治疗hpv感染的纳米粒制剂中新的靶向序列以及新pbae的制备方法
阅读说明:本技术 治疗hpv感染的纳米粒制剂中新的靶向序列以及新pbae的制备方法 (Novel targeting sequence in nanoparticle preparation for treating HPV infection and preparation method of novel PBAE ) 是由 马丁 汪辉 祝达 沈慧 谭松巍 熊劲风 胡争 程静 于 2019-11-29 设计创作,主要内容包括:本发明提供了一种用于敲降或敲除HPV的靶向序列,还提供了用于靶向敲降或敲除HPV的重组质粒,还提供了一种用于治疗HPV感染的纳米粒制剂,还提供了一种制备聚(β氨基酯)聚合物的方法。本发明提供的靶向序列针对九种HVP亚型,并使用这些靶向序列构建了靶向敲降/敲除质粒,可有效地敲降/敲除被转染的细胞中的相应HPV。本发明制备的新PBAE可高效地将DNA转染至目标细胞内,并且具有更低的细胞毒性。(The invention provides a targeting sequence for knocking down or knocking out HPV, a recombinant plasmid for knocking down or knocking out HPV, a nanoparticle preparation for treating HPV infection and a method for preparing a poly (β amino ester) polymer.)
技术领域
本发明涉及生物药物制剂领域,更特别地,涉及一种用于敲降或敲除HPV的靶向序列,还涉及用于靶向敲降或敲除HPV的重组质粒,还涉及一种用于治疗HPV感染的纳米粒制剂,还涉及一种制备聚(β氨基酯)聚合物的方法。
背景技术
***严重危害妇女健康,占全世界女性恶性肿瘤疾病的第三位。超过85%的***新发病例和癌症致死病例出现在发展中国家(Jemal A,Bray F,Center MM,etal.Global cancer statistics.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.)。
近年来,随着基础医学的不断进展,出现了一系列新的具有靶向敲降或敲除HPV的重组质粒DNA,包括靶向敲降HPV的短发夹RNA(shRNA)重组质粒DNA、规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)重组质粒DNA等。
但是,该敲降/敲除技术面临两个问题,一是要求高效而精准的靶向,另外一个是要求载剂能够有效透过组织屏障和细胞屏障。
我们在2015年提交了申请号为2015109993917的专利中,公开了一种治疗HPV感染的纳米粒制剂,具有转染效率和特异性高的优点。在此基础上,我们进一步研究,改进了靶向序列和聚合物的制备方法,获得了新的可用于治疗HPV感染的纳米粒制剂。
发明内容
基于以上研究,本发明提供了一种用于敲降或敲除HPV的靶向序列,序列如SEQ IDNO:1-45之一所示。
本发明还提供了一种用于靶向敲降或敲除HPV的重组质粒,所述重组质粒包含上述靶向序列。
在一个具体实施方案中,所述重组质粒为CRISPR质粒,每个所述CRISPR质粒包含SEQ ID NO:1-27之一所示的序列作为靶向序列。
在一个具体实施方案中,所述重组质粒为shRNA质粒,每个所述shRNA质粒包含SEQID NO:28-45之一所示的序列作为靶向序列。
本发明还提供了一种用于治疗HPV感染的纳米粒制剂,所述纳米制剂包括上述重组质粒和聚(β氨基酯)聚合物。
在一个具体实施方案中,所述聚(β氨基酯)聚合物与所述重组质粒的质量比为20:1-40:1。
本发明还提供了一种制备聚(β氨基酯)聚合物的方法,包括以下步骤:
S1:使1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇溶解在溶剂中反应得到反应体系;
S2:使所述反应体系在避光条件下在65-75℃下反应,得到基础聚合物;
S3:将所述基础聚合物与1,4-丁二醇二丙烯酸酯的DMF的溶液反应,得到所述聚(β氨基酯)聚合物。
在一个优选实施方案中,S1中,1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇溶解在溶剂N,N-二甲基甲酰胺中得到所述反应体系。
在一个优选实施方案中,S2中,所述反应体系缓慢升温至65-75℃,在连续搅拌反应48小时。
在一个优选实施方案中,S3中,所述基础聚合物的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪的摩尔比为1:4至1:6。
本发明提供了针对九种HVP亚型的靶向序列,并使用这些靶向序列构建了靶向敲降/敲除质粒,可有效地敲降/敲除被转染的细胞中的相应HPV。本发明制备的新PBAE可高效地将DNA转染至目标细胞内,并且具有更低的细胞毒性。
附图说明
图1为本发明的新PBAE在不同的PBAE-DNA质量比(20:1、30:1、40:1)下的细胞毒性统计图,以空白和以前的PBAE(60:1)做对照;
图2为本发明的新PBAE在不同的PBAE-DNA质量比(20:1、30:1、40:1)下的转染效率统计图,以空白和以前的PBAE(60:1)做对照;
图3为转染HPV16-CRISPR-1和HPV16-shRNA-1对SiHa细胞增殖的影响;
图4为转染HPV18-CRISPR-1和HPV18-shRNA-1对Hela细胞增殖的影响;
具体实施方式
以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本发明,并非用于限定本发明的范围。
1.制备聚(β氨基酯)聚合物
