阅读说明：本技术 一种sdaA基因的启动子核酸序列、含有该核酸序列的重组菌株及其应用 (Promoter nucleic acid sequence of sdaA gene, recombinant strain containing nucleic acid sequence and application of recombinant strain ) 是由 马风勇 魏爱英 孟刚 周晓群 杨立鹏 苏厚波 贾慧萍 郭小炜 于 2019-09-29 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种sdaA基因的启动子核酸序列、含有该核酸序列的重组菌株及其应用,该启动子是在sdaA基因的野生型启动子序列中引入点突变获得。本发明的重组菌株用于发酵生产L-赖氨酸,进一步提高了L-赖氨酸的产量,而且与现有其他经改造的产L-赖氨酸菌株的改造位点没有冲突,实现了新的提高L-赖氨酸的发酵量的方式,便于推广应用。(The invention provides a promoter nucleic acid sequence of an sdaA gene, a recombinant strain containing the nucleic acid sequence and application thereof, wherein the promoter is obtained by introducing point mutation into a wild-type promoter sequence of the sdaA gene. The recombinant strain is used for producing L-lysine by fermentation, the yield of the L-lysine is further improved, and the recombinant strain has no conflict with the modification sites of other modified L-lysine-producing strains, so that a novel mode for improving the fermentation amount of the L-lysine is realized, and the popularization and the application are convenient.)

一种sdaA基因的启动子核酸序列、含有该核酸序列的重组菌 株及其应用

技术领域

本发明属于基因工程和微生物技术领域，具体涉及一种sdaA基因的启动子核酸序列、含 有该核酸序列的重组菌株及其应用。

背景技术

L-赖氨酸是人体和动物生命活动所必需的八大氨基酸之一。L-赖氨酸具有多种生理功能， 例如调节代谢平衡，促进人体发育，促进机体对谷类蛋白质和其他氨基酸的吸收，增强免疫 功能等，被广泛应用于食品添加剂、动物饲料、药物合成等各个方面。

L-赖氨酸的生产方法主要包括蛋白水解法和微生物发酵法等。其中微生物发酵法因为生 产工艺容易控制，生产能力高等优势已经成为工业上生产L-赖氨酸最常用的方法。微生物发 酵法是通过发酵可代谢合成赖氨酸的微生物，利用其微生物代谢作用，实现L-赖氨酸在发酵 液中的累积。

用于生产L-赖氨酸的微生物包括多个种属，例如棒状杆菌、芽孢杆菌、埃希氏菌等。但 是，野生型菌株产L-赖氨酸的能力差，代谢副产物多，难以实现高纯度和高产量L-赖氨酸的 制备。因此，通常需要获得高产L-赖氨酸的菌株。目前，获得高产菌株的方法主要包括诱变 筛选育种或者基因工程育种。诱变育种是指通过紫外照射或者其他外界条件刺激，诱导菌株 发生不特定的基因位点突变，然后通过筛选获得高产菌株，这种方法缺乏方向性，基因突变 位点难以控制，对菌株性能的预期性差。基因工程是通过明确的基因改造方式来优化选育菌 株，例如通过增加拷贝或者定点突变导入酶活性提高的有益的酶基因，或者通过敲除不理基 因使酶活性/表达消失。谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)作为使用最普遍的产L- 赖氨酸菌种，其通过二氨基庚二酸(DAP)途径等代谢过程合成L-赖氨酸。获得高产L-赖氨酸 的谷氨酸棒状杆菌对于L-赖氨酸生产具有非常重要的意义。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种启动子核苷酸序列、含有该核苷酸序列的重组菌 株、所述重组菌株的构建方法、和所述重组菌株用于发酵生产L-赖氨酸的应用。本发明通过 对sdaA基因的启动子区域核苷酸序列进行定点突变，得到高产L-赖氨酸的突变重组菌株， 用于发酵产L-赖氨酸时，相比于野生型启动子区域，L-赖氨酸产量明显提高。

本发明采用如下技术方案实现：

本发明的第一方面，提供一种启动子核苷酸序列，所述启动子核苷酸序列包含SEQID NO:1所示的野生型启动子区域核苷酸序列第-303bp位发生突变的核苷酸序列。在本发明的一 个实施方案中，所述启动子作为sdaA基因的启动子。

根据本发明，所述突变是指所述位点的碱基/核苷酸发生变化，所述突变方法可以选自诱 变、PCR定点突变法、和/或同源重组等方法中的至少一种。

根据本发明，所述启动子核苷酸序列第-303bp位由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C)。具 体地，所述启动子核苷酸序列如下：

