一个提高小麦籽粒淀粉合成的转录因子bZIP2及其应用
阅读说明：本技术 一个提高小麦籽粒淀粉合成的转录因子bZIP2及其应用 (Transcription factor bZIP2 for improving starch synthesis of wheat grains and application thereof ) 是由 张爱民 刘冬成 宋艳红 罗光彬 孙家柱 李欣 阳文龙 于 2019-09-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一个能提高小麦籽粒淀粉合成的转录因子<I>bZIP2</I>及其应用,该转录因子是<I>TubZIP2</I>基因,以及<I>TubZIP2</I>基因在普通小麦中同源基因<I>TabZIP2</I>的三个拷贝：<I>TabZIP-A2</I>、<I>TabZIP-</I><I>B2</I>和<I>TabZIP-D2</I>,其编码区是分别由SEQ ID No.1、No.2、No.3和No.4所示核苷酸序列组成。在<I>TubZIP2</I>的过表达小麦株系中,<I>AGPL-cyto、AGPS-</I><I>cyto</I>和<I>SBEIIa</I>的表达在胚乳灌浆的中后期较野生型的显著提高,而其它淀粉合成相关基因(SSRG)的表达量没有变化,粒长和千粒重也明显增加。敲除普通小麦中的基因<I>TabZIP2</I>,敲除系的总淀粉和支链淀粉含量显著降低,粒长和千粒重也显著减小。<I>TubZIP2</I>过表达系和<I>TabZIP2</I>敲除系的株高、有效分蘖、小穗数和粒长没有明显变化。(The invention discloses a transcription factor capable of improving the starch synthesis of wheat grains bZIP2 And uses thereof, the transcription factor is TubZIP2 A gene, and TubZIP2 gene homology gene in common wheat TabZIP2 Three copies of (a): TabZIP‑A2 、 TabZIP‑ B2 and TabZIP‑D2 the coding regions are respectively composed of SAnd the nucleotide sequences shown in EQ ID No.1, No.2, No.3 and No. 4. In that TubZIP2 In the case of the over-expressed wheat line of (1), AGPL‑cyto、AGPS‑ cyto and SBEIIa the expression of the protein is obviously improved in the middle and later periods of endosperm filling compared with the wild type, while the expression quantity of other Starch Synthesis Related Genes (SSRG) is not changed, and the grain length and thousand kernel weight are also obviously increased. Knocking out genes in common wheat TabZIP2 The total starch and amylopectin content of the knockout line is obviously reduced, and the grain length and thousand grain weight are also obviously reduced. TubZIP2 Over-expression lines and TabZIP2 the plant height, effective tillering, small spike number and grain length of the knockout line have no obvious change.)
技术领域
本发明涉及遗传工程领域，具体涉及一种提高小麦淀粉合成相关基因表达的转录因子及其应用。
背景技术
作为世界上主要作物之一，小麦不仅为人类健康提供蛋白质、维生素和膳食纤维，还是人类饮食中淀粉和能量的主要来源。淀粉是小麦籽粒胚乳中的主要贮藏成分，占籽粒总重的60-70％，占面粉总重的70-85％。
小麦胚乳细胞中的淀粉合成包括一系列复杂的反应，需要一系列酶的参与。在淀粉合成开始时，AGPase催化葡萄糖-1-磷酸（G1c-1-P）和三磷酸腺苷（ATP）转化为腺苷二磷酸葡萄糖（ADP-葡萄糖），是直链淀粉和支链淀粉合成的葡萄糖供体。之后，颗粒结合型淀粉合成酶（GBSS）催化ADP-葡萄糖最终形成直链淀粉，而淀粉合成酶（SS）、淀粉分支酶（SBE）和脱分支酶（DBE）催化ADP-葡萄糖转移到高度支化的葡聚糖支链，最终形成支链淀粉。通过调控淀粉合成相关基因的表达能有效提高籽粒淀粉含量，从而提高小麦的产量。然而，迄今为止，有关谷物籽粒中淀粉合成转录调控的报道并不多。其中RSR1和OsbZIP58是水稻中鉴定得到的淀粉合成调控因子；ZmNAC36、ZmbZIP91、ZmEREB156和 SUSIBA2分别是玉米和大麦中鉴定的调控淀粉合成的转录因子。在小麦中，除了关于水稻RSR1同源基因TaRSR1的研究，还没有关于淀粉合成调控机制的系统研究报道。
发明内容
