阅读说明：本技术 对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物及其制备方法与应用 (P-methoxyphenyl substituted spiro [ indazole-pyrazoline ] derivative containing pyrazole structure and preparation method and application thereof ) 是由 邓莉平 罗蒙强 杜奎 李琰 任小荣 席眉扬 吴春雷 沈润溥 于 2019-11-05 设计创作，主要内容包括：本发明属于医药技术领域,尤其涉及一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物及其制备方法与应用。本发明一种如权利要求1所述的对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤：(1)1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三唑基)-4-吡唑甲醛的合成；(2)1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-4-吡唑甲醛腙的合成；(3)1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-α-氯-4-吡唑甲醛腙的合成；(4)5-(4-甲氧基亚苄基)-1-苯基-6,7-二氢-1<I>H</I>-吲唑-4(5<I>H</I>)-酮的合成；(5)对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物的合成。(The invention belongs to the technical field of medicines, and particularly relates to a p-methoxyphenyl substituted spiro [ indazole-pyrazoline with a pyrazole structure]Derivatives, and preparation methods and applications thereof. The invention relates to a p-methoxyphenyl substituted spiro [ indazole-pyrazoline with pyrazole structure according to claim 1]The preparation method of the derivative is characterized by comprising the following steps of (1) synthesis of 1-phenyl-3-methyl-5- (1,2, 4-triazolyl) -4-pyrazolecarboxaldehyde, (2) synthesis of 1-phenyl-3-methyl-5- (1,2, 4-triazolyl-1-yl) -4-pyrazolecarboxaldehyde hydrazone, (3) synthesis of 1-phenyl-3-methyl-5- (1,2, 4-triazolyl-1-yl) - α -chloro-4-pyrazolecarboxaldehyde hydrazone, and (4) synthesis of 5- (4-methoxybenzylidene) -1-phenyl-6, 7-dihydro-1-phenyl H -indazole-4 (5) H ) -synthesis of ketones; (5) p-methoxyphenyl substituted spiro [ indole ] containing pyrazole structureAzole-pyrazolines]And (3) synthesizing a derivative.)

对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物及 其制备方法与应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物及其制备方法与应用。

背景技术

5-(4-甲氧基亚苄基)-1-苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮，化学结构式如下：

1,3-偶极环加成反应以其良好的区域和主体选择性而成为合成五元杂环化合物最主要的方法，也是杂环药物化学研究中较为活跃的一类反应。三氮唑分子结构中具有芳香性和丰富的电子，可通过形成氢键与生物体内酶和受体相互作用，具有多种生物活性。异噁唑骨架在药物得应用中是一个重要的药效基团，有着显著的生理和药理活性。此外，腈氧化物与环外双键的1,3-偶极环加成反应合成的螺异噁唑类化合物因展现出一些重要的生理特性而引起了药物学家们注意。所以,无论是从药理学还是从合成角度考虑,这类杂环化合物都有很高的合成价值。

吡唑衍生物作为一类有用的中间体以及它们本身所显示出来的多种药物活性而受到人们的广泛关注。为了更好地研究不同杂环在同一分子中聚集而对药理活性所产生的影响,我们通过1,3-偶极环加成反应合成了一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物。

发明内容

本发明的目的是提供一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉] 衍生物及其制备方法，制备一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉] 衍生物。

为了实现上述目的，本发明技术方案如下：

一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物化学结构式如下：

其中：Ar＝4-CH₃OC₆H₄-。

一种如权利要求1所述的对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉] 衍生物的制备方法，包括如下步骤：

(1)1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-***基)-4-吡唑甲醛(化合物1)的合成：将 21mmol的1,2,4-三氮唑溶解于50mL的乙醇溶剂中，再将25mmol氢氧化钾加入，常温25℃下超声半小时，减压旋蒸乙醇后加入40mL DMSO，将15mmol 5-氯-1- 苯基-3-甲基-4-甲酰基吡唑分批加入，50℃超声2h,TLC检测待原料反应完后，将混合物倒入200mL冰水中，析出淡黄色固体，抽滤；固体物质烘干后，乙醇- 水重结晶得化合物1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-***基)-4-吡唑甲醛(化合物1)；

