓冲液吹打混匀,离心所得到的上清液即为纯化的粗肌丝悬浮液,可直接用于SDS-PAGE检测及电镜分析；本发明方法能够实现高效分离虾夷扇贝闭壳肌的肌原纤维。(The invention relates to a separation and identification method of comb shell myofibrils, belonging to the field of muscle biology of marine invertebrates, which comprises the following steps of washing the adductor muscle tissue with a special washing liquid for the scallop muscle, adding a relaxation buffer solution for the scallop muscle, and rotating and stirring for 3 days; cutting the adductor muscle tissue, adding scallop muscle relaxation buffer solution, and homogenizing until the tissue mass completely disappears; centrifuging at 4 deg.C, adding scallop muscle relaxation buffer solution into the supernatant, centrifuging at 4 deg.C to obtain precipitate of coarse myofilament, rapidly blowing with scallop muscle relaxation buffer solution, immediately vortex and mixing, and centrifuging to obtain supernatant; adding scallop muscle relaxation buffer solution into the supernatant, centrifuging to obtain precipitate of the coarse myofilaments, blowing and uniformly mixing with the scallop muscle relaxation buffer solution, centrifuging to obtain supernatant which is purified coarse myofilament suspension and can be directly used for SDS-PAGE detection and electron microscope analysis; the method can realize the high-efficiency separation of the myofibrils of the adductor muscles of the patinopecten yessoensis.)

一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法

技术领域

本发明属于海洋无脊椎动物的肌肉生物学领域，涉及一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法。

背景技术

不管是脊椎动物的骨骼肌，还是无脊椎动物的横纹肌，所有动物肌肉都是通过粗肌丝和细肌丝的相对滑动而实现肌肉收缩的生理功能。认识动物肌肉收缩及其调节的关键是建立肌原纤维的高效分离和纯化方法，通过X射线纤维衍射、电子顺磁共振及电子显微镜等方法进行肌纤维结构观察，查明肌原纤维的分子和超微结构特征。目前，绝大部分动物肌原纤维的分离纯化和结构解析研究主要集中在哺乳动物的骨骼肌。与脊椎动物骨骼肌相比，无脊椎动物的肌肉具有结构稳定性高、功能多样性丰富以及肌丝组装专业化程度高等特点，这为进一步解析脊椎动物肌肉结构和功能提供了重要的参考资料。然而，目前缺少分离和纯化扇贝等海洋无脊椎动物肌原纤维的有效方法，制约着扇贝等海洋无脊椎动物肌肉结构和功能的研究进程。

虾夷扇贝(Patinopecten yessoensis)属于冷水性贝类，原产地分布于日本、俄罗斯远东及朝鲜等海域，是世界扇贝科中肉质最为优良的增养殖种类之一，虾夷扇贝的成体组织和器官多种多样，不同的组织各具有独特的生理特性。虾夷扇贝的闭壳肌肥大鲜嫩、营养丰富，深受国内外消费者的亲睐，是水产市场上的高档畅销水产品。其中，闭壳肌是扇贝进行贝壳开合、机体运动和逃避敌害等的主要功能器官。深入了解虾夷扇贝肌原纤维的超微结构特征，解析扇贝肌肉的结构、功能及其分子调控机制，能够为提高扇贝出柱率和扇贝肉质性状改良等奠定理论基础和提供科学依据。因此，开发一种适应于扇贝肌原纤维的高效分离和鉴定方法，不仅有助于深入解析海洋无脊椎动物的肌肉结构和功能，而且对于加快扇贝肉质性状的遗传改良进程具有重要的理论和实践意义，并为动物肌肉生物学和肌肉进化研究提供重要的参考资料。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法，所述方法能够高效分离虾夷扇贝的肌原纤维，并提供一种扇贝肌原纤维超微结构的电镜鉴定方法，对于解析海洋贝类肌纤维超微结构特征、肌肉收缩及其调控的分子机制，具有重要的理论和应用价值。

一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法，所述方法的具体步骤如下：

步骤一，取虾夷扇贝新鲜带壳闭壳肌组织，用扇贝肌肉专用洗涤液洗去包括膜蛋白在内的杂质，加入新鲜配制的扇贝肌肉松弛缓冲液，旋转搅拌3天；

步骤二，切取闭壳肌组织，加入扇贝肌肉松弛缓冲液，使用组织匀浆器在高速模式下运行，直至扇贝肌肉组织块完全消失；

步骤三，在4℃条件下离心去除包括组织块残留在内的大颗粒，上清液加入扇贝肌肉松弛缓冲液，4℃条件下离心获得粗肌丝的沉淀物，用扇贝肌肉松弛缓冲液迅速吹打，立即进行涡旋混匀，离心获得上清液；

步骤四，上清液加入的扇贝肌肉松弛缓冲液，离心获得粗肌丝的沉淀物，再用扇贝肌肉松弛缓冲液吹打混匀，离心所得到的上清液即为纯化的粗肌丝悬浮液，可直接用于SDS-PAGE检测及电镜分析；