本发明通过共表达分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA）鉴定得到了一个和淀粉合成相关基因（starch synthesis related genes, SSRG）在胚乳灌浆期共表达的转录因子TubZIP2。TubZIP2及其在普通小麦中的同源基因TabZIP2能够显著提高AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因的表达，进而提高小麦籽粒的总淀粉和支链淀粉含量。同时，TubZIP2和TabZIP2对小麦的其他重要农艺性状没有任何不良影响。
本发明有助于人们对小麦淀粉合成调控的理解，TubZIP2和TabZIP2也可以作为基因工程和传统育种的重要目标基因，培育高产优质的小麦新品种。
本发明人通过对乌拉尔图小麦G1812籽粒灌浆期胚乳的转录组数据分析，鉴定得到了TubZIP2与部分SSRG基因具有相似的表达模式。TubZIP2亚细胞定位于细胞核，其1-128aa 具有转录激活活性。在双荧光素酶报告基因系统分析和小麦胚乳瞬时过表达分析中，TubZIP2促进AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因启动子的活性。在TubZIP2的过表达小麦株系中，AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa的表达在胚乳灌浆的中后期较野生型的显著提高，而其它SSRG基因的表达量没有变化。相应的，过表达系的总淀粉含量和支链淀粉含量显著提高，同时过表达系的粒长和千粒重也明显增加。相反的，利用CRISPR/Cas9技术敲除TubZIP2在普通小麦中的同源基因TabZIP2, 敲除系的总淀粉含量和支链淀粉含量显著降低，粒长和千粒重也显著减小。TubZIP2过表达系和TabZIP2敲除系的株高、有效分蘖、小穗数和粒长都没有明显变化。总之，TubZIP2和TabZIP2促进小麦籽粒淀粉的合成，且对其他重要农艺性状没有负面影响。
本发明的目的是提供一个调控SSRG基因表达的转录因子TubZIP2，该转录因子促进淀粉的合成。
本发明所提供的转录因子TubZIP2来源于乌拉尔图小麦，具有SEQ ID No.1所示核苷酸序列组成的编码区。SEQ ID No.1所示的DNA长度为1722 bp（不包括终止密码子）, 属于bZIP家族，编码574个氨基酸残基的蛋白质。TubZIP2在普通小麦的同源基因为TabZIP2,其有三个拷贝TabZIP-A2、TabZIP-B2和TabZIP-D2，它们的编码区分别是SEQ ID No.2、SEQID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸序列，它们的编码区长度都为 1722 bp, 编码574个氨基酸残基的蛋白质。
同时，本发明提供一种包含权利要求1所述转录因子的重组载体。
本发明还提供一种含有所述转录因子的表达载体，优选为植物表达载体。
本发明提供所述转录因子在小麦中提高灌浆期SSRG基因的表达中的应用；所述的应用是将所述转录因子转化小麦，筛选过量表达所述转录因子的阳性转基因株系。
本发明还提供胚乳中过表达所述的转录因子的方法，该方法是将含有所述转录因子的过表达载体转化普通小麦的胚乳，优选地，采用基因枪的方法转化普通小麦花后15天的胚乳。
同时，本发明提供扩增TubZIP2和TabZIP2编码区全长的通用引物对，其中，正向引物的序列为SEQ ID No.5所示，反向引物的序列为SEQ ID No.6所示。
本发明还提供利用共表达分析确定调控SSRG基因表达候选转录因子的方法，其通过RNA-Seq分析乌拉尔图小麦灌浆期胚乳的转录组，找到和SSRG基因具有相近表达模式的转录因子。
本发明提供检测转录因子对SSRG基因启动子区调控强度的方法，将转录因子的过表达载体和SSRG基因启动子驱动萤火虫荧光素酶 (Firefly luciferase) 基因表达的报告载体共转化小麦原生质体细胞，并以海肾荧光素 (Renilla luciferase) 作为内参，检测转录因子调控SSRG基因启动子活性的强度。
本发明提供通过胚乳过表达检测转录因子对SSRG基因表达调控的方法，其将转录因子的过表达载体通过基因枪的方法转化普通小麦花后15天的胚乳，高渗培养基中暗培养48小时，用RT-PCR检测胚乳中SSR基因表达量的变化。
本发明提供的乌拉尔图小麦TubZIP2能够上调普通小麦未成熟种子中AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因的表达并最终提高成熟种子总淀粉和支链淀粉的含量。其在普通小麦中的同源基因TabZIP2具有同样的功能。因此，bZIP2对小麦的淀粉品质改良具有重要意义。
附图说明
图1 TubZIP2进化树分析，亚细胞定位，转录激活活性和表达模式分析。其中，A为TubZIP2的结构，其中128-179 氨基酸（amino acid, aa）代表bZIP家族转录因子的核心区域；B为进化树分析显示TubZIP2和其同源基因在小麦族保守，与来自禾本科其他族群的同源基因关系较远；C为TubZIP2的N-端（1-127 aa）具有转录激活活性；D为TubZIP2定位于细胞核；E为TubZIP2在T. urartu成熟胚乳中特异表达；F为TubZIP2和部分SSRG基因在T. urartu灌浆过程中共表达。
图2 TubZIP2在体外提高AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因的转录。A为双荧光素酶报告基因系统中报告载体、表达载体和内参的示意图，其中REN：海肾荧光素酶；LUC：萤火虫荧光素酶；Ubi：ubiquitin；P：启动子；ter：终止。B为TubZIP2在双荧光素酶报告基因系统中显著提高AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因的启动子活性；C为TubZIP2在胚乳中过表达载体示意图；D为TubZIP2在胚乳中的过表达提高AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因的转录。
