阅读说明：本技术 淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法及其在生物传感中的应用 (Method for screening affinity polypeptide of amyloid fiber and monomer and application of affinity polypeptide in biosensing ) 是由 王宜冰 王平 甘凌风 姚文基 于 2018-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法及其在生物传感中的应用,利用噬菌体展示肽库将纤维与单体分两步进行,纤维亲和肽采用离心分离的方法进行富集,单体亲和肽利用生物素标记的单体与链霉亲和素之间的亲和作用来进行固定而实现富集筛选。根据淀粉样蛋白可形成聚集体的特殊性质,用稳定形态的成熟纤维和生物素标记的单体来分两步进行亲和多肽的筛选,筛选得到的亲和多肽具备选择性结合纤维或单体的能力,从而用于对溶液中淀粉样蛋白不同聚集形态进行分析的方法的开发。(The invention provides a screening method of affinity polypeptide of amyloid fiber and monomer and application thereof in biosensing, wherein the fiber and the monomer are carried out in two steps by utilizing a phage display peptide library, the fiber affinity peptide is enriched by adopting a centrifugal separation method, and the monomer affinity peptide is fixed by utilizing the affinity action between the monomer marked by biotin and streptavidin to realize enrichment screening. According to the special property that amyloid can form aggregates, mature fibers with stable forms and biotin-labeled monomers are used for screening affinity polypeptides in two steps, and the screened affinity polypeptides have the capacity of selectively binding fibers or monomers, so that the method is used for developing a method for analyzing different aggregation forms of amyloid in a solution.)

淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法及其在生物传 感中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域技术领域，尤其涉及淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法及其在生物传感中的应用。

背景技术

淀粉样蛋白是某些蛋白单体经过构象变化，产生聚集体纤维形式的一类蛋白，这类蛋白广泛存在于生命体系中。其中，许多淀粉样蛋白的聚集与重大疾病相关，例如：阿尔兹海默症、二型糖尿病、帕金森病等。近年来，针对淀粉样蛋白的聚集机制及其与疾病的相关性研究越来越受到关注。此外，对于体内淀粉样蛋白的产生途径，诱发因素，以及许多其它生命体系中的非致病性淀粉样蛋白的研究也不断开展。由于淀粉样蛋白的普遍性，对于淀粉样蛋白的分析检测和组装调控研究具有重要意义。

β-Amyloid(1-42)(简称：Aβ1-42)是与阿尔兹海默症密切相关的淀粉样蛋白中占主导地位的一段多肽。它的产生和错误折叠可能是产生阿尔兹海默症的重要因素。Aβ1-42可从单体形式经聚集产生寡聚体形式，再变成原纤维，继续生长成成熟纤维，不同聚集形式的Aβ1-42对神经细胞的毒性不同，并且体内存在的Aβ42的聚集形态可能与阿尔兹海默症发生、发展和病情有一定的相关性。因此，对Aβ42进行分析检测和调控其聚集，对于阿尔兹海默症的预防、诊断和治疗有重要帮助。

噬菌体展示肽库可用于筛选针对蛋白质、细胞、细菌、有机小分子、聚合物和无机材料的亲和多肽，经富集后所得到的亲和多肽序列，具有对靶标的有效亲和性，因此可广泛用于设计生物传感器、控制材料合成、材料表面修饰和功能化等领域。由于亲和多肽的序列特异性和结构特异性，这类多肽具有潜在的识别靶分子结构特征的能力，也包括靶标的大小和形貌差异。因此获得针对淀粉样蛋白的不同聚集形态的亲和多肽，有望用于检测生物样品中这些不同的淀粉样蛋白聚集形态，并调控这些淀粉样蛋白的聚集。

发明内容

本发明的第一个目的在于，提供一种淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法。

本发明的第二个目的在于，提供利用淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法筛选得到的淀粉样蛋白β-Amyloid(1-42)的纤维与单体的亲和多肽。

本发明的第三个目的在于，提供利用淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法筛选得到的淀粉样蛋白β-Amyloid(1-42)的纤维与单体的亲和多肽在制备针对不同聚集形态的β-Amyloid(1-42)电化学生物传感器中的应用。

本发明的第四个目的在于，提供利用淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法筛选得到的亲和多肽用于对淀粉样蛋白不同聚集形态的分析检测中的应用。