步骤五，吸取6μL粗肌丝悬液放到电镜专用超薄碳膜的中央，使用肌肉松弛清洗液冲洗金属网，在无菌枪头中依次吸入1％UA(醋酸双氧铀)染液、空气和肌肉激活缓冲液，冲洗金属网，自然晾干保存，在电镜下观察拍照。

进一步，在步骤一中，所述的扇贝肌肉松弛缓冲液配制方法：制备包含以下终浓度成分的混合溶液NaCl 100mM、MgCl₂3mM、EGTA 1mM、Pipes 5mM、NaH₂PO₄ 5mM、NaN₃ 1mM和MgATP 5mM，调节Ph值为7.0，0.2μm微孔滤膜过滤，高压灭菌；

进一步，在步骤一中，所述的扇贝肌肉专用洗涤液配制方法：将0.1g皂素加入100ml扇贝肌肉松弛缓冲液中，混匀直至完全溶解。

进一步，在步骤五中，所述的肌肉松弛清洗液配制方法：制备包含以下终浓度成分的混合溶液:NaAC 100mM、MgCl₂ 3mM、EGTA 0.2mM、imidazole2mM、NaN₃ 1mM和MgATP 1mM,调节Ph至7.0，0.2μm微孔滤膜过滤，高压灭菌；

进一步，在步骤五中，所述的肌肉激活缓冲液配制方法：将2mg无水CaCl₂加入到肌肉松弛清洗液中，混匀直至完全溶解。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明提供一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法，能够实现高效分离虾夷扇贝闭壳肌的肌原纤维，并提供了一种扇贝肌原纤维超微结构的电镜鉴定方法，可应用于为其他海洋贝类肌原纤维的分离和纯化，对于查明海洋贝类肌纤维超微结构特征、解析肌肉收缩及其调控的分子机制具有重要的理论和应用价值，为扇贝肌肉生物学研究提供了重要的参考资料。

附图说明

图1虾夷扇贝闭壳肌粗肌丝的电镜照片。

具体实施方式

为更加清楚的解释本发明的技术方案，结合附图对本发明进行进一步的详细说明。此处描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定发明。

实施例1

一种虾夷扇贝肌原纤维的分离和鉴定方法，具体步骤如下：

步骤一，切取虾夷扇贝新鲜带壳闭壳肌组织2-3mm直径，放入10ml无菌离心管，用8ml扇贝肌肉专用洗涤液在4℃条件下搅动3-4h，洗去膜蛋白等杂质，加入新鲜配制的扇贝肌肉松弛缓冲液，继续旋转搅拌3天，每天更换1次新的肌肉松弛缓冲液。所述的扇贝肌肉松弛缓冲液配制方法：制备包含以下终浓度成分的混合溶液NaCl 100mM、MgCl₂3mM、EGTA1mM、Pipes 5mM、NaH₂PO₄ 5mM、NaN₃ 1mM和MgATP 5mM，调节Ph值为7.0，0.2μm微孔滤膜过滤，高压灭菌。所述的扇贝肌肉专用洗涤液配制方法：将0.1g皂素加入由100ml扇贝肌肉松弛缓冲液中，混匀直至完全溶解。

步骤二，切取200-300mg闭壳肌组织，加入8ml扇贝肌肉松弛缓冲液，使用组织匀浆器在高速模式下运行5s，重复2-3次，直至肌肉组织块完全消失；

步骤三，在4℃条件下15000×g离心2min，收集上清，去除组织块残留等大颗粒，用无菌移液器吸取1ml上清液，加入4ml扇贝肌肉松弛缓冲液，4℃条件下17000×g离心20min，吸走上清液，获得粗肌丝的沉淀物，用1ml扇贝肌肉松弛缓冲液迅速吹打，立即进行涡旋混匀，然后15000×g离心2min。

步骤四，轻轻吸取1ml上清液，加入4ml的扇贝肌肉松弛缓冲液，震荡混匀，17000×g离心30min，获得粗肌丝的沉淀物，再用1ml的扇贝肌肉松弛缓冲液重新吹打混匀，15000×g离心5min。轻轻吸取上清液至新的无菌离心管，即获得纯化的粗肌丝悬浮液，即可用于SDS-PAGE检测及电镜分析；

步骤五，吸取6μL肌丝悬液放到电镜专用超薄碳膜的中央，静置1min，用吸水纸将碳膜上的水分吸干，使用肌肉松弛清洗液冲洗1-2遍金属网，吸干水分，在无菌移液器枪头中依次吸入520μL 1％UA(醋酸双氧铀)染液，再吸入60μL空气，再吸入40μL肌肉激活缓冲液，迅速按下移液器，冲洗金属网，自然晾干保存，在JEM-1200EX电镜下low-dose模式下采集的粗肌丝照片，见图1。所述的肌肉松弛清洗液配制方法：制备包含以下终浓度成分的混合溶液:NaAC100mM、MgCl₂ 3mM、EGTA0.2mM、imidazole 2mM、NaN3 1mM和MgATP 1mM,调节Ph至7.0，0.2μm微孔滤膜过滤，高压灭菌；所述的肌肉激活缓冲液配制方法：将2mg无水CaCl₂加入到肌肉松弛清洗液中，混匀直至完全溶解。