图3 TubZIP2提高小麦过表达系中AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因的转录水平。A和B分别表示RNA-seq和RT-PCR的结果显示TubZIP2在转基因小麦未成熟胚乳中过量表达；C、E和G分别为RNA-seq分析中花后7天、14天和21天的胚乳中AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa转录水平的变化；D、F和H分别表示RT-PCR验证花后7天、14天和21天的胚乳中AGPL- cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因表达量的变化。
图4 TubZIP2提高过表达系的总淀粉含量和支链淀粉含量。A为TubZIP2显著提高2017-2018北京、堤上和赵县种植过表达系的总淀粉含量；B电镜扫描对比中发现赵县种植的过表达系籽粒中的A型淀粉颗粒较野生型的多，其中A和B分别表示A型和B型淀粉粒；C、D和E分别为三个地点过表达系的支链淀粉含量、直链淀粉含量和直链淀粉和支链淀粉的比值； F为RVA分析中北京的过表达系相较于野生型有更高的峰值粘度。
图5 TubZIP2提高过表达系籽粒的千粒重和粒宽。A和B分别为野生型与过表达系植株和穗部形态；C、D和E分别为野生型与过表达系的株高、有效分蘖和每穗小穗数；F为野生型与过表达系籽粒的粒长与粒宽形态；G为TubZIP2对转基因系的籽粒长度没有影响；H和I分别为TubZIP2提高过表达系的粒宽和千粒重。
图6 TabZIP2体外提高AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因的转录。A为TabZIP2在普通小麦胚乳中特异表达；B为TabZIP2与AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa共表达；C为TabZIP2在胚乳中过表达载体示意图；D为TabZIP2在胚乳中的过表达提高AGPL-cyto、AGPS- cyto和SBEIIa基因的转录。
图7 TabZIP2敲除系的总淀粉含量和支链淀粉含量下降。A为北京、堤上和赵县TabZIP2敲除系总淀粉含量显著降低；B电镜扫描对比中发现赵县种植的敲除系籽粒中的A型淀粉粒较野生型的少，其中A和B分别表示A型和B型淀粉粒；C为三个地点敲除系的支链淀粉含量；D为快速粘度分析仪（RVA）分析中北京种植的敲除系相较于野生型有更低的峰值粘度； E和F分别显示敲除系的粒宽和千粒重显著下降。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1 乌拉尔图小麦TubZIP2和SSR基因的进化树分析，亚细胞定位，转录激活活性和共表达分析，具体包括如下步骤：
（1）小麦bZIP2基因的克隆：根据TRIUR3_00571的5’末端和3’末端的序列，设计扩增TubZIP2编码区的引物（正向引物的序列为SEQ ID No.5所示，反向引物的序列为SEQ IDNo.6所示），以乌拉尔图小麦花后15天胚乳的cDNA为模板，克隆得到TubZIP2，序列为SEQ IDNo.1所示。根据TubZIP2序列搜索IWGSC BLAST（https://urgi.versailles.inra.fr/blast_iwgsc/dbgroup=wheat_iwgsc_refseq_v1_chromosomes&program=blastn）和WheatExp BLAST（https://wheat.pw.usda.gov/WheatExp/），利用TubZIP2的全长引物以普通小麦中国春花后15天胚乳的cDNA为模板，TubZIP2的全长引物（正向引物的序列为SEQ IDNo.5所示，反向引物的序列为SEQ ID No.6所示）PCR扩增并单克隆测序得到普通小麦TabZIP2的三个拷贝TabZIP-A2、TabZIP-B2和TabZIP-D2，它们的序列分别为SEQ ID No.2、SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。
（2）进化树分析：将TubZIP2和TabZIP2以及GenBank中与它们序列相似性80%以上基因的氨基酸序列用Clustal Omega (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/) 软件比对后，用Mega 5.05 (http://www.megasoftware.net/) 构建进化树，结果如图1B所示，TubZIP2及其在小麦族的同源基因在进化树分析中单独聚为一个分支，与来自其它族的同源基因距离较远，这表明bZIP2基因在小麦族保守。
（3）转录激活活性检测：TubZIP2氨基酸序列通过NCBI Protein BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
（4）亚细胞定位：将TubZIP2连接到pJIT163-UBI-hGFP 载体，构建TubZIP2融合GFP的重组质粒pJIT163-UBI-TubZIP2-hGFP，转化小麦叶片原生质体细胞, 在ubiquitin启动子驱动下实现TubZIP2融合的表达。结果如图1D所示，TubZIP2定位于原生质体细胞的细胞核。TubZIP2在细胞核的定位表明其在核内行使功能，符合转录因子的特征。
（5）组织特异性表达分析：采用Trizol法提取乌拉尔图小麦花后15天根、茎、叶和胚乳的总RNA，用TubZIP2特异引物，通过RT-PCR验证它们的组织特异性表达，结果如图1E所示，TubZIP2在胚乳中大量表达。