(a)SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；

或者是(b)与SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列具有90％以上同一性的核苷酸序列，且 其保留(a)所述启动子的增强活性，并且第-303bp位保持为胞嘧啶(C)。

本发明的第二方面，提供包含上述启动子的表达盒，包含所述启动子和可操纵地连接在 所述启动子后的编码序列。在本发明的一个实施方案中，所述编码序列为sdaA基因的编码序 列。

本发明的第三方面，提供一种包含上述启动子核苷酸序列的重组载体。

根据本发明，将上述突变的启动子核苷酸序列与穿梭质粒相连接来构建所述重组载体； 作为本发明的一个实施方案，所述穿梭质粒为pK18mobsacB质粒。

本发明的第四方面，提供一种包含上述启动子核苷酸序列的重组菌株。

根据本发明的重组菌株，其包含SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。所述SEQ ID NO:2所 示的核苷酸序列为sdaA基因的启动子区域；进一步地，所述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序 列连接sdaA基因编码序列。具体地，所述重组菌株可以包括如第二方面所述表达盒或者如第 三方面所述的重组载体，或者所述重组菌株由表达盒或者重组载体转化得到。

根据本发明的重组菌株，是将上述突变的启动子核苷酸序列导入宿主菌株中重组形成； 所述宿主菌株可以选自本领域已知的产L-赖氨酸的菌株，例如选自棒杆菌、大肠杆菌中的至 少一种，所述棒杆菌可以为谷氨酸棒杆菌、北京棒杆菌；优选谷氨酸棒杆菌。作为本发明的 一个实施方案，所述宿主菌株为YP097158(保藏编号：CGMCC No.12856，保藏日期：2016 年8月16日)。

根据本发明的重组菌株，是以pK18mobsacB质粒为载体。

根据本发明的重组菌株，还可进一步包括或不包括其他改造。

本发明的第五方面，还提供一种产L-赖氨酸的重组菌株的构建方法，包括如下步骤：

改造如SEQ ID NO:1所示的sdaA基因的野生型启动子区域，使其第-303bp位核苷酸发 生突变，得到包含突变的启动子区域的产L-赖氨酸重组菌株。

根据本发明，所述突变是指所述启动子核苷酸序列第-303bp位由腺嘌呤(A)突变为胞 嘧啶(C)；具体地，所述突变的启动子区域核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，所述构建方法包括如下步骤：

(1)改造如SEQ ID NO:1所示的野生型启动子区域，使其-303bp位核苷酸发生突变， 得到突变的启动子区域核苷酸序列；

(2)将所述突变的启动子区域核苷酸序列与质粒连接，构建重组载体；

(3)将所述重组载体导入宿主菌株，得到所述包含突变的启动子区域的产L-赖氨酸重 组菌株。

根据本发明，所述步骤(1)中，使所述发生突变的方法包括诱变、PCR定点突变或同源 重组，优选PCR定点突变法。

根据本发明，所述步骤(1)包括：

根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，合成两对扩增sdaA基因启动 子区片段的引物，再通过PCR定点突变得到突变的启动子区域核苷酸序列

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)中，所述引物为：

P1:5'CCGGAATTC ATTCGCGGATCTCCGTTTA AG 3'(EcoR I)(SEQ ID NO:3)

P2:5'CTTTACAGGG GCTGGGTCAT GTCTTG 3'(SEQ ID NO:4)

P3:5'CAAGAC ATGACCCAGC CCCTGTAAAG 3'(SEQ ID NO:5)

P4:5'ACATGCATGC AACGTCAGGG AATACGACAC 3'(Sph I)(SEQ ID NO:6)；

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(1)包括：以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板， 分别以引物P1/P2及P3/P4，进行PCR扩增，获得两条含有sdaA基因启动子区分离的DNA片段，大小为660bp及626bp；以上述两条DNA片段为模板，以P1和P4为引物，通过重叠 PCR扩增(Overlap PCR)，获得突变的启动子区域核苷酸序列(SEQ ID NO:2)。

步骤(1)所述含有sdaA基因启动子区分离的DNA片段两端分别含有EcoR I和Sph I酶切位点。所述DNA片段将导致宿主菌株(例如YP097158)中的sdaA基因启动子区的-303bp位的核苷酸由腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C)。

根据本发明，所述步骤(2)包括：对于重叠PCR反应扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳 和分离纯化，将片段双酶切(EcoR I/Sph I)后，与同样双酶切(EcoR I/Sph I)后的穿梭质粒相连 接，获得等位替换重组载体。

