一种具有内在抗菌活性及光动力增强杀菌作用的碳点、其制备方法及应用
阅读说明：本技术 一种具有内在抗菌活性及光动力增强杀菌作用的碳点、其制备方法及应用 (Carbon dots with inherent antibacterial activity and photodynamic enhanced sterilization effect as well as preparation method and application thereof ) 是由 樊江莉 刘卫俭 杜健军 孙文 彭孝军 于 2021-07-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有内在抗菌活性及光动力增强杀菌效果碳点、其制备方法及应用。技术方案如下：将杀菌剂与有机溶剂混合均匀,形成混合反应液,将所述混合反应液加热至140～260℃,并反应30min～24h,待反应产物冷却,将其提纯即可得到具有红色荧光发射的碳点。本发明所述的碳点制备方法过程简单,高效经济,安全无毒,所制备的碳点具有内在的抗菌性能,而且可实现光动力杀菌。另外,该碳点可用于细胞及细菌成像,具有良好的生物相容性,低毒性,广谱的杀菌性能,且不会产生细菌耐药性等问题。因此,在未来细胞成像及解决细菌耐药性问题等领域具有广阔的应用前景。(The invention discloses a carbon dot with inherent antibacterial activity and photodynamic enhanced sterilization effect, and a preparation method and application thereof. The technical scheme is as follows: uniformly mixing the bactericide and the organic solvent to form a mixed reaction solution, heating the mixed reaction solution to 140-260 ℃, reacting for 30 min-24 h, cooling a reaction product, and purifying to obtain the carbon dots with red fluorescence emission. The preparation method of the carbon dots has the advantages of simple process, high efficiency, economy, safety and no toxicity, and the prepared carbon dots have inherent antibacterial performance and can realize photodynamic sterilization. In addition, the carbon dots can be used for cell and bacteria imaging, have good biocompatibility, low toxicity and broad-spectrum bactericidal performance, and can not generate the problems of bacterial drug resistance and the like. Therefore, the method has wide application prospect in the fields of future cell imaging, solving the problem of bacterial drug resistance and the like.)
技术领域
本发明属于荧光、抗菌碳纳米材料技术领域，具体涉及一种具有内在抗菌活性及光动力增强杀菌作用碳点、其制备方法及应用。
背景技术
