γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄采后病害防治的方法
阅读说明：本技术 γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄采后病害防治的方法 (Method for preventing and treating postharvest diseases of grapes by gamma-aminobutyric acid induced culture of pseudopink Sporobolomyces Y16 ) 是由 张红印 许美秋 赵利娜 肖金玮 张晓云 杨其亚 王凯利 于 2021-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物防治技术领域,具体涉及γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄采后病害防治的方法；步骤为：将酵母活化培养后,接种到添加有γ-氨基丁酸的NYDB培养基中进行诱导培养,离心得到菌体,用无菌水稀释为1×10～(8)cells/mL的菌悬液；在葡萄表面打孔后注入菌悬液,2h后注入等体积的塔宾曲霉孢子悬浮液,实现对塔宾曲霉的有效控制；或者直接将菌悬液均匀喷洒在葡萄表面,自然晾干,即可实现葡萄采后病害的防治和贮藏保鲜的用途；本发明可以有效控制葡萄采后由塔宾曲霉引起的病害和自然腐烂,同时对葡萄采后主要品质指标无不良显著影响,操作方便且安全环保,具有显著的经济效益和社会效益。(The invention belongs to the technical field of biological control, and particularly relates to a method for controlling postharvest diseases of grapes by using gamma-aminobutyric acid to induce and culture pseudopink Sporobolomyces Y16; the method comprises the following steps: activating yeast, culturing, inoculating to NYDB medium containing gamma-aminobutyric acid, inducing, culturing, centrifuging to obtain thallus, diluting with sterile water to 1 × 10 8 cell/mL of bacterial suspension; injecting bacterial suspension after punching holes on the surface of the grape, and injecting aspergillus tubingensis spore suspension with the same volume after 2 hours to realize effective control on aspergillus tubingensis; or directly and uniformly spraying the bacterial suspension on the surface of the grape, and naturally airing, so that the purposes of preventing and treating the postharvest diseases of the grape and storing and refreshing the grape can be realized; the invention can effectively control the disease and natural decay caused by the aspergillus tubingensis after the grapes are picked, and simultaneously, the grapes are pickedThe main quality index is not affected obviously, the operation is convenient, the safety and the environmental protection are realized, and the economic benefit and the social benefit are obvious.)
