阅读说明：本技术 一种从母体中在体原位捕获胎儿真核红细胞的装置及其应用 (Device for in-vivo capturing fetal eukaryotic red blood cells from maternal body and application thereof ) 是由 张弢 *** 宋婉云 杨贵和 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种原位捕获胎儿有核红细胞的装置及其应用,所述装置包括推拉装置、空筒容器、穿刺头和聚合物导丝,所述空筒容器两端开口,一端连接穿刺头,另一端放置推拉装置,推拉装置与空筒容器的内壁密封接触,并且能够沿空筒容器的内壁滑动,所述聚合物导丝穿过穿刺头内部,并且连接推拉装置的底部。采用本发明装置,可以实现与母体外周血作较短时间的接触,就能捕获数量稀少的胎儿有核红细胞,并且可以在体、原位捕获胎儿有核红细胞捕,避免了大量抽取母体外周血,并使用离心等低效率方法进行富集、分离胎儿有核红细胞因而耗时长、花费高等问题,方法成本低,耗时短,捕获效率高。(The invention discloses a device for capturing fetal nucleated red blood cells in situ and application thereof. The device can realize the contact with maternal peripheral blood for a short time, can capture a small amount of fetal nucleated red blood cells, can capture the fetal nucleated red blood cells in vivo and in situ, avoids the problems of long time consumption, high cost and the like caused by the adoption of low-efficiency methods such as centrifugation and the like for enrichment and separation of the fetal nucleated red blood cells, and has low cost, short time consumption and high capture efficiency.)

一种从母体中在体原位捕获胎儿真核红细胞的装置及其应用

技术领域

本发明涉及一种从母体中在体原位捕获胎儿真核红细胞的装置及其应用，属于胎儿有核红细胞捕获医疗器械技术领域。

背景技术

每毫升血液中数量低于100个的细胞被称作稀有细胞，多类稀有细胞具有重要的研究价值，其中循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)和胎儿有核红细胞(Nucleated red blood cells，NRBCs)在临床诊断与治疗方面具有广阔前景，研究较为广泛。胎儿有核红细胞包含胎儿完整的遗传信息，便于遗传学和分子生物学分析，在孕早期的母体外周血中含量比其他胎儿细胞丰富。因此，NRBCs在胎儿产前诊断领域具有重要的研究意义，可以通过对NRBCs基因进行检测，诊断胎儿是否患有先天畸形或者遗传疾病，如唐氏综合征、基因拷贝数变异等。

