一种用于防治压砂西瓜枯萎病的木霉复合生物菌剂及其应用
阅读说明：本技术 一种用于防治压砂西瓜枯萎病的木霉复合生物菌剂及其应用 (Trichoderma composite biological agent for preventing and treating blight of casserole watermelon and application thereof ) 是由 康萍芝 白小军 杜玉宁 王喜刚 张治科 张华普 马建华 邢敏 李锋 于 2021-06-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于防治压砂西瓜枯萎病的木霉复合生物菌剂及其应用,属于生物防治领域。其中,所述木霉生物菌剂包括Trichoderma afroharzianum CGMCC No.22433、T.atroviride CGMCC No.22432和T.longibrachiatum CGMCC No.22434中的至少一种。本发明的木霉菌菌株产孢量大,对土传病害枯萎病的病原菌抑制作用明显,并且性状稳定,无污染,无公害,使用方法简单,价格低廉,在植株体内与寄主可形成共生关系,稳定性强,能改善土壤微生态环境,对植株促生长作用明显。施用后可降低化学农药的使用量和抗药性,明显减少死苗发生,可有效缓解压砂瓜连作障碍,达到提质增效的目的,促进压砂瓜产业的绿色发展,适合推广应用。(The invention discloses a trichoderma composite biological agent for preventing and treating fusarium wilt of casserole watermelon and application thereof, belonging to the field of biological prevention and treatment. Wherein the trichoderma biological agent comprises Trichoderma afroharzianum CGMCC No.22433、 T.atroviride CGMCC No.22432 and T.longibrachiatum at least one of CGMCC No. 22434. The trichoderma strain has large spore yield, obvious inhibition effect on pathogenic bacteria of soil-borne diseases blight, stable character, no pollution, no public nuisance, simple use method, low price, strong stability, capability of forming symbiotic relationship with hosts in plants, capability of improving soil micro-ecological environment and obvious growth promotion effect on the plants. After the fertilizer is applied, the use amount and the drug resistance of chemical pesticides can be reduced, the occurrence of dead seedlings is obviously reduced, the continuous cropping obstacle of the pressed sand melons can be effectively relieved, the purposes of quality improvement and efficiency improvement are achieved, the green development of the pressed sand melon industry is promoted, and the fertilizer is suitable for popularization and application.)
技术领域
本发明属于生物防治领域，具体地，涉及一种用于防治压砂西瓜枯萎病的木霉复合生物菌剂及其应用。
背景技术
压砂瓜产业是宁夏中部干旱带地区农民脱贫致富、增收减灾的新兴支柱产业，现有压砂地90万亩。由于压砂地特殊的地理环境条件和种植模式，主要种植方式为连作西瓜。随着压砂地种植年限的增加和压砂瓜的连年重茬种植、生态适宜和病原积累为病害的暴发流行创造了有利的条件，加之监测和防治技术落后，导致压砂地逐年退化，尤其是土传病害压砂瓜枯萎病或连作障碍成为最为突出和防治棘手的问题。经调查，2010年以来土传病害压砂瓜枯萎病在压砂7年以上的地块发病严重，死株率达 10％～40％，重者毁产，已成为制约压砂地持续发展的主要瓶颈，严重影响了宁夏压砂瓜的品牌品质和产业的可持续健康发展。此外，化肥农药的不合理使用也导致压砂地土壤衰退、环境面源污染较重等诸多问题，使压砂瓜产量降低、品质下降、效益下滑。