(2)1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-4-吡唑甲醛腙(化合物2)的合成：取22mmol的苯肼加入盛有10mL四氢呋喃的烧瓶中，沸水浴回流搅拌至溶解，然后缓慢滴加入20mL溶有20mmol1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-***基) -4-吡唑甲醛(化合物1)的无水乙醇溶液，继续沸水浴回流搅拌1h，滴加10 滴浓盐酸，直至淡黄色沉淀出现；连续沸水浴回流搅拌5h，停止水浴，加人20 mL蒸馏水搅拌，淡黄色沉淀颜色变深，抽滤得黄红色针状产物；用无水***冲洗多次，真空干燥得产物1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-4-吡唑甲醛腙(化合物2)；

(3)1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-α-氯-4-吡唑甲醛腙(化合物3)的合成：50ml 1,2-二氯乙烷和30ml异丙醇中加入1-苯基-3-甲基-5- (1,2,4-三氮唑-1-基)-4-吡唑甲醛腙(化合物2)，磁力搅拌使其完全溶解，然后冰盐浴至-12℃，分三次加入次氯酸叔丁酯，剧烈搅拌2h，在此期间，注意控制温度在-5℃以下，得到淡兰色透明液体；将产物转入圆底烧瓶，减压50℃温度下蒸干溶剂，得到淡黄色油状物；再加入少量石油醚，加热混溶，有大量黄色固体析出，减压抽滤，得到1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-α- 氯-4-吡唑甲醛腙(化合物3)；

(4)5-(4-甲氧基亚苄基)-1-苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮(化合物4) 的合成：将10mmol 1-苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮与10mmol甲基苯甲醛溶于10mL乙醇中，加入2ml40％NaOH水溶液，80℃搅拌3小时，然后用布氏漏斗过滤分离，滤饼水洗后用乙醇重结晶纯化，过滤烘干得到产物5-(4- 甲氧基亚苄基)-1-苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮(化合物4)；

(5)在20mL乙醇中加入5-(4-甲氧基亚苄基)-1-苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4 (5H)-酮(化合物4)和1-苯基-3-甲基-5-(1，2，4-三氮唑-1-基)-α-氯 -4-吡唑甲醛腙(化合物3)，用恒压滴液漏斗滴加吡啶0.5mL和乙醇10mL的混合液至上述溶液中，滴毕后继续常温搅拌2小时，TLC跟踪反应，待反应完全后过滤，滤液减压浓缩，硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚,得到最终产物。

所述1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-4-吡唑甲醛腙(化合物2) 与次氯酸叔丁酯物质的量之比为5:8。

所述1-苯基-3-甲基-5-(1,2，4-三氮唑-1-基)-α-氯-4-吡唑甲醛肟(化合物3)与5-(4-甲氧基亚苄基)-1-苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮(化合物4)物质的量之比为3:2。

所述洗脱剂中V_{(乙酸乙酯)}:V_(石油醚)＝1:8。

所述的对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物在抗肿瘤药物方面的应用。

本发明提出的一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物及其制备方法，该制备方法用1,3-偶极环加成方法在5-(4-甲氧基亚苄基)-1- 苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮结构中引入异噁唑环，从而合成一个同时含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-***基)结构吡唑取代的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物。本发明制备的含5-(1-苯基-3-甲基-4-1,2,4-***基)结构吡唑取代的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物,具有较强的肿瘤细胞抑制效果，为其进一步的医药领域应用提供了基础。

附图说明

图1为本发明一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物的制备方法中步骤(1)-(3)的制备方法流程图；

图2为本发明一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物的制备方法中步骤(4)的制备方法流程图；

图3为本发明一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物的制备方法中步骤(5)的制备方法流程图；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明技术方案做进一步详细说明，以下实施例不构成对本发明的限定。

吡唑衍生物作为一类有用的中间体以及它们本身所显示出来的多种药物活性而受到人们的广泛关注。为了更好地研究不同杂环在同一分子中聚集而对药理活性所产生的影响,我们通过1,3-偶极环加成反应合成了一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物。