（6）小麦bZIP2基因和SSRG基因表达模式的验证：在乌拉尔图小麦灌浆期的胚乳中，利用TubZIP2和部分SSRG基因的特异引物，通过RT-PCR验证两者的表达模式。结果如图1F所示，TubZIP2和所选SSRG基因的表达在花后5天达到峰值并随后逐渐降低，这和RNA-Seq的结果是一致的。
实施例2 普通小麦TabZIP2和SSRG基因的组织特异性表达和体外促进AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa的转录。
（1）组织特异性表达分析：提取普通小麦中国春花后15天植株的根、茎、旗叶、穗子和胚乳的总RNA，用 TabZIP-A2、TabZIP-B2和TabZIP-D2的特异引物，通过RT-PCR验证它们的组织特异性表达，结果如图6A所示，在花后15天的根、茎、旗叶、穗部，TabZIP-B2有少量的表达，TabZIP-A2和TabZIP-D2有微量的表达；在花后15天的胚乳中，TabZIP-A2、TabZIP-B2和TabZIP-D2都有大量表达，且以TabZIP-B2的表达量最高。
（2）TabZIP2基因和SSRG基因表达模式的验证：利用RT-PCR检测了普通小麦中国春灌浆期胚乳中TabZIP2和SSRG基因的表达模式，结果如图6B所示，TabZIP-A2、 TabZIP-B2和TabZIP-D2与部分SSRG基因具有相同的表达模式，即起始于花后5天，并在花后10天达到峰值，然后表达量开始下降；这也预示着这三个拷贝有参与了普通小麦SSRG基因的表达调控。
实施例3 小麦bZIP2基因的功能
1. 小麦bZIP2对SSRG基因的直接调控
（1）双荧光素酶报告基因系统检测TubZIP2对SSR基因启动子的调控： 用ubiquitin启动子驱动TubZIP2大量表达（Ubi P::TubZIP2），构建TubZIP2的表达载体；利用SSRG基因的启动子 (-2000 bp至-1 bp )驱动萤火虫荧光素酶 (Firefly luciferase) 基因的表达，构建表达载体（SSRG P::LUC），并用此载体作为报告载体。将两个重组载体共转化小麦原生质体细胞，以海肾荧光素酶 (Renilla luciferase) 过表达载体（Ubi P::REN）作为对照，载体示意图如2A所示，LUC/REN代表SSR基因启动子的表达活性。采用Dual-LuciferaseReporter Assay System试剂盒 (Promega, Madison, USA) 和Gloma 20/20 Luminometer(Promega, Madison, USA) 检测荧光强度。结果如图2B所示，TubZIP2显著地提高了SSRG基因AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa 的启动子活性。
（2）bZIP2的胚乳过表达：pJIT163-UBI-hGFP载体 (氨苄抗性) (由中国科学院遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员提供) 是由ubiquitin启动子驱动GFP的表达。将TubZIP2、TabZIP-A2、TabZIP-B2和TabZIP-D2分别重组于pJIT163-UBI-hGFP载体，使其中的ubiquitin启动子驱动bZIP2大量表达，载体示意图分别如图2C和6C所示。
将普通小麦中国春花后15天的籽粒用70%的酒精消毒，基因枪轰击胚乳，使上述重组质粒在胚乳实现瞬时表达，后续于高渗培养基中避光培养48小时；提取胚乳的总RNA，反转录成cDNA；RT-PCR验证TubZIP2、TabZIP-A2、TabZIP-B2和TabZIP-D2的瞬时表达及其对SSRG基因表达的影响，结果如图2D（TubZIP2）所示，和导入空载质粒的野生型胚乳相比，TubZIP2能显著提高AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa 的启动子活性；TabZIP2的结果如图6D所示，TabZIP-A2、TabZIP-B2和TabZIP-D2都能上调SSRG基因的表达，其中以TabZIP-B2的上调强度最大，TabZIP-D2效果不明显。
小麦TubZIP2过表达系RNA-seq及表型鉴定（1）小麦转基因植株筛选：构建利用Glu-1Bx14启动子驱动TubZIP2过表达的载体,使该转录因子在籽粒胚乳特异表达，并于中国科学院遗传与发育生物学研究所转基因平台进行基因枪转化，得到的转化苗种植于温室，并按常规方法小量提取其基因组DNA，取100 ng基因组DNA为模板，用引物对（SEQ IDNo.5所示和SEQ ID No.6所示），通过常规PCR扩增，以野生型小麦基因组DNA为对照，进一步检测阳性植株。纯合自交至T2代的转基因小麦用于后续实验。
（2）过表达系小麦RNA-seq:分别对花后7天、14天和21天的胚乳取材，液氮迅速冻存，将材料放置与-80℃冰箱，利用Trizol进行RNA提取，三个重复样品进行转录组测序（RNA-seq）。同时将RNA反转录成cDNA，以Ta4045（ubiquinol-cytochrome C reductaseiron-sulfur subunit）作为对照，利用SSRG基因的特异引物，通过RT-PCR验证SSRG基因的表达。结果如图3A和图3B，RNA-seq和RT-PCR验证结果均表明TubZIP2在三个时期的表达均显著上调；图3C和图3D表明TubZIP2在花后7天没有明显的调控作用；图3E和3F所示，TubZIP2在花后14天能显著增加AGPL-cyto、AGPS-cyto和SBEIIa基因的表达；图3G和图3H表明，该基因在花后21天的调控作用减弱，主要上调SBEIIa基因的表达。