木霉属(Trichoderma sp.)真菌在世界范围内分布广泛，其既是土壤微生物的重要群落之一，也是一种植物内生真菌，从土壤、植物根际、茎部、叶片、种子及球茎表面、枯枝落叶腐木等植物残体以及其它真菌的子实体上等均可分离到。现有研究资料表明，木霉菌在农业、工业、环境保护等方面有着广泛的应用价值，其在农业领域的应用表现尤为突出，现已有多种木霉菌生防菌剂、生物菌肥、诱抗剂、种子包衣剂等产品获得登记和商业化生产并在农业生产中发挥了重要作用。其中主要以哈茨木霉 (Trichoderma harzianum)居多，其次为绿色木霉(Trichoderma viride)。近年来有关木霉菌的发明专利(申请)主要有：CN101928673A公开了一种生防菌株“哈茨木霉菌”，并在室内测定了对几种病原菌的抑菌作用；CN101693879A公开了一种长枝木霉真菌菌株，以麦麸作为固体发酵培养基进行了菌剂制作，并对树木皮部病害等进行了防效测定；CN101574091A公开了一种木霉高孢粉可湿性粉剂及其制备方法，提供了一种绿色木霉可湿性粉剂的制备方法；等等。相对于土壤木霉菌，内生木霉菌的研究起步较晚，相关的报道较少，但由于内生木霉菌可与寄主植物共生，在抗病、抗逆性、稳定性等方面优势明显，其自身的抗病、抗逆性较强等许多优势，目前越来越得到研究者的重视，开发和应用潜力巨大。CN106520570A公开了一种枇杷内生钩状木霉菌株CCTCC NO：M2016366，该菌株具有抑菌广谱性，对5种植物病原菌都表现出抑菌活性，其对稻瘟菌的抑制效果最强，可用于植物病害防治。然而目前尚没有内生木霉菌在防治压砂西瓜枯萎病的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述技术存在的单一木霉复合生物菌剂对压砂西瓜枯萎病防效较低、稳定性较差等现状，可更有效解决现有技术中存在的枯萎病和连作障碍问题，且对压砂西瓜促生长作用更为明显。
为了达到该目的，本发明采用的技术方案如下：
一种用于防治压砂西瓜枯萎病的木霉复合生物菌剂，所述木霉复合生物菌剂包括非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)、深绿木霉(Trichoderma atroviride)和长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)中的至少一种，其中所述：非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)于2021年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.22433，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述深绿木霉(Trichoderma atroviride)于2021年5 月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.22432，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；所述长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)于2021年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为：CGMCC No.22434，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
在本发明的一些实施方案中，所述木霉复合生物菌剂包括所述三种木霉菌中的至少两种。在本发明的一些优选实施方案中，所述木霉复合生物菌剂包括所述三种木霉菌。
在本发明的一些实施方案中，所述木霉复合生物菌剂还包括助剂。在本发明的一些优选实施方案中，所述助剂包括硅藻土和麦麸中的至少一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述助剂由硅藻土和麦麸组成。
在本发明的一些实施方案中，所述木霉复合生物菌剂还包括增效剂。在本发明的一些优选实施方案中，所述增效剂包括壳聚糖和生化黄腐酸中的至少一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述增效剂由壳聚糖和生化黄腐酸组成。
在本发明的一些实施方案中，木霉复合生物菌剂包括T.afroharzianum CGMCCNo.22433、T.atroviride CGMCC No.22432和T.longibrachiatum CGMCC No.22434或其发酵物，还包括硅藻土、麦麸、壳聚糖和生化黄腐酸。
在本发明的一些优选实施方案中，所述T.afroharzianum CGMCC No.22433、T.atroviride CGMCC No.22432和T.longibrachiatum CGMCC No.22434的重量比为3:2:1，木霉菌占比75％，有效孢子数不小于1010CFU/g，硅藻土3～10％、麦麸10～20％、壳聚糖1～3％、生化黄腐酸1～5％。
在本发明的一些具体实施方案中，所述T.afroharzianum CGMCC No.22433、T.atroviride CGMCC No.22432和T.longibrachiatum CGMCC No.22434的重量比为3:2:1，木霉菌占比75％，有效孢子数不小于1010CFU/g，硅藻土6％、麦麸12％、壳聚糖3％、生化黄腐酸4％。
本发明的有益效果
本发明相对于现有技术，具有以下有益效果：