步骤1:用电子天平称取1,4-丁二醇二丙烯酸酯2.18克(11mmol)于烧杯中,加入2mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF),超声溶解,搅拌至分散均匀。
步骤2:称取4-氨基-1-丁醇0.89g(10mmol)于烧杯中,加入适量的DMF,超声溶解,搅拌至分散均匀。得到的溶液与步骤1的溶液混合,补DMF至总体积18.38mL,使所称取的1,4-丁二醇二丙烯酸酯与4-氨基-1-丁醇的摩尔比为1.1:1,密度为167mg/mL。在研究中意外的发现,该摩尔比可做出较好的效果。
步骤3:将步骤1和步骤2中的溶液一起加入到避光玻璃烧瓶中,烧瓶放入恒温磁力搅拌油浴锅中,烧瓶中的液体放入磁珠,烧瓶上方安装自来水冷凝装置和充满氮气的气球。开始搅拌,从室温缓慢升温至65-75℃,升温速率为1℃/分钟,连续搅拌42-56小时(从升温至40℃时开始计时)。用适量DMF稀释反应液,再将其滴入6-10倍体积的***中进行沉淀,洗两遍以除去未反应完的单体,用低速离心机离心得沉淀,氮吹后置于真空干燥箱干燥得基础聚合物。
步骤4:用DMF配制0.5M的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液。取步骤3合成的基础聚合物与4-6倍摩尔比的1-(3-氨丙基)-4-甲基哌嗪溶液混合,室温搅拌10min,静置24小时后停止反应,将反应液滴入相应体积的***中进行沉淀,再次洗两遍后,用低速离心机离心得沉淀,氮吹后置于真空干燥箱干燥,得最终产物聚(β氨基酯)聚合物,即本发明的新PBAE。我们将对本发明的新PBAE与我们之前的授权专利ZL2015109993917中的PBAE在细胞毒性和转染效率进行了比较。
2.设计用于靶向敲降或敲除hpv的序列
本发明针对HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58设计了相应的靶向序列,用于靶向敲降或敲除对应的HPV。SEQ ID NO:1-27设计为CRISPR靶向序列,SEQ ID NO:28-45设计为短发卡RNA基因序列。其中:
SEQ ID NO:1-3为针对HVP6的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV6-CRISPR-1、2、3);
SEQ ID NO:4-6为针对HVP11的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV11-CRISPR-1、2、3);
SEQ ID NO:7-9为针对HVP16的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV16-CRISPR-1、2、3);
SEQ ID NO:10-12为针对HVP18的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV18-CRISPR-1、2、3);
SEQ ID NO:13-15为针对HVP31的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV31-CRISPR-1、2、3);
SEQ ID NO:16-18为针对HVP33的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV33-CRISPR-1、2、3);
SEQ ID NO:19-21为针对HVP45的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV45-CRISPR-1、2、3);
SEQ ID NO:22-24为针对HVP52的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV52-CRISPR-1、2、3);
SEQ ID NO:25-27为针对HVP58的CRISPR靶向序列(对应靶向重组质粒HPV58-CRISPR-1、2、3);
SEQ ID NO:28-29为针对HVP6的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV6-shRNA-1、2);
SEQ ID NO:30-31为针对HVP11的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV11-shRNA-1、2);
SEQ ID NO:32-33为针对HVP16的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV16-shRNA-1、2);
SEQ ID NO:34为针对HVP18的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV34-shRNA-1);
SEQ ID NO:35-36为针对HVP31的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV31-shRNA-1、2);
SEQ ID NO:37-38为针对HVP33的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV33-shRNA-1、2);
SEQ ID NO:39-40为针对HVP45的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV45-shRNA-1、2);
SEQ ID NO:41-42为针对HVP52的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV52-shRNA-1、2);
SEQ ID NO:43-45为针对HVP58的shRNA序列(对应靶向重组质粒HPV58-shRNA-1、2、3)。
3.重组质粒的构建
将SEQ ID NO:1-27所示序列分别克隆CRISPER载体中,得到针对相应HPV的CRISPR靶向敲除/敲降质粒;将SEQ ID NO:28-45所示序列分别克隆至shRNA质粒中,得到针对相应HPV的shRNA靶向敲除/敲降的重组质粒。