（3）成熟种子总淀粉含量测定：总淀粉含量通过总淀粉试剂盒进行测定(K-TSTA;Megazyme)。结果如图4A所示，过表达系小麦的总淀粉含量在北京，河北堤上和赵县三个地点相比于野生型明显提高，三个系OE82、OE85和OE87分别平均提高约2.88%、4.93%和4.38%。AGPS-cyto和AGPL-cyto是淀粉生物合成通路中的限速酶，总淀粉含量的增加与转基因系二者的转录水平增加有关。
（4）成熟种子电镜扫描：用刀片对野生型和过表达系小麦的成熟籽粒进行横切，对横切面进行电镜扫描。如图4B所示，过表达系有更多的A型淀粉颗粒，这与总淀粉含量增加相一致。
（5）成熟种子直链淀粉含量测定：利用DPCZ-II型直链淀粉分析仪对过表达系和野生型的面粉进行直链淀粉含量测定，总淀粉含量和直链淀粉含量的差值即为支链淀粉含量。如图4C所示，三个地点过表达系的支链淀粉含量均显著高于野生型，其中OE82平均提高4.79%，OE85和OE87分别提高8.06%和7.50%，这个结果与SBEIIa催化合成支链淀粉合成相符。河北堤上和赵县的直链淀粉含量没有差异（赵县的OE87有9.57%的减少），但是北京地区的OE82、OE85和OE87直链淀粉含量分别减少7.15%、5.02%和5.60%，图4D所示。由于支链淀粉含量的增加和直链淀粉含量稳定不变甚至降低导致三个地点三个过表达系直链淀粉/支链淀粉的值显著降低（堤上和赵县的OE82的直链淀粉/支链淀粉没有明显变化），如图4E所示。
（6）过表达系成熟种子RVA特性：快速粘度分析仪（RVA）被广泛地用于评估淀粉的糊化特性，RVA产生的峰值粘度与直链淀粉与支链淀粉的比例呈负相关，与直支比下降相一致，如图4F所示，北京种植的过表达系小麦峰值粘度均显著增加。。
(7) 过表达系小麦的植株表型鉴定：对三个地点的转基因小麦的性状进行调查，如图5A、5B和5F分别表示野生型和过表达系的植株，穗子和籽粒性状；图5C、5D和5E分别表示过表达系的株高、有效分蘖和单株小穗数和野生型的没有显著差异；图5G、5H和5I分别表示籽粒的粒长、粒宽和千粒重，其中粒长没有显著差异，过表达系的粒宽和千粒重均高于野生型。其中OE85的粒宽增加幅度最大，高达6.62%，OE82增幅最小，只有3.72%。粒宽的增加引起籽粒千粒重的变化，OE85千粒重平均增加最多，高达13.50%，OE82和OE87平均增加6.98%和11.46%。
小麦TabZIP2敲除系的表型鉴定
（1）敲除系成熟种子总淀粉含量测定：2017-2018年种植于北京、河北堤上和赵县三个地区的小麦TabZIP2敲除系T2代株系用于后续测定。总淀粉含量通过总淀粉试剂盒进行测定(K-TSTA; Megazyme)。如图7A所示，北京、堤上和赵县地点敲除系的总淀粉含量均显著低于野生型，bZIP2kn-ab 、bZIP2kn-abd1和 bZIP2kn-abd2平均降低4.18%，5.69% 和5.75%。
（2）敲除系成熟种子电镜扫描：野生型和敲除系小麦的成熟籽粒，刀片横切，对横切面进行电镜扫描，籽粒的A、B型淀粉粒分布随总淀粉降低发生变化。如图7B所示，敲除系含有更少的A型淀粉粒。
（3）敲除系成熟种子直链淀粉含量测定：利用DPCZ-II型直链淀粉分析仪对野生型和敲除系的面粉进行直链淀粉含量测定，总淀粉含量和直链淀粉含量的差值即为支链淀粉含量，如图7C所示，三个地点敲除系的支链淀粉含量，除了堤上的bZIP2kn-ab变化不明显，其它三个地点的三个系均显示下降，bZIP2kn-ab平均下降3.42%，bZIP2kn-abd1和bZIP2kn-abd2则分别下降5.57%和10.10%。总淀粉含量和支链淀粉含量的下降与敲除系中TabZIP2对TaAGPL-cyto、TaAGPS-cyto和TaSBEIIa的转录活性下降相一致。 （4）敲除系成熟种子RVA特性：通过RVA对面粉的粘度进行分析，如图7D所示，敲除系的峰值粘度显著低于野生型。敲除系支链淀粉含量的下降引起RVA的峰值粘度显著下降。
（5）敲除系成熟种子籽粒性状：如图7E和图7F所示，三个地点敲除系的粒宽和千粒重均显著低于野生型，其中bZIP2kn-ab、bZIP2kn-abd1和 bZIP2kn-abd2粒宽平均降低3.79%、5.40%和5.78%，对应的千粒重平均降低9.19%、14.78%和15.30%。TabZIP2敲除系中TaAGPL-cyto、TaAGPS-cyto和TaSBEIIa的转录活性下降，导致成熟籽粒的总淀粉含量和支链淀粉含量下降，进而引起籽粒粒宽显著下降，进一步导致籽粒千粒重相比野生型显著降低。
<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120>一个提高小麦籽粒总淀粉含量和支链淀粉含量的转录因子bZIP2及其应用
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<212> CDS
<213> TubZIP2，小麦属，普通小麦（Triticum aestivum L.）
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ATGGCCATCG CGGAGGCGTC CCCCTTCGCG GACCTGCCCT TCCCCGACGA CCTGCCGGAGTTCCCGCACG GCCCCGTCGG GGACGACGAC GCCTTCGCCC TGGACGGCTT CGATCTCGAC GATCTGGACATCGACTTCGA CTTCGACCTC GACCTCGACC TCCTCCCCAC CGACGACGTG CGGCTCCCGT CGCCGCCGCCGCCGCTCGCC ACGTCCTCCT CCTCGGCCGG GTCGCCGGGC GGGGCAGGGG ACTCCTCCTC CGGCTCCGGTGGCGGAGCGG ACGGCGGCCT GAAGAACGAC GAGTCCTCGG AGACGTCTTC