技术领域
本发明属于水果采后病害生物防治技术领域，具体涉及γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄采后病害防治的方法。
背景技术
葡萄(Vitis vinifera L.)是世界上消费最多的水果之一。它们具有很高的营养价值，如多种多样的氨基酸、糖、有机酸和维生素，深受消费者的喜爱。我国葡萄的种植面积广而且品种齐全，主要用于酿造葡萄酒，制作果酒、果酱和蜜饯等，具有很大的经济开发价值和广阔的市场远景。然而，在采后、贮藏及销售期间，由于机械挤压和病菌侵染，极易发生果粒腐烂现象，使其失去商品价值，直接给相关从业人员造成巨大的经济损失。葡萄采后病害主要有因果实衰老、环境温度、二氧化硫损伤等引起的果肉褐变、裂果、冻害等生理性病害，以及由青霉属、曲霉属、根霉属的真菌侵染引起的灰霉病、青腐病、根霉病、黑斑病、黑粉病等侵染性病害。Merlera(2015)等报道，塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)，黑曲霉群菌种的其中一种，是葡萄采后主要致病菌之一。Medina(2005)等研究发现，塔宾曲霉对葡萄具有很强的致病能力，且侵染葡萄会产生赭曲霉毒素A(OTA)。赭曲霉毒素A是一种普遍存在的真菌毒素，对动物具有肾毒性、肝毒性、致畸毒性和免疫毒性。更为严重的是，赭曲霉毒素A不仅存在于葡萄中，还存在于葡萄制品中，如葡萄酒，不仅危害人体健康，而且给葡萄及其制品的产业带来极大的问题，造成巨大的经济损失。赭曲霉毒素A污染已被确定为一个世界性问题，欧盟委员会已经对某些食品中的赭曲霉毒素A设定了最大允许限量。
目前针对水果采后病害的控制方法主要有物理方法、化学方法、和生物防治法。目前，最常用的控制方法是化学杀菌剂，因其价格便宜、效率高、方便等优点，然而，长期使用化学杀菌剂会使病原菌产生耐药性，危害环境及人体健康，使其应用受到极大的限制。物理方法主要包括冷藏、热处理(热水处理和热空气处理)、辐射等，可不同程度地抑制病原菌的活性与毒素积累，但因设备成本高、工业化难度大且处理不当可能会造成水果的理化性质与感官品质发生不良变化等问题导致其在实际应用上存在较大的局限性。生物防治法是利用拮抗微生物(细菌、霉菌和酵母菌)来控制水果的采后病害，与物理方法、化学方法相比，其安全无害、无副作用且具有良好的防治作用。拮抗酵母菌与其它拮抗微生物相比，具有可快速增殖、不产生抗生素、不产生真菌毒素、遗传稳定且安全性高等优点。部分拮抗酵母不仅对水果采后病害有良好的防治作用，还可以对病原菌产生的毒素进行降解，对生物防治的大规模实际应用有重大意义。但是与化学杀菌剂相比，拮抗微生物的防治效率较低，如何提升生防效力是亟需解决的问题。
γ-氨基丁酸(GABA)，白色或近白色结晶性粉末，是一种天然的非蛋白氨基酸，广泛分布于动植物、微生物体中。目前γ-氨基丁酸的生产工艺主要是植物富集法和微生物法，具有条件温和、安全性高、可控性好等优点，并已被广泛应用于食品行业。但在生物防治领域，尤其是在葡萄采后病害的生物防治方面，目前未见有相关报道。
发明内容
本发明的目的是利用γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16(Sporidiobolus pararoseus Y16)提高其对葡萄采后病害的生防效力，减少采后病害造成的损失，具有潜在的应用价值。
为了实现以上目的，本发明提供方案如下：
拟粉红锁掷孢酵母Y16为本实验室筛选，其拮抗效力较强，对人体安全无害。γ-氨基丁酸是一种天然的非蛋白氨基酸，应用广泛，无毒无害。经研究证明，γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16可显著提高其对葡萄采后病害的生防效力，降低葡萄采后的自然腐烂率的同时对葡萄品质无不良影响，可达到水果贮藏保鲜的目的，实现了意想不到的突出效果。
该拟粉红锁掷孢酵母Y16的保藏信息具体如下：保藏名称：拟粉红锁掷孢酵母Y16(Sporidiobolus pararoseus Y16)；保藏编号为：CGMCC No.2.5351；保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年7月17日。