目前，为了实现对NRBCs的分离和富集，广泛使用的方法是将血液从人体分离出来，利用NRBCs与正常血细胞在大小、密度、变形性以及细胞表面表达的特异性抗原等的不同，基于物理方法或免疫亲和法进行分离。如Nagy等(NAGY G R,BAN Z,SIPOS F,etal.Isolation of epsilon-haemoglobin-chain positive fetal cells withmicromanipulation for prenatal diagnosis[J].Prenatal diagnosis,2005,25(5):398-402)利用双密度梯度离心后的血液和免疫磁珠混合，利用抗原抗体的特异性结合，并进一步通过磁场实现胎儿有核红细胞NRBCs的体外捕获。中国发明专利申请公开号为CN108795685A的专利文件公开了一种利用微流控芯片捕获和释放胎儿有核红细胞的方法，该专利利用包含微流道以及特异性靶标物质的微流控芯片实现对胎儿有核红细胞的特异性捕获，并进一步利用光切割将与靶细胞连接的连接臂切断，实现靶细胞的释放；中国发明专利申请公布号为CN108535228A的专利文件利用胎儿有核红细胞体积和表面抗原的差异，通过具有特定几何排布的微阵列结构芯片，将微流控技术和免疫亲和作用结合，实现不同尺寸的胎儿细胞捕获和富集；中国发明专利申请公开号为CN105063181A的专利文件公开了用密度梯度离心法富集NRBCs，加到修饰了抗体的基底芯片上静置捕获，然后通过FISH探针鉴定胎儿Y染色体的从孕妇外周循环血中分离胎儿有核红细胞用于无创产前诊断的方法；中国发明专利申请公开号为CN105420086A的专利文件公开了一种单细胞定位微孔膜及应用和单细胞自动化获取装置，该装置将单细胞分散在定位的微孔滤膜中，用荧光显微镜自动识别后将相应的滤膜打开使细胞落入收集孔中达到分离的目的；中国发明专利申请公开号为CN101310025A的专利文件公开了一种分析物富集的系统和方法，通过构成微阵列富集分析系统仪器，将目标细胞的浓度提高10000倍；中国发明专利申请公开号为CN102884170A和CN107604039A的专利文件公开了一种检测和分离细胞的微流体分选器，通过微流体分选器中的直线或螺旋形狭窄流道中细胞变形性差异实现NRBCs与其他细胞的分离；中国发明专利申请公开号为CN108546676A的专利文件公开了一种隧道磁场技术分离和富集外周血中稀有细胞的方法，将磁珠与目标细胞细胞通过抗体-抗原相互作用在细胞孵育中进行连接，然后流过隧道磁场实现富集分离；中国发明专利申请公开号为CN106119189A的专利文件公开了一种胎儿有核红细胞的分离纯化方法及试剂盒通过离心和抗体标记的磁珠分离富集NRBCs；中国发明专利申请公开号为CN103797368A的专利文件公开了一种胎儿有核红细胞的检测方法，将CD147抗体与含有NRBCs的血液样品形成复合物，经密度梯度离心富集后在显微镜下进行筛选检测；中国发明专利申请公开号为CN103103161A的专利文件公开了一种胎儿有核红细胞分离纯化方法及唐氏综合症筛查试剂盒，通过CD54抗体标记的磁珠与NRBCs结合然后用磁分离器进行分离；中国发明专利申请公开号为CN107312748A的专利文件公开了一种分选胎儿有核红细胞的方法，将纳米微球通过抗体-抗原作用连接到NRBCs上从而扩大与其他细胞的密度差，然后经离心分离富集；中国发明专利申请公开号为CN105043831A的专利文件公开了一种俘获有核红细胞的纳米材料，将CD147抗体通过链霉亲和素连接到纳米颗粒铺展在玻璃基板上形成的基底膜上，与梯度离心方法富集的NRBCs接触，用免疫荧光染色法进行鉴定；中国发明专利申请公开号为CN104977284A的专利文件公开了一种胎儿有核红细胞的捕获及鉴定方法，首先制备了修饰抗体并连接生物素的纳米基底膜，NRBCs经梯度离心方法富集后与基底膜接触，采用双阳性免疫荧光染色法进行鉴定；中国发明专利申请公开号为CN108220453A的专利文件公开了一种无创产前亲权鉴定方法及其试剂盒，将密度梯度离心、免疫磁珠负选、免疫荧光、激光显微切割、单细胞扩增等优化的技术结合在一起形成系统鉴定方法，成功分离孕妇外周血中胎儿有核红细胞，并将其成功应用于亲权鉴定中；中国发明专利申请公开号为CN107312706A的专利文件公开了用于生物样本提取的生物反应载体，在反应腔(圆球、半球、槽、微流道、毛细管)内壁修饰羧基/氨基，然后连接抗体，与细胞悬液接触实现NRBCs的提取；中国发明专利申请公开号为CN106488981A的专利文件公开了用于诊断测试的胎儿有核红细胞(NRBCS)的制备方法，首先用密度梯度离心富集获得含有NRBCs的细胞级分，经过磁性激活细胞分选后进一步经荧光标记后用流式细胞术分选或通过显微操作进行分选；中国发明专利申请公开号为CN103602632A的专利文件公开了用离心分离方法从孕妇外周血中分离胎儿有核红细胞的技术方案；中国发明专利申请公开号为CN104662424A的专利文件公开了在纳米结构装置上选择性捕获并经刺激释放循环细胞的方法，在基板上构建纳米线阵列并使纳米线一端固定而另一端连接抗体，抗体与纳米线之间有温敏响应材料层，在第一温度下具有紧凑结构捕获细胞，在第二温度下则展开释放捕获细胞；中国发明专利申请公开号为CN108753573A的专利文件公开了在微流控芯片中捕获和鉴定胎儿有核红细胞的方法，该方法在微流控芯片中使纳米颗粒流过从而在内壁形成涂层，修饰链酶亲和素，嫁接生物修饰的抗体进行NRBCs分选。