GAGGAGCGCG AGCGCTGGGAGCGACGGCAA GGCTAAGGAG GGGGAGGGTG AGGACGACAA GCGGCGGGCG CGGCTGGTGC GGAACCGGGAGAGCGCGCAC CTGTCGCGGC AGAGGAAGAA GCAGTACGTG GAGGAGCTGG AGGGGAAGGT CAAGGCCATGCAGGCCACCA TCGCCGACCT CTCCACCAGG ATCTCCTGCG TCACTGCTGA GAACGCCGCT CTCAAGCAGCAACTGGCCGG TGCTGGTGGA GCAGGCGTCC CGCCGCCGCT GCCGATGTAC CCGGGATTGT ACCCTTTGCCGCTGCCATGG ATGCACCCGG CTTATGCGAT GGGAGCGCGC GGCTCCCAAG TGCCGCTCAT GCCGATACCTCGGCTGAAAA CCAAGCAGCC TGCGTCGGCT GCCGCAGAGC CACCGGCCAA GAAGTCTAGG AAGACCAAGAAGGTTGCCAG TGTTAGCCTC CTTGGATTGC TGTTCCTGAC GATGCTCTGT GGGTGTTTGG TTCCTGCGGTAAATCGGATG TATGGAGCAG TTGATTCCCG AGAAGGAATT GTGCTTGGTC CATCACAATC ACGTCATGGGAGGGTTCTGG CTGTTGACGG GCCTCGAGAT GGTGTCCCGG AAGGTGTTGA TTCGAAGTTG CCACATAATTCAAGTGAGAC GCTCCCGGCC TTGTTGTATA TTCCAAGGAA TGGGAAGCAT GTCAAGATCA ATGGAAATCTTGTTATCCAG TCTGTTGTTG CGAGTGAGAA AGCTTCTTCG CGCATGTGTC ACTCTGATGG GAAGACTTCATGTAACCAAG GACAAGAAGA TACTAGTTTG GCAATTCCTG GCCATGTTGC TCAGTTGAAT TCTGGAGAAGTCATGGAATC TGCTAAAGCA ATAAAAAATA AACTGATGGC TTTACCTCCT GGAGATGGAA GCATATACAGAGACGATGAT GAATTACTGC CACAATGGTT TAGTGAAGCA ATGTCAGGTC CTATGTTGAG TTCCGGAATGTGCACCGAAG TGTTCCAGTT TGATATATCG CCGACCACCA TTGTTCCTGT CTACTCCAGT GGTATGCACAATGCATCACA TAACTCCACG GAGAACCTCC CCTCCAGTCA GTCCCATAAG GTCAAGAACA GAAGGATTTTACATACCATG GCCGTTCCCC TAAAAGGTTC AACGTCCAAC CACACCGATC ACCTCAAAGC GCACCCCAAGAACGAGAGCT TTGCTGGAAA GAAACCGGCT TCATCGGTGG TGGTCTCTGT CCTGGCTGAC CCTAGAGTGGATGCTGATGG AAGGATCTCT TCGAAGTCAT TGTCGCGTAT ATTTGTTGTA GTCCTCGTTG ACAGTGTAAAGTATGTCACT TACTCTTGCG TCCTGCCGTT CAAAACCCAT AGCCCTCATC TG
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<213> TabZIP-A2，小麦属，普通小麦（Triticum aestivum L.）
<400> 2
ATGGCCATCG CGGAGGCGTC CCCCTTCGCG GACCTGCCCT TCCCCGACGA CCTGCCGGAGTTCCCGCACG GCCCCGTCGG GGACGACGAC GCCTTCGCCC TGGACGGCTT CGATCTCGAC GATCTGGACATCGACTTCGA CTTCGACCTC GACCTCGACC TCCTCCCCAC CGACGACGTG CAGCTCCCGT CGCCGCCGCCGCCGCTCGCC ACGTCCTCCT CCTCGGCCGG GTCGCCGGGC GGGGCAGGGG ACTCCTCCTC CGGCTCCGGTGCCGGAGCGG ACGGCGGCCT GAAGAACGAC GAGTCCTCGG AGACGTCTTC CAGGAGCGCG AGCGCTGGAAGCGACGGCAA GGCTATGAAC GGGGAGGGTG AGGACGACAA GCGGCGGGCG CGGCTGGTGC GGAACAGGGAGAGCGCACAC CTGTCGCGGC AGAGGAAGAA GCAGTACGTG GAGGAGCTGG AGGGGAAGGT CAAGGCCATGCAGGCCACCA TCGCCGACCT CTCCACCAGG ATCTCCTGCG TCACGGCTGA GAACGCCGCT CTCAAGCAGCAACTGGCCGG TGCCGGTGGC GCAGGCGTCC CGCCGCCGCT GCCGATGTAC CCTGGATTGT ACCCTTTGCCGCTGCCATGG ATGCACCCGG CTTATGCGAT GGGAGCGCAC GGCTCCCAAG TGCCGCTCAT GCCGATACCTCGGCTGAAAA CCAAGCAGCC TGCGTCGGCT GCCGCAGAGC CACCGGCCAA GAAGTCTAGG AAGACCAAGAAGGTTGCTAG TGTTAGCCTC CTTGGATTGC TGTTCCTGAT GATGCTCTGT GGGTGTTTGG