根据本发明，所述穿梭质粒为pk18mobsacB质粒；所构建的重组载体为pk18-PsdaA^A(-303)C。

在本发明的一个实施方案中，所述重组质粒具有卡那霉素抗性标记。

在本发明的一个实施方案中，所述步骤(3)的转化为电转化法；示例性地，所述步骤(3) 中，是将重组质粒转化至菌株YP097158。

本发明的第六方面，提供如第四方面所述的重组菌株在L-赖氨酸制备中的应用；或者提 供一种提高L-赖氨酸发酵量的方法；或者提供一种生产L-赖氨酸的方法。

根据本发明所述应用和方法，包括采用所述重组菌株进行发酵，制备得到L-赖氨酸。根 据本发明所述的应用和方法，可以单独使用本发明的重组菌株，也可以和其他产L-赖氨酸的 细菌混合使用。

有益效果

本发明通过对sdaA基因野生型启动子区域引入点突变，获得重组型菌株，所获得的菌株 与未突变的菌株相比，进一步提高了L-赖氨酸的产量，而且与现有改造的大量高产L-赖氨酸 的产L-赖氨酸菌株的改造位点没有冲突，实现了新的提高L-赖氨酸的发酵量的方式，便于推 广应用。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。但本领域技术人员了解，本发明的保护 范围不仅限于以下实施例。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将认识到在不脱离本发 明技术方案所给出的技术特征和范围的情况下，对以上所述实施例做出许多变化和修改都属 于本发明的保护范围。

实施例1包含点突变的sdaA基因启动子区转化载体pK18-PsdaAA(-303)C的构建

根据NCBI公布的谷氨酸棒杆菌ATCC13032基因组序列，合成两对扩增sdaA基因启动 子区片段的引物，通过以等位基因置换在菌株YP097158背景中的sdaA基因启动子区(SEQ ID NO:1)中引入点突变。引物设计如下(上海invitrogen公司合成)：

P1:5'CCGGAATTC ATTCGCGGATCTCCGTTTA AG 3'(EcoR I)(SEQ ID NO:3)

P2:5'CTTTACAGGG GCTGGGTCAT GTCTTG 3'(SEQ ID NO:4)

P3:5'CAAGAC ATGACCCAGC CCCTGTAAAG 3'(SEQ ID NO:5)

P4:5'ACATGCATGC AACGTCAGGG AATACGACAC 3'(Sph I)(SEQ ID NO:6)

以谷氨酸棒杆菌ATCC13032为模板，分别以引物P1/P2及P3/P4，进行PCR扩增，PCR体系：10×Ex Taq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，MgCl₂(25mM)4μL，引物(10pm)各2μL，Template 1μL，Ex Taq(5U/μl)0.25μL，总体积50μL，所述PCR扩增按如下方式进 行：94℃预变性5min，(94℃变性30s、52℃退火30s、以及72℃延伸30s，30个循环)，72℃ 过度延伸10min，获得两条含有sdaA基因启动子区分离的DNA片段，大小为660bp及626bp。 再用引物P1/P4进行Overlap PCR得到整个等位替换的片段1260bp，片段包含上、下游同源 臂序列及突变的启动子序列，且片段两端分别含有EcoR I和Sph I酶切位点，PCR体系：10× ExTaq Buffer 5μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，MgCl₂(25mM)4μL，引物(10pm)各2μL，Template 1μL，Ex Taq(5U/μl)0.25μL，总体积50μL，所述PCR扩增按如下方式进行：94℃ 预变性5min，(94℃变性30s、52℃退火30s、以及72℃延伸90s，30个循环)，72℃过度延 伸10min。此DNA片段将导致菌株YP97158中的sdaA基因启动子区的-303bp位的核苷酸由 腺嘌呤(A)突变为胞嘧啶(C)。PCR反应结束后，对扩增的产物进行琼脂糖凝胶电泳，采用柱 式DNA凝胶回收试剂盒进行纯化所需要的DNA片段，将片段双酶切(EcoR I/Sph I)后回收， 与同样双酶切(EcoR I/Sph I)后的穿梭质粒pk18mobsacB质粒相连接，获得等位替换质粒pk18-PsdaA^A(-303)C，该质粒上含有卡那霉素抗性标记，并包含上、下游同源臂序列及突变的启 动子序列。