靶向重组质粒构建完成后,分别将上述含有重组成功质粒的菌液扩增,提取去除内毒素的质粒。为方便描述,下面将“靶向敲降或敲除的重组质粒”简称为靶向重组质粒。
本发明对于提取质粒DNA的提取方法并无特别限制,只要保证提取的质粒DNA样品的完整并去除内毒素即可,可以购买商品化的去内毒素质粒DNA提取试剂盒,本实验采用omega无内毒素质粒大提试剂盒,按照说明书操作来去除内毒素。提取的质粒分装保存在-20℃。
将上述含有重组成功靶向重组质粒的菌液可加10%甘油后置于-80℃冰箱冻存保种,只需将保种的菌液扩增即可。
4.制备纳米颗粒悬液
聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA分别用25mM乙酸钠溶液适当稀释,混合后,制成聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为20:1至40:1的溶液,根据本发明人的试验,意外的发现这个范围的质量比可做出较好的效果,尤其是当质量比为40:1效果更好。例如,质量比为40:1时,把4000μg的聚(β氨基酯)聚合物用25mM乙酸钠溶液稀释至40μL,把100μg的质粒DNA用25mM乙酸钠溶液稀释至40μL,把两个溶液迅速混合震荡,室温孵育15-20分钟,制成治疗HPV感染的纳米颗粒悬液80μL。
按照同样的方法,聚(β氨基酯)聚合物与上述制备的靶向重组质粒分别设定三个不同的质量比,即:聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为20:1、聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为30:1、聚(β氨基酯)聚合物和靶向重组质粒DNA的质量比为40:1。
5.不同剂型的制备
可将纳米颗粒悬液添加药物辅料或佐剂,进一步制成不同的剂型。例如,可把上述所得的治疗HPV感染的纳米颗粒悬液与各种适宜的辅料如化学药品、中药等配制成临床可接受的剂型,如***喷雾剂、***洗液、***凝胶、***软胶囊和硬胶囊、***栓剂、***膜、***片剂、***泡腾片、男士喷雾剂、软膏、霜剂等,含片、咀嚼片、口香糖等。含纳米颗粒悬液的洗液可供女性日常清洁***,其他各种剂型可直接放入***内,消除***和宫颈局部的人***瘤病毒(HPV)感染。以下分别列举了凝胶、洗液、***栓剂等剂型,但不限于上述剂型。对于各剂型中的用量也可以适当调整。
1)***凝胶的制备
以治疗HPV感染的纳米颗粒悬液加入普兰尼克(Pluronic)F127制成***凝胶为代表说明。
4℃下,将40g普兰尼克(Pluronic)F127加入60mL水中,搅拌制成凝胶基质;冰上或4℃条件下,将上述纳米颗粒悬液加入凝胶基质中,充分搅拌混匀制成均质凝胶。凝胶基质与纳米颗粒悬液的比例可根据需要优化,例如,80μL凝胶基质与120μL纳米颗粒悬液混合。
2)外阴洗液的制备
将聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒加入蒸馏水中,加入20g甘油混匀。将0.3g香精加入10g乙醇溶解,加于上述溶液混匀。补加蒸馏水至1000mL,分装4℃保存。
3)***栓的制备
把9g明胶加热溶解于蒸馏水中,加入甘油7.2g,定容至5.6mL,搅拌混匀。待上述甘油明胶温度降至约50℃,加入聚(β氨基酯)质粒纳米颗粒混悬液,混匀,分装4℃保存。
6.新旧PBAE的细胞毒性测定与比较
在***前病变细胞系SiHa上进行毒性试验,具体方法如下:将100ng绿色荧光质粒与10μl 25mM乙酸钠混合;将聚(β氨基酯)按照20:1、30:1和40:1的PBAE-DNA质量比与10μL 25mM乙酸钠溶液混合;3.将混合好的聚(β氨基酯)乙酸钠溶液与质粒乙酸钠溶液混合,静置15-20min,加入96孔板中。原PBAE作为阳性对照(质量比60比1)结果如图1所示,转染72小时后,使用本发明的新PBAE进行转染的细胞活性均高于原PBAE(60:1),由此可见,本发明的新PBAE的细胞毒性明显小于专利ZL2015109993917中的PBAE。
7.新旧PBAE的转染效率测定与比较
将上述PBAE-DNA组合物用于转染HEK293细胞。结果如图2所示,本发明的新PBAE以30:1的PBAE-DNA质量比转染效率最高,达到80%以上,高于专利ZL2015109993917中的PBAE的最高转染效率(60:1,70%左右)。在30:1的质量比下,本发明的PBAE具有更小的细胞毒性和更高的转染效率,优于专利ZL2015109993917中的PBAE。
8.PBAE-靶向重组质粒的***细胞抑制实验
使用上文的靶向重组质粒分别与本发明的新PBAE组合成相应的质粒纳米颗粒,用于进行HPV抑制实验。结果显示本发明的质粒纳米颗粒均可抑制相应HPV感染的细胞的增殖。以下列举其中一些例子。
1)HPV16-CRISPR-1和HPV16-shRNA-1对siha细胞的抑制实验如图3所示,分别使用HPV16-CRISPR-1和HPV16-shRNA-1构成的质粒纳米颗粒均可抑制siha细胞的增殖;
2)HPV18-CRISPR-1和HPV18-shRNA-1对Hela细胞的抑制实验如图4所示,分别使用HPV18-CRISPR-1和HPV18-shRNA-1构成的质粒纳米颗粒均可抑制Hela细胞的增殖。
其他的靶向重组质粒与新PBAE组合成的质粒纳米颗粒同样能够抑制相应子宫癌细胞的增殖,限于篇幅,不一一展示。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院附属同济医院
<120> 治疗HPV感染的纳米粒制剂中新的靶向序列以及新PBAE的制备方法
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