TTCCTGCGGTAAATCGGATG TATGGAGCAG TTGATTCCCG AGAAGGAATT GTGCTTGGTC CATCACAATC ACGTCATGGGAGGGTTCTGG CTGTTGACGG GCCTCGAGAT GGTGTCTTGG AAGGTGTTGA TTCGAAGTTG CCGCATAATTCAAGTGAGAC GCTCCCGGCG TTGTTGTATA TTCCTAGGAA TGGGAAGCAT GTCAAGATCA ATGGAAATTTGGTTATCCGG TCTGTTGTTG CGAGTGAGAA AGCCTCTTCG CGCATGTGTC ACTCTGATGG GAAGACTTCATGTAACCAAG GACAAGAAGA TACTAGTTTG GCAATTCCTG GCCATGTTGC TCAGTTGAAT TCTGGAGAAGTCATGGAATC TGCTAAAGCA ATAAAAAATA AACTGATGGC TTTACCTCCT GGAGATGGAA GCATATACAGAGACGATGAT GAATTACTGC CACAATGGTT TAGTGAAGCA ATGTCAGGTC CTATGTTGAG CTCCGGAATGTGCACCGAAG TGTTCCAGTT TGATATATCG CCGACCACCA TTGTTCCTGT CTACTCCAGT GGTATGCACAACGCATCACA TAACTCCACG GAGAACCTCA CCTCCAGTCA GTCCGATAAG GTCAAGAACA GAAGGATTTTACATTCCATG GCCGTTCCCC TAAAAGGTTC AACGTCCAAC CACACCGATC ACCTCAAAGC GCACCCCAAGAACGAGAGCT TTGCTGGAAA CAAACCGGCT TCATCAGTGG TGGTCTCTGT CCTGGCTGAC CCGAGAGTGGACGCTGATGG AAGGATCTCT TCGAAGTCAT TGTCGCGTAT ATTTGTTGTA GTCCTTGTTG ACAGTGTAAAGTATGTCACT TACTCTTGCG TCCTGCCGTT CAAAACCCAT AGCCCTCATC TG
<210> 3
<211> 1722
<212> CDS
<213> TabZIP-B2，小麦属，普通小麦（Triticum aestivum L.）
<400>3
ATGGCCCTCG CGGAGGCGTC CCCCTTCGCG GACCTGCCCT TCCCCGACGA CCTGCCGGAGTTCCCGCACG GCCCCGTCGG GGACGACGAC GCCTTCGCCC TGGACGGCTT CGATCTCGAC GATCTGGACATCGACTTCGA CTTCGACCTC GACCTCGACC TCCTCCCCAC CGACGACGTG CAGCTCCCGT CGCCCCCACCGCCGCTCGCC ACGTCCTCGT CCTCGGCCGG GTCGCCGGGC GGGGCAGGGG ACTCCTCCTC CGGCTCAGGTGGCGGAGCGG ACGGCGCCCT GAAGAACGAC GAGTCCTCGG AGACGTCTTC CAGGAGCGCG AGCGCTGGGAGCGACGGCAA GGCTAAGGAC GGGGAGGGTG AGGACGACAA GCGGCGGGCG CGGCTGGTGC GGAACCGGGAGAGCGCGCAT CTGTCGCGGC AGAGGAAGAA GCAGTACCTC GAGGAGCTGG AGGGGAAGGT CAAAGCCATGCAGGCCACCA TCGCCGACCT CTCCACCAGG ATCTCCTGCG TCACTGCCGA GAACGCTGCT CTCAAGCAGCAGCTGGCTGG CGCCGGTGGC GCAGGCGTCC CCCCGCCGCT GCCGATGTAC CCCGGATTGT ACCCTTTGCCACCGCCATGG ATGCACCCTG CTTATGCGAT GGGAGCGCGC GGCTCCCAAG TGCCGCTCAT GCCCATACCTCGGCTGAAAA CCAAGCAGCC TGCGTCGGCT GCCGCAGAGC CACCGGCCAA GAAGTCTAGG AAGACCAAGAAGGTTGCCAG TGTTAGCCTC CTTGGATTGC TGTTCCTGAT GATGCTCTGC GGGTGTTTGG TTCCTGCAGTAAATCGGATG TATGGACCAG TTGATTCCCG AGAAGGAATT GTGCTTGGTC CTTCACAATC ACGTCATGGGAGGGTTCTGG CTGTTGATGG GCCTCGAGAT GGTGTCTCGG AAGGTGTTGA TTCGAAGTTG CCACATAATTCAAGTGAGAC GCTCCCGGCA TTGTTGTATA TTCCGAGGAA TGGGAAACAT GTCAAGATCA ATGGTAATCTTGTTATCCAG TCTGTTGTTG CGAGTGAGAA AGCTTCTTCA CGCATGTGTC ACTCTGATGG GAAGACTTCATGTAACCAAG GACAAGAAGA TACTAGTTTG GCAATTCCTG GCCACGTTGC TCAGTTGAAT TCTGGAGAAGTCATGGAATC TGCTAAAGCA ATAAAAAATA AACTGATGGC TTTACCTCCT GGAGATGGAA GCATATACAGAGAGGATGAT GAATTACTGC CACAATGGTT TAGTGAAGCA ATGTCAGGTC CTATGTTGAG CTCTGGAATGTGCACCGAAG TGTTCCAGTT TGATATATCG CCAACCACCA