为了实现本发明第一个目的，本发明提供了淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法利用噬菌体展示肽库将纤维与单体分两步进行，纤维亲和肽采用离心分离的方法进行富集，单体亲和肽利用生物素标记的单体与链霉亲和素之间的亲和作用来进行固定而实现富集筛选。

针对纤维进行亲和多肽的筛选首先需制备淀粉样蛋白的成熟纤维，采用离心分离并反复洗涤的方式进行富集筛选；针对单体的亲和多肽筛选，采用生物素标记的单体与链霉亲和素之间的亲和作用将单体进行固定，再通过反复洗涤进行富集筛选。两步筛选方法所获得的出现频率最高的亲和肽，具备序列上的差异性。

为了实现本发明第二个目的，本发明提供了利用上述淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法筛选得到的淀粉样蛋白β-Amyloid(1-42)的纤维与单体的亲和多肽，其特征在于，纤维亲和肽和单体亲和肽的氨基酸序列为：纤维亲和肽QVNGLGERSQQM；单体亲和肽GNNPLHVHHDKR。

作为一个优选方案，以纤维亲和肽QVNGLGERSQQM和单体亲和肽GNNPLHVHHDKR为基础设计多肽及多肽衍生物，包括但不限于改变其中少于5个氨基酸残基，添加氨基酸残基，减少3个以内氨基酸残基，或者偶联化学小分子和生物大分子等。

为了实现本发明第三个目的，本发明提供了利用淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法筛选得到的淀粉样蛋白β-Amyloid(1-42)的纤维与单体的亲和多肽在制备针对不同聚集形态的β-Amyloid(1-42)电化学生物传感器中的应用。该两段多肽以及以其序列为基础衍生出来的改变部分氨基酸残基的多肽和其它多肽衍生物，可用于对Aβ42的分析检测方法和生物芯片的研发以及控制Aβ42的聚集等应用领域。利用筛选得到的分别亲和β-Amyloid(1-42)纤维或单体的亲和多肽修饰电极，然后根据β-Amyloid(1-42)纤维或单体在电极上富集所产生的电化学信号的变化来定量溶液中β-Amyloid(1-42)纤维或单体的浓度。其中，检测单体选择测定CV曲线，检测纤维选择测定EIS曲线。

为了实现本发明第四个目的，本发明提供了利用淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法筛选得到的亲和多肽用于对淀粉样蛋白不同聚集形态的分析检测中的应用。筛选得到的亲和多肽具备选择性结合纤维或单体的能力，从而用于对溶液中淀粉样蛋白不同聚集形态(单体、寡聚体或纤维)进行检测和分析的方法的开发。

本发明的优点在于，根据淀粉样蛋白可形成聚集体的特殊性质，用稳定形态的成熟纤维和生物素标记的单体来分两步进行亲和多肽的筛选，筛选得到的亲和多肽具备选择性结合纤维或单体的能力，从而用于对溶液中淀粉样蛋白不同聚集形态进行分析的方法的开发。

附图说明

图1.两步法分别筛选纤维和单体亲和多肽流程。

图2.Aβ1-42单体亲和多肽用于Aβ1-42电化学检测的CV图。

图3.Aβ1-42纤维亲和多肽用于Aβ1-42纤维电化学检测的EIS图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.结合噬菌体的淘选

Aβ1-42纤维亲和多肽筛选

(1)称取0.5mg Aβ1-42溶于500μl六氟异丙醇中(1mg/ml)，吸取45μl上述溶液加入1.5ml EP管中，真空干燥后，加入190μl TBST(0.05％Tween-20)中超声重悬，37℃恒温孵育两天。

(2)向上述纤维悬液中加入10μl M13噬菌体十二肽库，在室温下混合30min。

(3)12000rpm，10min离心上一步溶液，并使用TBST(0.05％Tween-20)洗沉淀10次，在最后一次洗沉淀时将悬液转移到新的EP管中，并离心去上清。

(4)在上述EP管中加入1ml 0.2M Gly-HCl缓冲液(pH 2.2，1mg/ml BSA)重悬沉淀，分离纤维上结合的噬菌体：温和摇动10min后，12000rpm离心1min，将上清吸取到另一个干净EP管中，然后加入150μl 1M Tris-HCl缓冲液(pH 9.1)混匀。