细菌感染是由病原或条件病原体侵入血液循环产生毒素和其他代谢物产生的急性全身感染。许多疾病的发生都与细菌性感染有关，如破伤风、猩猩热、伤寒、布鲁氏菌病、细菌性痢疾、肺结核和细菌性肺炎。在过去的几十年里，自发现青霉素以来，抗生素治疗一直是治疗细菌感染的主要方法之一。然而，长期和过度使用抗生素可能会导致多种耐药性细菌的出现，这是对全球公共卫生的一个日益增长的威胁。另外，大多数细菌感染与生物膜相关，附着在细菌表面的生物膜不仅可以保护它们免受外部环境的干扰，而且对宿主免疫防御具有很强的抗药性，防止抗菌素的渗透，比浮游细菌对抗生素的耐药性强100～1000倍，导致细菌感染难以治疗，严重困扰着人类健康。因此，迫切需要开发新的抗菌策略来对抗多药耐药性细菌感染和消除形成的生物膜。
纳米技术的快速发展为解决细菌的耐药性问题提供了新的机会。一些纳米材料，包括银纳米颗粒、半导体纳米颗粒、抗菌多肽、氧化石墨烯、贵金属纳米颗粒等，已被证明通过不同的机理来抑制细菌感染或消除生物膜。但它们的缺点，如合成复杂、生物膜渗透能力差、不稳定和生物相容性差等，仍然阻碍了它们的实际应用。虽然碳点可以有效地杀死细菌，但是其大部分在紫外区域有很强的吸收，荧光发射也大部分位于蓝色或者绿色区域，很少具有红色荧光发射。而且，同时具有内在抗菌活性和光动力性能的碳点少有报道。因此，寻找一种新的策略来提高荧光碳纳米材料的抗菌性能仍然是一个挑战。
发明内容
针对现在抗菌材料存在的问题，本发明提供一种长波长发射碳点、具有内在抗菌活性的荧光碳点制备方法及其应用。采用杀菌剂和合成杀菌剂中间体为碳源，所合成的碳点具有内在的抗菌活性，当碳点作用于细菌时，能破坏保护细菌活性的细胞壁，改变细菌通透性，同时渗入细胞内干扰细菌代谢，从而杀灭细菌，另外，碳点在590nm的光照射下，还可以产生单线态氧，进一步破坏细菌的DNA以及脂质过氧化破坏细胞膜，使细菌内蛋白质泄漏，从而使细菌彻底失去活性；解决了：1、治疗细菌感染过程中出现的耐药性问题；2、传统复合纳米材料合成复杂及原料成本昂贵的问题。3、生物膜渗透能力强；4、稳定性和生物相容性好；5、具有红色荧光发射；6、具有内在抗菌活性且具有光动力性能。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种具有内在抗菌活性及光动力增强杀菌作用的碳点制备方法如下：
将碳前驱体溶于有机溶剂中混合均匀，形成混合反应溶液；将所述混合溶液在140-260℃的条件下反应并维持一段时间至得到暗红色溶液，进行后处理，获得所述的具有内在抗菌活性及光动力协同杀菌的碳点。
进一步的，所述的杀菌剂和杀菌剂原料的摩尔质量比为1:1～10。
进一步的，所述混合溶液中含有0.5-20wt％的碳前驱体原料。
进一步的，所述杀菌剂选自2，4-二羟基苯甲酸,6-溴-2-萘酚，甲基-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯，2-烯丙基苯酚，2-(4-噻唑基)-1H-苯并咪唑中的至少一种，但不限于此。
进一步的，所述有机溶液为N,N-二甲基甲酰胺，甲酰胺，无水乙醇，甲醇中的至少一种，但不限于此。
进一步的，所述的制备方法还包括：当反应温度高于或者低于所述有机溶剂沸点时，将所述混合反应液放到加压反应容器中充分反应。
较为优选的，所述的制备方法还包括：所述混合溶液其反应温度为140～260℃，时间为30min～24小时，冷却后获得初步产物；优选的，在温度为160-200℃的条件下反应4-16h。
较为优选的，所述后处理包括将所述初产物除去反应溶剂，提纯。
较为优选的，所述除去反应溶剂的方法选自旋转蒸发、喷雾干燥、真空干燥、冷冻干燥中的至少一种。
较为优选的，所述提纯包括快速制备液相色谱仪和\或柱层析分离；所述提纯用的洗脱剂为甲醇和二氯甲烷按照体积比1:10～1000。
例如，在一较为具体实施案例中，所述制备的方法包括如下：
将碳前驱体溶于有机溶剂中，配制成一定浓度的混合反应溶液；
将混合反应溶液加热到一定温度并在此温度下反应一段时间，得到澄清溶液，而该澄清溶液应为暗红色溶液；对比例中，当碳源只有其中一种时，颜色为浅黄色，所以，该反应终点通过颜色判断，是很明显能够区分的。
将暗红色溶液离心、抽滤或者柱层析分离，得到内在抗菌活性及光动力协同杀菌的碳点。