本发明提供了一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物，其化学结构式如下：

其中：Ar＝4-CH₃OC₆H₄-。

实施例1

(1)1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-***基)-4-吡唑甲醛(化合物1)的合成：将21mmol的1,2,4-三氮唑溶解于50mL的乙醇溶剂中，再将25mmol氢氧化钾加入，常温 25℃下超声半小时，减压旋蒸乙醇后加入40mL DMSO，将15mmol 5-氯-1-苯基 -3-甲基-4-甲酰基吡唑分批加入，50℃超声2h,TLC检测待原料反应完后，将混合物倒入200mL冰水中，析出淡黄色固体，抽滤。固体物质烘干后，乙醇-水重结晶得化合物1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-***基)-4-吡唑甲醛。

(2)1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-4-吡唑甲醛腙(化合物2)的合成：取22mmol的苯肼加入盛有10mL四氢呋喃的烧瓶中，沸水浴回流搅拌至溶解，然后缓慢滴加入20mL溶有1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-***基)-4-吡唑甲醛(20 mmol)的无水乙醇溶液，继续沸水浴回流搅拌1h，滴加10滴浓盐酸，有淡黄色沉淀出现。连续沸水浴回流搅拌5h，停止水浴，加人20mL蒸馏水搅拌，淡黄色沉淀颜色变深，抽滤得黄红色针状产物。用无水***冲洗多次，真空干燥得产物1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-4-吡唑甲醛腙(化合物2)。

(3)1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4-三氮唑-1-基)-α-氯-4-吡唑甲醛腙(化合物3)的合成：50ml 1,2-二氯乙烷和30ml异丙醇中加入化合物2(10.0mmol)，磁力搅拌使其完全溶解，然后冰盐浴至-12℃，分三次加入18ml(16g，16mmol)次氯酸叔丁酯，剧烈搅拌2h，在此期间，注意控制温度在-5℃以下，得到淡兰色透明液体。将产物转入圆底烧瓶，减压蒸干溶剂(50℃)，得到淡黄色油状物。再加入少量(m.p.＝60-90℃)石油醚，加热混溶，有大量黄色固体析出，减压抽滤，得到化合物3。

(4)5-(4-甲氧基亚苄基)-1-苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮(化合物4)的合成：将10mmol 1-苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮与10mmol甲基苯甲醛溶于10mL乙醇中，加入2ml40％NaOH水溶液，80℃搅拌3小时，然后用布氏漏斗过滤分离，滤饼水洗后用乙醇重结晶纯化，过滤烘干得到产物酮。

(5)在20mL乙醇中加入化合物4(5-(4-甲氧基亚苄基)-1-苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮)1mmol和化合物3(1-苯基-3-甲基-5-(1，2，4-三氮唑-1-基) -α-氯-4-吡唑甲醛腙)1.5mmol，用恒压滴液漏斗滴加吡啶0.5mL和乙醇10mL 的混合液至上述溶液中，滴毕后继续常温搅拌2小时，TLC跟踪反应，待反应完全后过滤，滤液减压浓缩，硅胶柱层析，洗脱剂为乙酸乙酯/石油醚(60-90℃) ＝1/8(V/V),得到化合物5。

实验数据如下：一种对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物(化合物5)，淡黄色粉末，产率56.2％，熔点：160-161℃，其核磁氢谱数据和元素分析数据如下：

¹H NMR(CDCl₃)δ:8.18(s,1H,N＝C-H),8.06(s,1H,triazole-H),7.98(s,1H,triazole-H),7.51-7.41(m,14H,Ar-H),6.47(s,1H),3.71(s,3H,CH₃O),3.13(t,J＝6.5Hz,2H),3.02(t,J＝6.5Hz,2H),2.55(s,3H,CH₃).