本发明同时提供了γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄采后病害防治的方法，具体步骤如下：
将拟粉红锁掷孢酵母Y16于NYDB培养基中进行活化培养，得到活化培养液；然后再取NYDB培养，添加γ-氨基丁酸得到混合培养液；将活化培养液接种于混合培养液中进行诱导培养，培养后经离心得到菌体沉淀，将菌体沉淀用无菌水洗涤数次后，稀释制备成1×108cells/mL的酵母菌悬液；在葡萄表面用无菌打孔器进行打孔，然后在每孔分别注入一定体积的酵母菌悬液，一段时间后再于每孔接种与酵母菌悬液等体积的塔宾曲霉孢子悬浮液，其浓度为1×105spores/mL，实现对塔宾曲霉引起病害的有效防治；
或者不对葡萄进行处理，保持葡萄的自然状况放入塑料筐中，将诱导培养后稀释制备的酵母菌悬液均匀喷洒于葡萄表面，待葡萄自然风干后放入保鲜袋中，再置于塑料筐中，用保鲜膜密封后，于室温下存放，即可实现对葡萄采后病害的防治及贮藏保鲜的用途。
其中，所述γ-氨基丁酸在混合培养液中的质量浓度为0.05％-1.6％。
其中，所述的NYDB培养基(以1L计)为：酵母膏5g，葡萄糖10g，牛肉浸膏8g，蒸馏水定容至1000mL，pH自然，115℃灭菌20min。
其中，所述活化培养接种于混合培养液的接种体积比为1-2:100。
其中，所述活化培养和诱导培养的条件为：温度28℃，转速180～200rpm，时间20～24h。
其中，所述离心的条件为：离心力为8000g，时间10～15min。
其中，所述打孔的孔直径3mm，深度3mm；所述一段时间为2h。
其中，所述在孔中注入酵母菌悬液和塔宾曲霉孢子悬浮液的体积均为10μL。
本发明的优点：
(1)本发明所使用的拟粉红锁掷孢酵母Y16为本实验室筛选，其拮抗效力强，对人体无害。
(2)本发明使用γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16，与传统的葡萄糖培养基相比，可以显著提高拟粉红锁掷孢酵母Y16的拮抗活性，从而降低葡萄采后的自然腐烂率，进而达到葡萄贮藏保鲜的目的，取得显著的效果。
(3)本发明所使用的γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16对采后葡萄主要品质指标，如失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定酸、可溶性蛋白以及抗坏血酸与对照组相比，无任何不良显著影响，且有减缓品质指标降低的效果，如经过酵母处理的葡萄失重率显著降低。
(4)本发明使用γ-氨基丁酸诱导培养后的拟粉红锁掷孢酵母Y16既可以代替化学杀菌剂防治葡萄采后病害，避免化学杀菌剂对人体及环境的潜在危害，也可减少使用物理杀菌贮藏所产生的经济和能源负担，具有显著的经济效益和社会效益。
附图说明
图1为含有不同质量浓度γ-氨基丁酸的混合培养液诱导培养后的拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄采后由塔宾曲霉引起病害腐烂率的影响；注：CK代表无菌水处理，为对照组；Y代表未经混合培养液诱导培养的拟粉红锁掷孢酵母Y16(酵母浓度为1×108cells/mL)；YA、YB、YC、YD、YE、YF分别为质量浓度0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％的γ-氨基丁酸诱导培养的拟粉红锁掷孢酵母Y16(酵母浓度为1×108cells/mL)；不同小写字母代表不同处理之间差异显著(P<0.05)。
图2为含有不同质量浓度γ-氨基丁酸的混合培养液诱导培养后的拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄采后由塔宾曲霉引起病害腐烂直径的影响。注：CK代表无菌水处理，为对照组；Y代表未经混合培养液诱导培养的拟粉红锁掷孢酵母Y16(浓度为1×108cells/mL)；YA、YB、YC、YD、YE、YF分别为质量浓度0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％、1.6％的γ-氨基丁酸诱导培养的拟粉红锁掷孢酵母Y16(浓度为1×108cells/mL)；不同小写字母代表不同处理之间差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