实施例2包含点突变的PsdaA^A(-303)C的菌株的构建

将等位替换质粒pK18-PsdaA^A(-303)C电转化入L-赖氨酸生产菌专利菌株YP97158中(其构 建方法可参见WO2014121669A1；经测序确认该菌株染色体上保留有野生型的sdaA基因启动 子)，对培养产生的单菌落分别通过引物P1/M13F进行鉴定，能扩增出1300bp大小条带的 菌株为阳性菌株。将阳性菌株在含15％蔗糖的培养基上培养，对培养产生的单菌落分别在含 有卡那霉素和不含卡那霉素的培养基上培养，在不含卡那霉素的培养基上生长，而在含卡那 霉素的培养基上不生长的菌株进一步采用如下引物(上海invitrogen公司合成)进行PCR鉴 定：

P5：5'CGTCGCACCA CTGGCGTGAC 3'(SEQ ID NO:7)

P6:5'CCAAAGGGCG ATGGCCGG 3'(SEQ ID NO:8)

上述PCR扩增产物通过高温变性、冰浴后进行sscp电泳(以质粒pK18-PsdaA^A(-303)C扩 增片段为阳性对照，野生型扩增片段为阴性对照，水作为空白对照)，由于片段结构不同， 电泳位置不同，因此片段电泳位置与阴性对照片段位置不一致且与阳性对照片段位置一致的 菌株为等位替换成功的菌株。再次通过PCR扩增阳性菌株目的片段，并连接到PMD19-T载 体测序，通过序列比对，sdaA基因启动子区的-303bp位的核苷酸由腺嘌呤(A)突变为胞嘧 啶(C)，证明菌株的等位替换成功，阳性菌株被命名为YPL-4-005。

实施例3L-赖氨酸发酵实验

将实施例2构建的菌株YPL-4-005和原始菌株YP97158在BLBIO-5GC-4-H型号的发酵 罐(购自上海百仑生物科技有限公司)中以表1所示的培养基和表2所示的控制工艺进行发 酵实验。每个菌株重复三次，结果如表3所示。

表1发酵培养基配方

成分	发酵配方
		淀粉水解糖	30g/L
硫酸铵	12g/L
		硫酸镁	0.87g/L
糖蜜	20g/L
		酸化玉米浆	3mL/L
磷酸	0.4mL/L
		氯化钾	0.53g/L
消泡剂(2％泡敌)	4mL/L
		硫酸亚铁	120mg/L
硫酸锰	120mg/L
		烟酰胺	42mg/L
泛酸钙	6.3mg/L
		VB1	6.3mg/L
铜、锌盐溶液	0.6g/L
		生物素	0.88mg/L

表2发酵控制工艺

表3 L-赖氨酸发酵实验结果

结果如表3所示，在谷氨酸棒杆菌中对sdaA基因启动子进行点突变PsdaA^A(-303)C，有助 于L-赖氨酸产量的提高。

序列表

<110> 黑龙江伊品生物科技有限公司

<120> 一种sdaA基因的启动子核酸序列、含有该核酸序列的重组菌株及其应用

<130> CPCN19110496

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 472

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

accgcgaacc aagacgctga cctttccttc cgtcgcacca ctggcgtgac cccgggagag 60

aacttcagca gctttgccga tcttctcaaa ggacacgacg gaaacggcta aattcgcgga 120

tctccgttta aggcattgaa gcatttggag gccccaagac atgacccaga ccctgtaaag 180

cgcttaaacg gcgttttaga gggtcatagt tttgggacaa gtgggacaag tgtgaatcct 240

gaaagcttcc agggcaagga tccaccacaa accggccatc gccctttgga atcggtccga 300

aaattgcagg tacagagcct tttaccgaga aaatccacca cagattgctg aaatttcgtg 360

atctgtggtg gattcgtgca acttcagact cttacggagg cgatggacca aaaacaacta 420

caatcaagca gatcaccttg tacaccacca tagaaaaggc ccaccctcag cc 472

<210> 2

<211> 472

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

accgcgaacc aagacgctga cctttccttc cgtcgcacca ctggcgtgac cccgggagag 60

aacttcagca gctttgccga tcttctcaaa ggacacgacg gaaacggcta aattcgcgga 120

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gaaagcttcc agggcaagga tccaccacaa accggccatc gccctttgga atcggtccga 300

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atctgtggtg gattcgtgca acttcagact cttacggagg cgatggacca aaaacaacta 420

caatcaagca gatcaccttg tacaccacca tagaaaaggc ccaccctcag cc 472

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccggaattca ttcgcggatc tccgtttaag 30

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctttacaggg gctgggtcat gtcttg 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

caagacatga cccagcccct gtaaag 26

<210> 6

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

acatgcatgc aacgtcaggg aatacgacac 30

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgtcgcacca ctggcgtgac 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccaaagggcg atggccgg 18