本发明的木霉菌菌株产孢量大，在作物根际及植体内定殖力强，通过竞争、重寄生等多种作用机制，对土传病害枯萎病的病原菌抑制作用明显，在植株体内与寄主可形成共生关系，稳定性强，能改善土壤微生态环境，对植株促生长作用明显。
本发明的木霉复合生物菌剂的助剂为硅藻土、麦麸，增效剂为壳聚糖、生化黄腐酸，其中增效剂可诱导作物提高抗病性，改良土壤。
本发明的木霉复合生物菌剂，性状稳定，无污染，无公害，使用方法简单，价格低廉，防病促生增产效果显著，且对压砂西瓜植株具有促生长作用，施用后可降低化学农药的使用量和抗药性，明显减少死苗发生，可有效缓解压砂瓜连作障碍，达到提质增效的目的，促进压砂瓜产业的绿色发展，适合推广应用。
附图说明
图1示出了T2菌株分子种类鉴定进化树。
图2示出了T15菌株分子种类鉴定进化树。
图3示出了T6菌株分子种类鉴定进化树。
图4示出了木霉复合生物菌剂在大区试验中防病促生效果。
具体实施方式
为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。
实施例
以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
实施例1内生木霉菌的分离与鉴定
发明人利用常规组织分离方法从瓜菜植株中分离中三株内生木霉菌：T2、T15 和T6。经鉴定，分别为非洲哈茨木霉(Trichoderma afroharzianum)、深绿木霉 (Trichodermaatroviride)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)，分子鉴定的进化树分析分别如图1、图2和图3所示。
将三株菌于2021年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，获得保藏编号分为：CGMCC No.22433、CGMCC No.22432和CGMCC No.22434。即T.afroharzianum非洲哈茨木霉、T.atroviride深绿木霉和T. longibrachiatum长枝木霉。
实施例2不同内生木霉菌的田间试验效果
1.定殖能力测定
采用盆栽试验。取压砂地连作土壤装花盆，共设6个处理，每处理重复3次，每盆移栽西瓜苗1株，并设不施药(清水)作为对照。施药方法为穴施法，每种木霉生物菌剂分别设置3g/株、5g/株两种剂量，西瓜苗移栽前与土壤拌匀。西瓜苗移栽后正常管理，20d时挖出植株分别取西瓜苗根际土壤和植株不同器官或组织，利用选择性培养基、采用稀释平板法、平板涂抹法进行土壤和内生木霉菌数量测定。
结果如表1所示。
表1：不同内生木霉菌在西瓜植株体内和土壤中的定殖能力测定(104CFU/g)
表1定殖能力测定结果表明：木霉菌剂T15、T2、T6在西瓜植株体内和土壤中定殖能力较强，R/S比值为1.62～5.71，其中根部木霉数量>茎基部、叶片，且T2效果最好，其次为T15和T6，对西瓜植株具有促生长作用，其适宜的用量为5g/株。
2.田间防效测定
田间小区试验共设3个处理，施药量为5g/株，每处理重复3次，随机区组排列，并以常规药剂99％噁霉灵WP和不施药(清水)作为对照；施药方法为穴施与灌根相结合，穴施为西瓜苗移栽前与土壤拌匀，灌根稀释倍数为200～300倍液，每株药液量 250ml；西瓜苗移栽后正常管理，于植株生长20d后进行灌根，生育期内视病情严重程度可灌根1～3次，用药间隔期15～20d。
表2：不同木霉复合生物菌剂对压砂西瓜枯萎病发生及产量的影响
表2田间防效测定结果表明：利用自主研发木霉复合生物菌剂进行穴施和灌根相结合的方法防治压砂瓜枯萎病均表现出了一定的防效，田间平均防效达71.14％～76.7％，平均增产率15.43％～24.36％。
3.木霉复合生物菌剂大区试验示范效果验证
田间大区试验示范设木霉复合生物菌剂为处理，施药量为5g/株，大区面积为667m2，以清水处理作为对照；施药方法为穴施与灌根相结合，穴施为西瓜苗移栽前与土壤拌匀，灌根稀释倍数为200～300倍液，每株药液量250ml；西瓜苗移栽后正常管理，于植株生长20d后进行灌根，生育期内灌根2次，用药间隔期15～20d。
表3：木霉复合生物菌剂对压砂西瓜枯萎病发生及产量的影响
表4：木霉复合生物菌剂对土壤微生物区系及尖孢镰刀菌的影响
将三种木霉生物菌剂复配后在压砂瓜上进行大区防治试验，测定结果表明：通过穴施和灌根(2次)相结合施药后，该复合菌剂可明显降低压砂西瓜枯萎病的发生，田间防效达79.31％，增产率达26.93％，土壤中病原菌(尖孢镰刀菌)数量减少 5.27×102CFU/g，土壤细菌、放线菌的数量分别增加23.78×105CFU/g、1.4×104CFU/g，木霉菌的数量明显增加16.86×103CFU/g，说明土壤中有益菌和生防菌的数量显著增加，压砂西瓜植株对枯萎病的抗病性增强，且有利于调节土壤微生物区系。整体来讲，土壤微生态环境向着有利的方向发展。
由上可知，本发明的生物菌剂，施用后可在西瓜植株体内和土壤中快速繁殖，通过竞争、重寄生和抗生等多种作用机制，有效抑制病原菌(尖孢镰刀菌西瓜专化型)数量，并在西瓜植株体内与寄主形成共生关系，稳定性较强，且三种内生木霉菌共同发挥生防作用会更强，比现有技术单一土壤木霉菌更有效地防控压砂西瓜枯萎病，调节土壤微生物区系，使土壤微生态环境向着有利的方向发展；添加的2种增效剂，可诱导作物提高抗病性，改良土壤，促进作物生长发育；产品无污染，无公害，使用方法简单，价格低廉，防病促生增产效果显著，可达到提质增效的目的，促进压砂瓜产业的绿色发展，适合推广应用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。