：
通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明；以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
实施例1：
拟粉红锁掷孢酵母Y16(Sporidiobolus pararoseus Y16)系本实验室从镇江句容葡萄园筛选得到的一株安全无毒的拮抗酵母。现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，藏编号为：CGMCC No.2.5351(基于此酵母已申请专利公开：CN201710753559.5一株控制苹果采后青霉病的酵母菌及其应用)。
培养程序为：(1)液体活化：将拟粉红锁掷孢酵母Y16接种于NYDB培养基中，在180rpm，28℃培养24h，得到活化培养液；(2)诱导培养：可以使用a步骤或者b步骤进行培养；a、将活化培养液离心(8000×g，10min)收集菌体，用无菌水反复洗涤以去除培养基，加入适量无菌蒸馏水用血球计数板进行计数，调节酵母菌悬液浓度为5×108cells/mL。在250mL三角瓶中分别装入50mL NYDB培养基，添加γ-氨基丁酸，使其在NYDB中的质量浓度依次为0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％及1.6％，并加入上述浓度的酵母菌悬液1mL，在180rpm，28℃培养24h；b、在250mL三角瓶中分别装入50mL NYDB培养基，添加γ-氨基丁酸，使其在NYDB中的质量浓度依次为0.05％、0.1％、0.2％、0.4％、0.8％及1.6％，并加入活化培养液1mL，在180rpm，28℃培养24h；(3)经诱导培养后将不同浓度γ-氨基丁酸诱导处理酵母培养基分别进行离心(8000×g，10min)收集菌体，并用无菌蒸馏水洗涤3次以去除培养基，最后用无菌蒸馏水重新再悬浮，用血球计数板调节酵母细胞浓度为1×108cells/mL。
实施例2：
γ-氨基丁酸诱导后的拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄采后由塔宾曲霉引起病害的控制效果。
(一)试验方案
试验品种为葡萄(Vitis vinifera L.)，选用商业成熟度良好、表面没有破损、没有被感染、规格一致。自来水冲洗表面，然后用0.2％(v/v)次氯酸钠(NaClO)进行表面消毒2min，自来水冲洗除去残留的次氯酸钠，摆放在塑料筐中晾干备用。
霉菌使用前活化步骤如下：(1)取1mL的霉菌孢子悬浮液接种到灭菌PDB培养基中，在恒温摇床(120rpm，25℃)下培养24h。(2)取适量的霉菌在PDA培养基上划线，于恒温恒湿箱中培养7d，取平板上的霉菌孢子于无菌生理盐水中，洗涤两次，采用双目显微镜调整到所需浓度。
在每个葡萄赤道处用无菌打孔器制得1个伤口(直径3mm×深度3mm)，分别向伤口中注入10μL(1)经NYDB培养基培养的酵母悬浮液；(2)经γ-氨基丁酸补充培养基进行诱导培养的酵母悬浮液；(3)无菌水作为对照。室温放置2h后，分别向伤口中注入10μL的塔宾曲霉孢子悬浮液(1×105spores/mL)；室温晾干后置于恒温恒湿培养箱(20℃，RH 95％)中保存，5d后观察梨果的腐烂情况，记录腐烂率及腐烂直径；每种处理3个平行，每个平行18个葡萄，试验重复两次。
发病率的计算公式如下：
发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
(二)试验结果
按照上述试验步骤，统计水果的腐烂率和病斑直径结果如下：
如图1所示，未经诱导的拟粉红锁掷孢酵母Y16处理以及经γ-氨基丁酸诱导培养的拟粉红锁掷孢酵母Y16处理均降低了葡萄采后病害的发病率，但是经γ-氨基丁酸诱导的拟粉红锁掷孢酵母Y16比单独使用拟粉红锁掷孢酵母Y16抑制塔宾曲霉的效果更佳；其中0.4％γ-氨基丁酸对拟粉红锁掷孢酵母Y16的诱导效果尤为显著。在贮藏5d后，对照组的腐烂率达到100％，单独使用拟粉红锁掷孢酵母Y16(未经诱导)腐烂率也超过50％，而0.4％γ-氨基丁酸诱导的拟粉红锁掷孢酵母Y16处理组发病率仅为16.67％。