目前对NRBCs分离和富集的方法多数为体外捕获，需要抽取较多外周血，难以实现在体原位捕获，样品容量小，有效接触母体外周的血液量小；而且由于NRBCs在母体外周血中含量少(每毫升低于100个)，体外捕获不确定性较在体原位捕获的不确定性更高；再者，体外捕获需要在特定实验场所内进行，捕获后的细胞很难进行无损保存或运输，不利于下游基因检测和分析。

发明内容

发明目的：本发明的主要目的是提供一种从母体中在体原位捕获胎儿真核红细胞的装置及其应用，该装置能够实现人体稀有细胞的在体原位捕获，经过后续的洗脱步骤获得胎儿有核红细胞。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种原位捕获胎儿有核红细胞的装置，所述装置包括推拉装置、空筒容器、穿刺头和聚合物导丝，所述空筒容器两端开口，一端连接穿刺头，另一端放置推拉装置，推拉装置与空筒容器的内壁密封接触，并且能够沿空筒容器的内壁滑动，所述聚合物导丝穿过穿刺头内部，并且连接推拉装置的底部。

作为优选，所述推拉装置包括连接在一起的推拉杆和活塞，活塞与空筒容器的内壁密封接触。所述穿刺头可拆卸。

所述推拉装置还可以为一体化设计，空筒容器可以为圆筒形或方筒形等，其两端开口大小可以相同或者不同。穿刺头可拆卸，或者可与空筒容器呈一体化设计。

优选，所述聚合物导丝为高分子材料制成的导丝，并且其表面连接羧基基团。

所述高分子材料选自天然高分子材料或人工合成高分子材料，所述天然高分子材料选自纤维素或蛋白质，优选纤维素；所述人工合成高分子材料选自聚酰胺、聚酯、聚氨酯、聚丙烯酸酯或聚醚酰胺，进一步选自聚酰胺6、聚酰胺66、聚酰胺610、聚酰胺1010、聚酰胺1212、聚对苯二甲酸二乙二醇酯、对苯二甲酸二丁二醇酯、聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚酯、聚己内酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、各种由甲基丙烯酸甲酯与其他丙烯酸酯单体共聚得到的聚丙烯酸酯纤维或各种聚醚-聚酰胺的共聚物，优选聚酰胺6、聚酰胺66、聚酰胺610、聚酰胺1010或聚对苯二甲酸二乙二醇酯。

所述聚合物导丝表面连接羧基基团，可以采用化学接枝或表面涂敷方法等，优选采用化学接枝方法。连接的羧基是具有两性离子性质的羧基，即在连接羧基形成阴离子基团的同时，在同一化学结构中还连接带有阳离子性质的季铵基团，而用于接枝的单体中还具有丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯结构。进一步优选的化学结构是羧基甜菜碱(甲基)丙烯酸酯结构，具有如下通式，其中优选的结构是R＝CH₃，n＝1，m＝1的羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(CBMA)。

R＝H,CH₃,n＝1,2,3,...,m＝1,2,3,...