(5)测定噬菌体滴度

①宿主菌的准备：接种ER2738单克隆至5ml LB培养基中，37℃振荡培养至对数生长中期。

②准备琼脂平板：将LB/IPTG/Xgal放置于37℃培养箱中预温备用，每个噬菌体稀释梯度对应一个平板。

③准备顶层琼脂：将顶层琼脂在微波炉里融化后冷却到60-50℃，取3ml等份分装在灭菌过的4ml离心管中，45℃保温备用。

④噬菌体系列梯度稀释：洗脱中和的噬菌体悬液用LB培养基进行10倍梯度稀释。梯度范围为10¹-10⁴。

⑤感染与铺板：宿主菌培养到对数中期后分装成200μl等份于干净EP管中。吸取10μl不同稀释度的噬菌体加入到ER2738中，快速振荡混匀，室温静置5min。将感染后的细胞加入到45℃保温的顶层琼脂试管中，一次一管，快速混匀后立即倒入37℃保温的LB/IPTG/Xgal平板上，轻旋令顶层琼脂铺开到平板上。

⑥培养及计数：待平板室温冷却后，37℃倒置过夜培养。第二日，选择约有100个蓝色噬菌斑的平板进行计数，然后以该数目乘以该板的噬菌体稀释倍数得到每10μl洗脱液的噬菌体滴度。

(6)洗脱噬菌体的扩增

①挑选ER2738单克隆接种到含四环素的LB培养基中过夜培养，第二天按1:100的比例稀释到20ml的LB培养基中。

②将洗脱中和后的噬菌体(约80μl)加入到20ml LB培养基中，37℃强力震动培养4.5h。

③将培养物转入到50ml离心管中，4℃12,000g离心10min。将上清转移到新的50ml离心管中再次离心，尽量去除残留菌体及碎片。

④收集约80％上清到新的无菌离心管中，加入1/6体积的20％PEG/NaCl溶液混匀，4℃静置过夜。

⑤4℃，12000g离心PEG沉淀15min。弃去上清再短暂离心，小心吸去残留上清液，噬菌体沉淀残留在离心管中。

⑥用1ml TBS溶液将沉淀重悬，将悬液移入另外一个1.5ml无菌离心管中，4℃离心去掉残余宿主菌细胞。上清转移到新的无菌离心管后加入160μl的20％PEG/NaCl溶液混匀，冰上孵育60min。

⑦4℃，14,000rpm离心10min，弃去上清，再短暂离心一次，吸尽残液。沉淀重悬于200μl TBS溶液中，4000rpm离心1min后将上清转移到新的无菌离心管中即为扩增的噬菌体悬液。扩增后的噬菌体悬液存放于4℃，进行滴度测定和后用于下一轮的筛选。

(7)进行第二轮至第四轮筛选：用上一轮筛选后扩增的洗脱物中约2×10¹¹pfu的噬菌体量重复步骤(2)-(4)，在清洗步骤中将Tween20浓度调整到0.1％(第二轮)，0.3％(第三轮)，0.5％(第四轮)。上一轮洗脱物扩增后测定滴度用于下一轮的筛选。

(8)第四轮筛选后所得的洗脱物测定滴度后，选择LB/IPTG/Xgal平板上少于100个噬菌斑的平板用于单克隆噬菌体的挑选。

(9)单克隆噬菌体的扩增

①挑选ER2738单克隆接种到含四环素的LB培养基中过夜培养，第二天按1:100的比例稀释到LB培养基中，将培养基2ml每管分装到4ml培养管中。每个噬菌斑对应一个培养管。挑选的蓝色噬菌斑悬浮到1ml含菌培养管中。标记好噬菌体单克隆的编号。37℃震荡培养4.5h。

②将上一步扩增的后的菌液转移到2ml干净灭菌离心管中，离心30s后将1.6ml上清转移到另一干净灭菌2ml离心管中，再次离心后取1.3ml上清转移到干净灭菌1.5ml离心管中。所得为纯化后的噬菌体单克隆悬液。

(11)噬菌斑测序：取1ml纯化后的噬菌体单克隆悬液，使用biomiga M13单链噬菌体DNA提取试剂盒进行M13噬菌体DNA的提取，然后送上海睿迪生物技术有限公司测序。对测得的DNA序列进行分析，对照密码子表，获得***的亲和多肽的氨基酸序列。