本发明的另一方面，在于公开了上文所述的制备方法获得的具有内在抗菌活性及光动力增强杀菌效果的碳点。
本发明的第三方面，在于所述的抗菌碳点的应用，具体包括所述的抗菌碳点在多药耐药性细菌治疗产品中的应用，或者在微生物和细胞的成像中的应用。
与现有技术相比较，本发明具有以下特点和有益效果：
(1)本发明所制备的具有内在抗菌活性及光动力增强杀菌效果的长波长发射碳点，制备方法简单，易于操控。
(2)本发明所制备的碳点，具有激发波长独立性，光学性能优异，具有良好的生物相容性，在生物成像领域具有较大优势。
(3)本发明所制备的碳点，具有内在的抗菌性能且不会产生细菌耐药性问题，另外还能在长波长激发下产生单线态氧，用于提高抗菌效率。
(4)本发明所制备的碳点，具有广谱的抗菌性能，不仅对革兰氏阳性菌具有杀菌作用，而且对革兰氏阴性菌具有良好的杀菌性能。
附图说明
图1是本发明实施例1的碳点的高分辨率透射电镜图，图中1a显示碳点具有类球形，且具有明显的晶格条纹结构，晶格间距为0.21nm，图1b是粒径分布直方图，粒径约为3.92nm。
图2是本发明实施例1的碳点XRD谱图，图中在21.24°时显示出一个宽的衍射峰(2θ)，这与石墨状碳基材料的(001)晶格间距一致，表明碳源部分碳化成碳点。
图3是本发明实施例1的碳点紫外-可见光谱图，表明碳点在350-700nm具有广泛的吸收。
图4是本发明实施例1的碳点在不同的激发波长下的荧光光谱图，表明碳点具有激发波长独立的特性。
图5是本发明对比例1，2的碳点在不同的激发波长下的荧光光谱图，表明碳点具有激发波长依赖性，即随着激发波长变化，发射峰位置随之改变。
图6是本发明对比例3的碳点在不同的激发波长下的荧光光谱图，表明碳点具有激发波长依赖性，即随着激发波长变化，发射峰位置随之改变。
图7是本发明实施例1的碳点与COS-7细胞培养后的激光共聚焦显微镜成像图，从图7a中可以看出，激发波长为561nm时，细胞显示红色荧光，表明碳点可以进行细胞成像。图7b表示通过MTT实验方法，测试碳点对细胞的暗毒性和光毒性，测定570nm、630nm处的吸光值，计算细胞的存活率，并以细胞的存活率来表征碳点对细胞毒性的大小。
图8是本发明实施例1的不同浓度的碳点与鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌共培养以及590nm光照之后，存在菌落数图a、图b，表明随着碳点浓度增加，细菌的存活数随之下降，表明抗菌效果越好。
图9是本发明实施例1的碳点与鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌共培养以及590nm光照之后的扫描电镜图，从图中可以看出，与空白对照相比较，碳点具有内在的抗菌活性，是细菌表面发生破坏，另外，在光照之后，细菌表面的空洞破坏的明显增加，说明光照产生单线态氧对杀菌具有一定的协同作用。
图10是本发明实施例1的碳点对小鼠伤口耐药性鲍曼不动杆菌感染的治疗图，图10a和c中表明碳点及碳点加光照治疗组的效果明显高于空白对照组，图10b是治疗9天后，伤口处残留的菌落数，表明碳点可以有效地杀死伤口处的细菌，达到治疗的目的，图10d表明治疗期间小鼠体重的变化，可以看出体重幅度不大，进一步表明碳点具有良好的生物相容性。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施作进一步的说明，有助于更好地理解本发明。所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，本领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。下述实施例中所用到的材料以及试剂等，如果没有特殊说明，均可以通过市售购买得到。
实施例1
步骤1，将2,4-二羟基苯甲酸和6-溴-2-萘酚溶解在甲醇中，配成质量分数为0.5％的溶液。
步骤2，取10mL上述溶液置于50mL的高温高压反应釜中，将反应釜置于烘箱中，于180℃分别反应30min，4h，8h，12h，24h后将反应釜冷却至室温取出。