如图2所示，无菌水处理的对照组葡萄病斑直径为11.98mm，而0.4％γ-氨基丁酸诱导的拟粉红锁掷孢酵母Y16处理组的葡萄病斑直径仅有7.08mm。
实施例3：
γ-氨基丁酸诱导培养拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄采后自然腐烂及贮藏品质的影响
(一)试验方案
选用无机械损伤，大小均一且处于正常商业成熟度的葡萄进行试验，葡萄采摘后保持自然状况，分为三组，直接在其表面喷洒(1)经NYDB培养基培养的酵母悬浮液(Y)；(2)经γ-氨基丁酸补充培养基进行诱导培养的酵母悬浮液(Y+GABA)；(3)无菌水(作为对照组，CK)。待葡萄室温晾干后，先用保鲜袋进行独立包装，后置于塑料筐中，用保鲜膜密封，置于恒温恒湿培养箱(20℃，RH 95％)中保存，9d后测定果实的自然发病率和果实自然贮藏品质相关指标。每种处理3个平行，每个平行18个葡萄，试验重复三次。γ-氨基丁酸诱导的拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄自然腐烂的抑制效果以发病率表示。
(1)发病率的计算公式如下：
发病率(％)＝发病的果实/果实总数×100％
(2)贮藏品质测定方法如下：
1.失重率：失重率＝(处理前质量-储藏后质量)/处理前质量×100％
2.可溶性固形物(TSS)：用手持式糖量计测定，采用手持糖量计进行测定，测定结果表示为g/100g样品。实验重复三次。
3.可滴定酸(TA)：取用20g果肉组织与30mL蒸馏水一起匀浆，置于80℃水浴浸提30min后定容至100mL，过滤得到滤液。取20mL滤液，滴入酚酞指示剂2-5滴，用标准溶液(0.1M NaOH)进行滴定，滴定至溶液初显粉色并在0.5min内不褪色时为滴定终点，结果以酒石酸的百分数表示。实验重复三次。
4.可溶性蛋白：称取2g葡萄组织样品，加入5mL蒸馏水或者缓冲液研磨成匀浆后，于4℃、12 000rpm离心20min，收集上清液即为可溶性蛋白粗提液。吸取1mL样品提取上清液(视蛋白质含量适当稀释)，放入具塞试管，加入5mL考马斯亮蓝G-250溶液，充分混合，放置2min后再波长595nm处比色，按照制作标准曲线同样的方法测定吸光度值。重复三次。结果以每克葡萄果肉所含可溶性蛋白的质量表示，即mg/g。
5.抗坏血酸(Vc)：取20g果实样品与少量20g/L草酸溶液混合，冰浴研磨匀浆后转移到50mL容量瓶，用草酸定容至刻度，提取10min。10 000rpm，4℃条件下离心10min，取上清液进行滴定。用移液器吸取20mL上清液置于100mL的三角瓶中，用已标定的2，6-二氯酚靛酚溶液滴定至出现微红、且15s不褪色为止，记录下染料用量，以20mL草酸为空白。重复三次。结果以100g样品(鲜重)中含有的抗坏血酸的质量表示，即mg/100g。
6.硬度(N)：采用TA-XT2 Plus质构分析仪测试，选用P2探针，参数设定为“压力测量”模式，速度为1mm/s，测试深度为3mm。选定赤道处等距离的三个点进行测试。探头插入葡萄时所受的最大阻力(单位为N)就被定义为葡萄的硬度。实验重复三次。
(二)试验结果
表1γ-氨基丁酸诱导拟粉红锁掷孢酵母Y16对葡萄自然腐烂率及贮藏品质的影响
注：CK为无菌水处理的对照组，Y代表拟粉红锁掷孢酵母Y16处理，GABA+Y代表γ-氨基丁酸(0.4％)诱导拟粉红锁掷孢酵母Y16处理组。不同小写字母代表差异显著性(P<0.05)。
如表1所示，在20℃下贮藏9d后，经γ-氨基丁酸(0.4％)诱导的拟粉红锁掷孢酵母Y16处理的葡萄自然病害发生率显著降低，仅为5.56％，效果非常显著，产生了意想不到的效果；拟粉红锁掷孢酵母Y16处理的葡萄自然病害发生率为12.5％，而无菌水喷洒的葡萄自然病害发生率是30.56％。在贮藏品质方面，如失重率、硬度、可溶性固形物、可滴定酸、可溶性蛋白以及抗坏血酸与对照组相比，无任何显著不良变化。因此，可以认为经γ-氨基丁酸(0.4％)诱导拟粉红锁掷孢酵母Y16能够降低葡萄的腐烂率，而对葡萄的贮藏品质无显著不良影响。
拟粉红锁掷孢酵母Y16的保存：
可以选择使用NYDA培养基在4℃冰箱保藏，也可以选择将酵母于-80℃下长期保存于50％甘油管中。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
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