(12)纤维亲和多肽筛选结果和序列分析：从表1中可以看出纤维亲和多肽筛选过程中，每轮的投入噬菌体的量大于回收噬菌体的滴度，说明筛选是有效的。最终测序得到的序列为表2中的P1、P2和P3多肽序列，由于多肽P1在单克隆噬菌体中出现频率是13个噬菌体中的11个，频率为11/13，所以选为纤维亲和多肽。对氨基酸残基进行结构性质分析，发现亲和多肽P1含有较多的含氨基的氨基酸残基，而P2和P3没有得到富集，说明侧链的芳香环对亲和结合没有作用。

表1

表2

Aβ1-42单体亲和多肽筛选

(1)取1.5ml 100μg/ml的链霉亲和素(溶于0.1M NaHCO₃，pH 8.6，过滤除菌)加到1.5ml小平板中，4℃过夜。

(2)倒掉结合包被液，倒扣平板，去掉多余的液体。加入封阻液(0.1M NaHCO₃，pH8.6，5mg/ml BSA，0.1μg/ml链霉亲和素，过滤除菌)，4℃放置超过1h。

(3)倒掉封阻液，用TBST(0.1％Tween-20)洗板，重复6次。

(4)取0.2mg生物素标记的Aβ42(biotin-Aβ42)，加入40μl DMSO，吹打混匀。

(5)取3μl上述biotin-Aβ42溶液(5mg/ml)加入1.5ml TBST(0.1％Tween-20)中，再加入10μl噬菌体肽库，混合后37℃温育60min。

(6)将上述溶液加入到包被有链霉亲和素的平板中，室温温育10min。

(7)向上述溶液中加入15μl 10mM biotin，缓慢摇动后继续温育5min。

(8)倒掉结合液，用TBST(第一轮：0.1％Tween-20；第二轮：0.3％Tween-20；第三轮：0.5％Tween-20)洗板10次。

(9)加入1ml 0.2M Gly-HCl缓冲液(pH 2.2，1mg/ml BSA)洗脱结合的噬菌体：温和摇动10min后，12000rpm离心1min，将上清吸取到一个干净EP管中，然后加入150μl 1MTris-HCl缓冲液(pH 9.1)中和混匀。

(10)测定噬菌体滴度。

(11)洗脱噬菌体的扩增。

(12)重复进行三轮筛选，对第三轮测定滴度的平板进行单克隆噬菌体的扩增、纯化和噬菌体单克隆DNA的提取及测序。对测得的DNA序列进行分析，对照密码子表，获得***的亲和多肽的氨基酸序列。

(13)单体亲和多肽筛选结果和序列分析：从表3中可以看出纤维亲和多肽筛选过程中，每轮的投入噬菌体的量大于回收噬菌体的滴度，说明筛选是有效的，由于单体的投入量比较少，所以回收率较纤维亲和多肽筛选的回收率低。最终测序得到的序列为表4中的P4和P5多肽序列，由于多肽P4在单克隆噬菌体中出现频率为7个噬菌体有6个，所以选为单体亲和多肽。对氨基酸残基进行结构性质分析，发现亲和多肽P4不仅含有较多的含氨基的氨基酸残基，侧链的芳香环对亲和结合也可能起到一定的作用，两种结构特征在P4中都比非亲和多肽P5要丰富。

表3

表4

Aβ1-42单体亲和肽用于电化学方法检测Aβ1-42

(1)金电极用直径为0.3-0.5μm的氧化铝粉末进行抛光处理，在羊毛毡上画“8”字打磨至少15min，期间用超纯水冲洗电极表面。抛光完成后，分别用超纯水和乙醇对电极进行超声清洗10-15分钟，随后烘干。

(2)用超纯水溶解单体亲和肽冻干粉末，并稀释为0.1mg/mL备用。

(3)在电极表面固定亲和多肽，金电极浸入亲和多肽溶液中，在室温下放置吸附0.5h，在超纯水中浸泡电极0.5h以清洗电极。

(4)将修饰了亲和肽的电极浸入不同浓度Aβ1-42单体溶液中，在室温下放置吸附0.5h后浸入超纯水中清洗10分钟。以此吸附了单体的金电极为工作电极进行电化学检测。

(5)在电极杯中加入10mL缓冲液，用注射器向参比电极玻璃管中加入饱和氯化钾溶液，向缓冲液中通氮气15min，排除溶液里的溶解氧，组装三电极体系，将电极连接至电化学工作站，绿色接工作电极(Au)，红色接对电极/辅助电极(Pt)，白色接参比电极(Ag/AgCl)。