步骤3，将反应液离心，过滤得澄清的暗红色溶液，最后得暗红色固体粉末，即为目标产物，置于真空干燥箱中干燥后密封保存。
步骤4，对本实施例中碳点进行表征，本实施例制备的碳点的高分辨率透射电镜图如1所示，图中显示出碳点的平均粒径为3.32nm±0.96nm。测其绝对荧光量子产率分别为0.5％，3.1％，23.5％，17.3％和10.2％。
本实施例制备的碳点的XRD图谱如图2所示，图中在21.24°时显示出一个宽的衍射峰(2θ)，这与石墨状碳基材料的(001)晶格间距一致，表明前体部分碳化成碳点。本实施例制备的碳点紫外-可见光谱图如图3所示，表明碳点在350-700nm具有广泛的吸收。本实施例制备的碳点在不同的激发波长下的荧光光谱图如图4所示，表明碳点具有激发波长独立的特性。
实施例2
步骤1，将2,4-二羟基苯甲酸和6-溴-2-萘酚溶解在甲醇中，配成质量分数为2％的溶液。
步骤2，取10mL上述溶液置于50mL的高温高压反应釜中，将反应釜置于烘箱中，于160℃分别反应4h，8h，12h,24h后将反应釜冷却至室温取出。
步骤3，离心，过滤得澄清溶液，通过溶液颜色判断，4h和8h溶液颜色为浅黄色，且最大荧光发射峰位于540nm，12h和24h溶液颜色为黄色，其最大发射峰位置位于600nm，测其荧光量子产率，分别为1.2％和2.2％。
实施例3
步骤1，将2,4-二羟基苯甲酸和6-溴-2-萘酚溶解在甲醇中，配成质量分数为5％的溶液。
步骤2，取10mL上述溶液置于50mL的高温高压反应釜中，将反应釜置于烘箱中，于220℃分别反应4h，8h，10h后将反应釜冷却至室温取出。
步骤3，离心，过滤得澄清的暗红色溶液，最后得暗红色固体粉末，即为目标产物，置于真空干燥箱中干燥后密封保存。
步骤4，分别测其绝对荧光量子产率分别为1.7％，2.4％和1.3％。
实施例4
实施例1所制备的碳点用于标记COS-7细胞，如图7a所示，碳点能够进入细胞，进行细胞成像。
具体实施过程：取实施例1中的碳点粉末，配制浓度为10mg/mL的碳点溶液，用DMEM培养液稀释碳点浓度为150μg/mL，放置于超净台中灭菌30min备用。取生长状态良好的COS-7细胞，弃去原有的细胞培养液，用PBS轻轻清洗两次，最后加入用DMEM稀释的碳点溶液，置于37℃的二氧化碳培养箱中培养0～45min。之后，弃去碳点培养液，用PBS缓冲溶液清洗3次后，加入2mL DMEM溶液，使用激光共聚焦显微镜在561nm激发下，观察细胞荧光状态，拍照记录。
本实施例碳点标记COS-7细胞的细胞成像图如7a所示，图中显示，在激发波长为561nm时，细胞呈现红色荧光。这说明碳点具有良好的生物相容性，因此可用于荧光成像。
实施例5
实施例1所制备的碳点的细胞毒性验证，采用MTT方法。
操作步骤：将COS-7细胞消化后制备浓度为5×103个/mL的细胞悬液，以每孔100μL量加入到96孔板中，37℃、5％CO2环境下培养至80％密度后，加入不同梯度浓度的碳点DMEM溶液100μL，随后根据实验需求给予相应剂量光照。继续37℃培养12h后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL PBS水溶液)，孵育4h后弃掉培养液，每孔加入200μL DMSO，放入酶标仪中，震荡5min后检测590nm和630nm处吸光度值，并进一步计算细胞存活率。
本实施例碳点对细胞毒性的MTT实验结果如图7b所示，图中显示与空白组相比，加入不同浓度的碳点溶液，在不加光照的情况下，细胞存活率在85％以上，当光照之后，细胞存活率仍然超过75％，说明所制备的碳点具有优异的生物相容性。
实施例6
实施例1制备的碳点用与多药耐药性鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌作用，采用标准平板计数法来记录细菌的存活率。