即所述聚合物导丝为表面连接羧基甜菜碱甲基丙烯酸酯(CBMA)齐聚物的高分子材料导丝。

优选，所述推拉装置的可移动距离为1-20cm，空筒容器具有不超过2mL的容量，穿刺头内径不小于0.3mm，聚合物导丝具有0.1-0.3mm的直径，1-20cm的长度。

利用上述装置原位捕获胎儿有核红细胞的方法，包括以下步骤：

1)通过推拉装置将含有胎儿有核红细胞抗体的溶液吸入到空筒容器中，使抗体连接到聚合物导丝上，然后排掉溶液；

2)通过推拉装置将生理盐水吸入到空筒容器中，使聚合物导丝浸泡在生理盐水中，然后将穿刺头***皮下血管，通过推拉装置排出生理盐水使聚合物导丝暴露于血液中，充分接触血液后，拔出该装置；

3)取下充分接触血液后的聚合物导丝，洗脱，即得。

所述胎儿有核红细胞抗体包括但不限于CD34、CD71或Hoechst33258，优选的抗体是CD71。连接抗体是在捕获细胞前进行，无需事先连接，从而避免在保存过程中抗体失效。

优选，所述使抗体连接到聚合物导丝(4)上的方法，采用碳二亚胺/N-羟基琥珀酰亚胺偶联反应(EDC/NHS)连接。

优选，所述充分接触血液，接触时间为1-60分钟，优选10-30分钟。

步骤3)中洗脱可用方法的原理是公知的细胞生物学中的方法，洗脱得到的胎儿有核红细胞可以进一步用于基因分析检测，从而获得胎儿的所有遗传信息。

利用所述装置捕获胎儿有核红细胞的原理如下：

聚合物导丝穿过穿刺头，与推拉装置紧密连接，通过推拉装置的移动，可以使导丝前后移动。当推拉装置在最靠近穿刺头一端时，导丝的一部分暴露在装置以外，当推拉装置在最远离穿刺头一端时，导丝全部收入装置以内。当导丝与装置连接以后，得到一个完整的从母体中原位捕获胎儿有核红细胞装置。

本发明装置，设计巧妙，其中聚合物导丝性质柔软，在体内血管中会随着血流飘动，不会粘附到血管壁上，从而与更多的血液接触，实现及其稀有的有核红细胞的特异性捕获。此外，本发明装置能够使抗体的连接简单易行，可以让抗体连接在穿刺以前通过几种溶液的交替抽吸就实现，让器械与抗体(药物)的连接在现场通过简单的操作实现。从而能够避免器械在制造的时候就连接上需要特殊条件(低温、短时间)才能保持活性的抗体，避免后期储运、使用过程中抗体失活。

技术效果：相对于现有技术，采用本发明装置，可以实现与母体外周血作较短时间的接触，就能捕获数量稀少的胎儿有核红细胞，用于进一步的基因分析检测等，可以获知胎儿的遗传信息，从而为早期遗传疾病的筛查提供依据。此外，利用本发明提供的装置，可以在体、原位捕获胎儿有核红细胞捕，避免了大量抽取母体外周血，并使用离心等低效率方法进行富集、分离胎儿有核红细胞因而耗时长、花费高等问题，方法成本低，耗时短，捕获效率高。

附图说明

图1：本发明原位捕获胎儿有核红细胞装置的整体结构示意图。

图2：本发明实施例2原位捕获胎儿有核红细胞装置的整体结构示意图，其中：A是功能化的导丝处于装置内部保护的状态，B是部分导丝推出装置的中间状态，C是导丝推出装置暴露与外界环境的状态。

图3：利用本发明胎儿有核红细胞捕获装置从离体的孕妇血液中捕获的有核红细胞的荧光照片，其中：ABC是三次不同实验的结果。

图4：利用本发明胎儿有核红细胞捕获装置捕获的胎儿有核红细胞的荧光标记的原位杂交(FISH)检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1

一种原位捕获胎儿有核红细胞的装置，如图1所示，该装置包括推拉装置1、空筒容器2、穿刺头3和聚合物导丝4，空筒容器2两端开口，一端连接穿刺头3，另一端放置推拉装置1，推拉装置1与空筒容器2的内壁密封接触，并且能够沿空筒容器3的内壁滑动，聚合物导丝4穿过穿刺头3内部，并且连接推拉装置1的底部。