IR(KBr)v/cm^-1 3101(ArH),1677(C＝O),1657,1635,1576,1464 (C＝N,C＝C),

m/e:671(100.0％)

Anal.calcd.for C₄₀H₃₃N₉O₂：C,71.52；H,4.95；N,18.77；found C,71.54；H, 4.99；N,18.71。

本实施例采用MTT法测定化合物5对不同瘤株的体外抑制作用，含对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物的抗肿瘤活性测定结果如下：

将化合物5用DMSO溶解稀释，肿瘤细胞HepG2(肝癌细胞)、A375(黑素瘤细胞)、SW620(人结直肠腺癌细胞)、A549(肺腺癌细胞)、NCL-H460 (非小细胞肺癌)、SKOV3(卵巢癌细胞)在96孔板上种入4000个/200μL/孔，每孔加入化合物2μL，终浓度为12.0μM，6.0μM，3.0μM，1.5μM，共同于37℃、 5％CO₂细胞培养箱中孵育72小时，以DMSO(1％)为空白对照。72小时后，加入终浓度为0.25mg/mL的MTT，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中4小时，之后吸干溶剂，每孔加入100μl DMSO，用酶联免疫仪于570nm处测定吸光度 (OD值)，所得数据用于计算IC₅₀值。挑选抑制活性高的化合物，测定不同浓度下的化合物作用时间不同对人肿瘤细胞周期和凋亡的影响。

不同浓度的受试化合物用96孔板进行粗筛，根据所得的抑制率，计算IC₅₀值，结果见下表。

表1化合物5对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物对六种肿瘤细胞株的IC₅₀值

在表1中，表示出了对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲唑-吡唑啉]衍生物(化合物5)对六种肿瘤细胞株的IC₅₀值，说明化合物对SW620(人结直肠腺癌细胞)、A549(肺腺癌细胞)、NCL-H460(非小细胞肺癌)、有较强的肿瘤细胞抑制效果，为其进一步的医药领域应用提供了基础。

实施例2-5

实施例2-5其余均与实施例1相同除了步骤(3)中1-苯基-3-甲基-5-(1,2,4- 三氮唑-1-基)-4-吡唑甲醛腙(化合物2)与次氯酸叔丁酯物质的量之比不同，为方便对比，制得表2：

表2

实施例6-9

实施例6-9其余均与实施例1相同除了步骤(5)中1-苯基-3-甲基-5-(1,2， 4-三氮唑-1-基)-α-氯-4-吡唑甲醛肟(化合物3)与5-(4-甲氧基亚苄基)-1- 苯基-6,7-二氢-1H-吲唑-4(5H)-酮(化合物4)物质的量之比不同，为方便对比，制得表3：

表3

实施例10-13

实施例10-13其余均与实施例1相同除了步骤(3)中次氯酸叔丁酯的加入次数不同(加入总量相同，且平均加入)，为方便对比，制得表4：

表4

	加入次数	产率
			实施例1	3	92％
实施例10	1	57％
			实施例11	2	85％
实施例12	4	87％
			实施例13	5	84％

实施例14-16

实施例14-16其余均与实施例1相同除了步骤(3)中冰盐浴的温度不同，为方便对比，制得表5：

表5

	冰盐浴的温度	产率
			实施例1	-12	92％
实施例14	0	0％
			实施例15	-5	37％
实施例16	-8	66％

对比实施例1

使用公开号为CN108752364A专利的实施例1制备得到的甲基取代含吡唑结构的螺[吲哚嗪-异噁唑啉]衍生物，将其用DMSO溶解稀释，肿瘤细胞HepG2 (肝癌细胞)、A375(黑素瘤细胞)、SW620(人结直肠腺癌细胞)、A549(肺腺癌细胞)、NCL-H460(非小细胞肺癌)、SKOV3(卵巢癌细胞)在96孔板上种入4000个/200μL/孔，每孔加入化合物2μL，终浓度为12.0μM，6.0μM，3.0μM， 1.5μM，共同于37℃、5％CO₂细胞培养箱中孵育72小时，以DMSO(1％)为空白对照。72小时后，加入终浓度为0.25mg/mL的MTT，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中4小时，之后吸干溶剂，每孔加入100μl DMSO，用酶联免疫仪于 570nm处测定吸光度(OD值)，所得数据用于计算IC₅₀值。挑选抑制活性高的化合物，测定不同浓度下的化合物作用时间不同对人肿瘤细胞周期和凋亡的影响。

不同浓度的受试化合物用96孔板进行粗筛，根据所得的抑制率，计算IC₅₀值，结果见下表6。

表6对甲氧基苯基取代含吡唑结构的螺[吲哚嗪-异噁唑啉]衍生物对六种肿瘤细胞株的IC₅₀值

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其进行限制，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。