将单一的菌落(多药耐药性鲍曼不动杆菌或金黄色葡萄球菌)转移至含有20mL液体培养基的锥形烧瓶(250mL)，然后放到37℃恒温摇床，以150转/分转速过夜摇匀。将新鲜生长的细菌，在转速5000rpm下离心5min，用无菌磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4，0.01mmol)清洗两次，然后用PBS将细菌稀释至106CFU mL-1。然后与碳点(0、10、20、30、40、40、50或100μgmL-1)在黑暗中培养0～45min，或通过光照射(590nm、30mWcm-2、15分钟)作进一步处理。最后，采用标准平板涂布法，将细菌放在固体琼脂板上，在恒温培养箱(37℃)下培养24小时，然后计算菌落数量。对照组采用PBS/Light治疗，并在相同条件下培养。每个浓度做五个平行实验。
本实施例碳点对多药耐药性鲍曼不动杆菌和金黄色葡萄球菌杀菌效果如图8所示，随着碳点浓度的增加，与空白对照组相比较，实验组菌落总数明显减少，说明所制备的碳点具有内在的抗菌性能，当有光照的情况下，细菌存活总数明显下降，说明，光照产生单线态氧，进一步协同杀死细菌。
实施例7
实施例1制备的碳点对细菌形貌的影响，其具体实施过程如下所示，细菌经过不同的处理后，其细菌悬浮液离心，洗去培养基，然后用2.5％戊二醛固体细菌形貌，放置4℃冰箱固定4h，然后用20、40、60、80，90和100％乙醇进行一次脱水15min。最后，将细菌悬浮液滴到铜网上，空气干燥后，样品最后喷铂金，并用扫描电镜观察。
本实施例碳点对细菌的形貌影响如图9所示，与空白对照组(PBS，Light)相比较，实验组的细菌表面出现许多孔洞(箭头)，当光照之后，细菌表面明显坍塌，说明所制备的碳点，不仅具有内在的抗菌性能而且还有光动力协同杀菌的作用。
实施例8
实施例1制备的碳点用于小鼠细菌感染伤口的治疗，具体实施过程如下所示：将30只6-8周龄的雌性Balb/c小白鼠随机分为5组：PBS组、Light组、碳点组、碳点+Light组、Polymyxin B组。在小鼠后背左侧注射鲍曼不动杆菌菌悬液，24h后可见白色感染区，证明感染成功。对应感染部位分别给药处理。12h后，使用590nm光，30mW/cm2照射15min对感染部位进行光照。之后每3天测量小鼠体重及伤口面积，并拍照记录感染区愈合情况。
本实施例碳点对小鼠伤口耐药性鲍曼不动杆菌感染的的治疗如图10a所示，(III)和(IV)组在第3天开始结痂，而(I、II、V)组第7天才开始结疤，表明(III)和(IV)组伤口愈合率快于阴性对照组(I、II)和阳性对照组(V)。此外，阴性和阳性对照组的伤口愈合并不乐观。
对比例1
采用实施例1的制备方法，调整步骤1中碳源前驱体为2，4-二羟基苯甲酸和2-烯丙基苯酚，二者比例为1:1，配成质量分数为0.5％的溶液。
步骤2同实施例1。
步骤3，离心，过滤得澄清的溶液，颜色为浅黄色，且其最大发射峰位置位于450nm±10nm，且其荧光量子产率分别为0.5％，1.5％，2.6％，3.1％和1.4％。其吸收位于紫外区域，发射位于蓝光区域。
对比例2
采用实施例1的制备方法，调整步骤1中碳源前驱体为6-溴-2-萘酚，配成质量分数为0.5％的溶液。
步骤2同实施例1。
步骤3，离心，过滤得澄清的溶液，颜色为浅黄色，且其最大发射峰位置位于450nm±10nm，且其荧光量子产率分别为0.7％，2.5％，3.5％，4.6％和1.8％。其吸收位于紫外区域，发射位于蓝光区域。发光谱图如图5。表明碳点具有激发波长依赖性，即随着激发波长变化，发射峰位置随之改变。
对比例3
采用实施例1的制备方法，调整步骤1中碳源前驱体为2，4-二羟基苯甲酸，配成质量分数为0.5％的溶液。
步骤2同实施例1。
步骤3，离心，过滤得澄清的溶液，颜色为浅黄色，且其最大发射峰位置位于测380nm±10nm，且其荧光量子产率分别为0.5％，1.5％，2.6％，3.1％和1.4％。其吸收位于紫外区域，发射位于蓝光区域。发光谱图如图6。表明碳点具有激发波长依赖性，即随着激发波长变化，发射峰位置随之改变。
以上所述实施例仅是为了充分说明本发明而所举的较佳实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所做的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
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