TTGTTCCTGT CTACTCCAGT GGTATGCACAACGCATCACA TAACTCCACG GAGAACCTCC CCTCCAGTCA GTCCCATAAG GTCAAGAACA GAAGGATTTTACATTCCATG GCCATTCCCC TAAAAGGTTC AACGTCCAAC CACACCGATC ACCTCAAAGC GCACCCCAAGAACGAGAGCT TTGCTGGAAA CAAACCGGCT TCATCGGTGG TGGTCTCTGT CCTGGCTGAC CCTAGAGTGGATGCTGATGG AAGGATCTCT TCGAAGTCAT TGTCGCGTAT ATTTGTTGTA GTCCTTGTTG ACAGTGTAAAGTATGTCACT TACTCTTGCG TCCTGCCGTT CAAAACCCAT AGCCCTCATC TG
<210> 4
<211> 1722
<212> CDS
<213> TabZIP-D2，小麦属，普通小麦（Triticum aestivum L.）
<400> 4
ATGGCCATCG CGGAGGCGTC CCCCTTCGCG GACCTGCCCT TCCCCGACGA CCTGCCGGAGTTCCCGCACG GCCCCGTCGG GGACGACGAC GCGTTCGCCC TGGACGGCTT CGATCTCGAC GATCTGGACATCGACTTCGA CTTCGACCTC GACCTCGACC TCCTCCCCAC CGACGACGTG CAGCTCCCGT CGCCGCCGCCGCCGCTCGCC ACGTCCTCGT CCTCGGCCGG GTCGCCGGGC GGGGCAGGGG ACTCCTCCTC CGGCTCCGGTGGCGGAGCGG ACGGCGGCCT GAAGAACGAC GAGTCCTCGG AGACGTCTTC CAGGAGCGCG AGCGCTGGGAGCGACGACAA GGCTAGGGAT GGGGAGGGTG AGGACGCCAA GCGGCGCGCG CGGCTGGTGC GGAACAGGGAGAGCGCGCAC CTGTCGCGGC AGAGGAAGAA GCAGTACGTG GAGGAGCTGG AGGGGAAGGT CAAAGCCATGCAGGCCACCA TCGCCGATCT GTCCACCAGG ATCTCCTGTG TCACCGCCGA GAACGCTGCT CTCAAGCAGCAACTGGCTGG CGCAGGTGGT GCAGGGGTCC CGCCGCCGCT TCCTATGTAC CCAGGATTGT ACCCTTTGCCACCGCCATGG ATGCACCCGG CTTATGCGAT GGGAGCGCGC GGCTCCCAAG TGCCGCTCAT GCCGATACCTCGGCTGAAAA CCAAGCAGCC TGCGTCGGCT GCCGCAGAGC CACCGGCCAA GAAGTCCAGG AAGACCAAGAAGGTTGCGAG TGTCAGCCTC CTTGGATTGT TGTTACTGAT GATGCTCTGC GGGTGTTTGG TTCCTGCGGTAAATCGGATG TATGGAGCAG TTGATACTCG AGAAGGAATT GTGCTTGGTC CATCACAATC ACGTCATGGGAGGGTTCTGG CTGTTGATGG GCCTCGAGAT GGTGTCTCGG AAGGTGTTGA TTCGAAGCTG CCACATAATTCAAGTGAAAA GCTCCCGGCG TTGTTGTATA TTCCAAGGAA TGGGAAGCAT GTCAAGATCA ATGGAAATCTTGTTATCCAG TCTGTTGTTG CGAGTGAGGA AGCTTCTTCG CGCATGTGTC ACTCTGATGG GAAGACTTCATGTAACCAAG GGCAAGAAGA TACTAGTTTG GCAATTCCTG GCCATGTTGC TCAGTTGAAT TCTGGAGAAGTCATGGAATC TGCCAAAGCA ATAAAAAACA AACTGATGGC TTTACCTCCT GGAGATGGAA GCATATACAGAGACGATGAT GAATTACTGC CACAATGGTT TAGTGAAGCA ATGTCAGGTC CTATGTTGAG CTCCGGAATGTGCACCGAAG TGTTCCAGTT CGATATATCA CCGACCACCA TTGTTCCTGT CTACTCCAGT GGTATGCACAACGCATCACA TAACTCCACG GAGAACCTCC CCTCCAGTCA GTCCCATAAG GTCAAGAACA GAAGGATTTTACATTCCATG GCCATTCCCC TAAAAAGTTC AACGTCCAAC CACACCGATA ACCTCAAAGC GCACCCCAAGAACGAGAGCT TTGCTGGAAA CAAACCGGCT TCATCGGTGG TGGTCTCTGT CCTGGCTGAC CCTAGAGTGGATGCTGATGG AAGGATCTCT TCGAAGTCAT TGTCGCGTAT ATTTGTTGTG GTCCTTGTTG ACAGTGTAAAGTATGTCACT TACTCTTGCG TCCTGCCGTT CAAAACCCAT AGCCCTCATC TG
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<400> 5
ATGGCAGACCACCTTCAAGT
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工合成的序列
<400> 6
TCAGTACTTCCACATGCCATCC