推拉装置1包括连接在一起的推拉杆1-1和活塞1-2，活塞1-2与空筒容器2的内壁密封接触。穿刺头3可拆卸。

空筒容器2可以为圆筒形或方筒形等，其两端开口大小可以相同或者不同。

聚合物导丝4为高分子材料制成的导丝，并且其表面连接羧基基团。

所述推拉装置1的可移动距离为1-20cm，空筒容器2具有不超过2mL的容量，穿刺头3内径不小于0.3mm，聚合物导丝4具有0.1-0.3mm的直径，1-20cm的长度。

实施例2

作为本发明的一种具体实施方式，在本实施例中，利用注射器或其类似装置制成的用于原位捕获胎儿有核红细胞的装置，如图2所示，包括推杆1-1、活塞1-2、空筒容器2、针头3和聚合物导丝4(分别对应实施例1中的推拉杆1-1、活塞1-2、空筒容器2、穿刺头3和聚合物导丝4)，所述空筒容器2两端开口，一端连接可拆卸的针头3，另一端放置连接在一起的推杆1-1和活塞1-2，活塞1-2与空筒容器2内壁密封接触，并且能够在推杆1-1的推拉下沿空筒容器2的内壁滑动，所述聚合物导丝4穿过针头3，并且连接活塞1-2的底部。

推杆1-1的前后移动距离为1-20cm，空筒容器2具有不超过2mL的容量，针头3内径不小于0.3mm，聚合物导丝4具有0.1-0.3mm的直径，1-20cm的长度，活塞1-2为软质的活塞。

所述聚合物导丝4通过化学键在其表面连接CBMA齐聚物，使导丝表面具有羧基。

本发明装置的组装过程需要在无菌环境中实现，组合装置最后需经过医疗器械行业公知的灭菌方法灭菌后方可用于人体。

实施例3

一种利用聚合物导丝原位捕获胎儿有核红细胞的方法，具体步骤如下：

取直径0.25mm，长度15cm的尼龙6导丝，洗涤干净后置于甲酸中浸泡1小时使表面活化，然后用硝酸铈铵和浓硫酸的组合引发剂引发接枝反应，与CBMA溶液反应接枝，在尼龙导丝表面连接上CBMA齐聚物，得到羧基化的尼龙导丝5。

取标准规格的1mL注射器，配置内径22G注射针头4(内径0.41mm)，如附图2中状态，拉动推杆1-1使活塞1-2从空筒容器2中抽出并从推杆1-1上分离。取事先准备好的羧基化的尼龙导丝5，穿过针头3和空筒容器2。在活塞1-2上用针扎一个小孔，穿过导丝4并打结固定。将活塞1-2重新安装到推杆1-1上，装入空筒容器2中，推动推杆1-1使呈附图中C状态，观察导丝4状态正常并根据需要剪去多余的导丝，拉动推杆1-1使呈附图中A状态，完成装置的组装。最终装置中的导丝4长度是12.5cm。

配置1,4-二氧六环和无菌的纯水混合液，将EDC/NHS充分溶解在混合液中，得EDC/NHS活化液。用组装好的注射器抽取1mL事先配置好的EDC/NHS活化液，室温轻轻振荡1h后，推出活化液，并用生理盐水冲洗3遍。用活化后的注射器抽取1mL特定浓度的CD71抗体溶液，静置在4℃下反应12小时；生理盐水清洗连接抗体后的注射器3次后，抽取1mL生理盐水保存含有抗体的尼龙导丝；排除出注射器中空气后，将针头沿着远心方向将注射器轻轻***皮下血管，慢慢推出注射器推杆使尼龙导丝暴露于血液中，并顺着血流方向充分接触外周血液，留置20min后拉回推杆将导丝收回装置中，拔出注射器，获得捕获了胎儿有核红细胞的导丝样品。所述胎儿有核红细胞的荧光照片如图3所示。

导丝样品经洗涤、胰酶消化并固定在载玻片上，经荧光标记的原位杂交(FISH)检测确认捕获得到的是胎儿有核红细胞，结果如图4所示，细胞内可以看到X染色体的绿色荧光信号和Y染色体的红色荧光信号，证明细胞来自男婴，即捕获到的细胞是胎儿的细胞而非母体的细胞。