(6)测定电极的电化学CV图。打开电化学工作站和电脑软件，打开“Electrochemical Techniques”对话框，选择“Cyclic Voltammetry”，设置“Init E(V)”初始电势为0，“High E(V)”最高电势为0.1，“Low E(V)”最低电势为-0.8，“Scan Rate(V/s)”为0.1。随后点击箭头开始测试。

(7)导出txt数据进行作图。

CV曲线中可以看出，修饰了亲和多肽之后使得电极表面导电性减低(图2中位于中间的曲线)，而将其用于Aβ1-42单体检测时，对单体有明显的富集作用，在溶液中Aβ1-42单体仅有1nM浓度时，就可以观察到电极上明显增加的信号(图2中最外侧有明显峰的曲线)，并对应于Aβ1-42单体的氧化还原峰。

Aβ1-42纤维亲和肽用于电化学方法检测Aβ1-42纤维

(1)金电极用直径为0.3-0.5μm的氧化铝粉末进行抛光处理，在羊毛毡上画“8”字打磨至少15min，期间用超纯水冲洗电极表面。抛光完成后，分别用超纯水和乙醇对电极进行超声清洗10-15分钟，随后烘干。

(2)用超纯水溶解纤维亲和肽冻干粉末，并稀释为0.1mg/mL备用。

(3)在电极表面固定亲和多肽，金电极浸入亲和多肽溶液中，在室温下放置吸附0.5h后用超纯水清洗电极。

(4)清洗后的电极浸入不同浓度Aβ1-42多肽纤维溶液中，在室温下放置吸附0.5h。以此吸附了Aβ1-42多肽纤维的金电极为工作电极进行电化学检测。

(5)在电极杯中加入约10mL铁***溶液，用注射器向参比电极玻璃管中加入饱和氯化钾溶液，向电解液中通氮气15min，排除溶液里的溶解氧，组装三电极体系，将电极连接至电化学工作站，绿色接工作电极(Au)，红色接对电极/辅助电极(Pt)，白色接参比电极(Ag/AgCl)。

(6)测定电极的电化学阻抗谱EIS。打开电化学工作站和电脑软件，打开“Electrochemical Techniques”对话框，选择“A.C.Impedance”，点击Control，选择“OpenCircuit Potential”，将数值输入“A.C.Impedance”中的“Init E(V)”，此为系统的开路电压，设置“High Frequency”为100KHz，“Low Frequency”为0.1Hz，“Amplitude”为0.005V。随后点击箭头开始测试。

(7)导出txt数据进行作图。

典型的Nyquit曲线包括：Rs(溶液电阻)，Rct(电子传递阻抗)，W(Warburg阻抗)。在高频区，Rs表现为半圆，溶液中的欧姆阻抗表现在Nyquist曲线是曲线与实轴的交点；Rct表示电子传递阻抗，其值为半圆的直径与实轴的交点。图中随着多肽纤维浓度从1nM升高至40nM，Rct随着浓度的增加而增大，反应了金电极表面吸附多肽纤维后多点击表面电子传递阻力的增加，纤维亲和肽修饰的金电极在捕获了溶液中的多肽纤维后，由于氧化还原物质较难穿过多肽纤维层导致Rct值的增大。这里展示的EIS测试结果(图3)表明，用纤维亲和肽修饰的电化学传感器对目标纤维多肽能够做到有效的检测，随纤维浓度增加，阻抗值增大。

序列表：

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 华东理工大学

<120> 淀粉样蛋白纤维与单体的亲和多肽的筛选方法及其在生物传感中的应用

<130> /

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 1

Gln Val Asn Gly Leu Gly Glu Arg Ser Gln Gln Met

1 5 10

<210> 2

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gly Asn Asn Pro Leu His Val His His Asp Lys Arg

1 5 10

<210> 3

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 3

His Met Tyr Tyr Pro Gly Gly Asp Gly Arg Phe Ala

1 5 10

<210> 4

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<212> PRT

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Gly Asn Asn Pro Leu His Val His His Asp Lys Arg

1 5 10

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<212> PRT

<213> Homo sapiens

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Asp Tyr His Asp Pro Ser Leu Pro Thr Leu Arg Lys

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