阅读说明：本技术 角膜内皮细胞标记及其应用 (Corneal endothelial cell marker and application thereof ) 是由 西田幸二 辻川元一 原进 川崎谕 吉原正仁 伊藤昌可 川路英哉 于 2018-06-19 设计创作，主要内容包括：提供用于鉴定适于移植至角膜的细胞的方法,或使用该方法生产适于移植至角膜的细胞群的方法。生产适于移植至角膜的细胞群的方法,包括步骤：(1)制备在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群的步骤,以及(2)检测所述细胞群中选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B构成的组中的至少一种基因的表达的步骤。(Methods for identifying cells suitable for transplantation to the cornea, or methods for producing cell populations suitable for transplantation to the cornea using the methods, are provided. A method of producing a population of cells suitable for transplantation into the cornea, comprising the steps of: (1) a step of preparing a cell population cultured under conditions suitable for inducing differentiation into corneal endothelial cells, and (2) a step of detecting expression of at least one gene selected from the group consisting of POU6F2, LMX1B, and TFAP2B in the cell population.)

角膜内皮细胞标记及其应用

技术领域

本发明涉及鉴定、评估和生产角膜内皮细胞的相关技术。

背景技术

人角膜内皮细胞在体内破坏时，基本上不会再生，细胞数量不可逆地减少。细胞密度实质性减少，会引发大疱性角膜病变，使得角膜丧失透明度，并因此引起视力下降。迄今为止，通过利用供体角膜进行角膜移植，但是角膜内皮功能障碍是角膜移植适用最多的适应症，并且供体角膜短缺是一个严重的问题。

目前，正在研发使用成体干细胞和多能干细胞的角膜内皮再生疗法，但是，由于缺乏高度可靠的角膜内皮细胞特异性标记物，所以难以鉴定最终目标产物为角膜内皮细胞。现在，已经报告几种可以用作角膜内皮细胞标记物的分子(专利文献1)。但是，还没有用于鉴定成熟角膜内皮细胞的标记物的相关报告，并且，尚不清楚角膜内皮细胞的成熟相关的分子机制。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：WO2016/035874

发明内容

本发明解决的技术问题

本发明的目的是提供用于鉴定适于角膜移植的细胞的方法，以及在该方法的基础上提供适于角膜移植的细胞的生产方法等。

问题的解决方案

本发明人在广泛研究后，发现特定基因可以作为角膜内皮细胞特异性的标记物。基于此发现，在进一步研究和探究之后，提供由以下主题代表的本发明。

项A1

生产适于移植至角膜的细胞群的生产方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群的步骤，以及

(2)上述细胞群中，检测POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达的步骤。

项A2

根据项A1所述的方法，其中，适于移植至角膜的细胞群中的所述基因的表达水平等于或高于参考值。

项A3

根据项A1或A2所述的方法，其中步骤(1)是在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养干细胞的步骤。

项A4

根据项A1至A3中任一项所述的方法，其中持续进行步骤(1)，直至所述基因的表达水平等于或高于参考值。

项A5

根据项A1至A4中任一项所述的方法，其中所述基因是选自POU6F2和LMX1B组成的组中的至少一种基因。

项B1

判断在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群是否适于移植至角膜的方法，包括在所述细胞群中检测POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达。

项B2

根据项B1所述的方法，其中所述细胞群是通过在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养干细胞而获得的细胞群。

项B3

根据项B1或B2所述的方法，其中，当所述基因的表达水平等于或高于参考值时，判断所述细胞群适于移植至角膜中。

项B4

根据项B1至B3中任一项所述的方法，其中，所述基因是选自POU6F2和LMX1B组成的组中的至少一种基因。

项C1

生产适于移植至角膜的细胞群的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备在适于培养角膜内皮细胞的条件下培养细胞群的步骤，以及

(2)检测所述细胞群中选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达的步骤。

项C2

根据项C1所述的方法，其中，适于移植至角膜中的细胞群中所述基因的表达水平等于或高于参考值。

项C3

根据项C1或C2所述的方法，其中步骤(1)中，在适于培养所述角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群，包括来自角膜内皮的细胞。

项C4

根据项C1至C3中任一项所述的方法，其中所述基因是选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因。

项D1

判断在适于培养角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群是否适于移植至角膜的方法，包括在所述细胞群中检测选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组的至少一种基因的表达。

项D2

根据项D1中所述的方法，其中在适于培养角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群，包括来自角膜内皮的细胞。

项D3

根据项D1或D2所述的方法，其中，当所述基因的表达水平等于或高于参考值时，判断所述细胞群适于移植至角膜。

项D4

根据项D1至D3中任一项所述的方法，其中所述基因为选自POU6F2和LMX1B组成的组中的至少一种基因。

项E1

生产包含细胞群的悬液、细胞片或细胞球体的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群的步骤，以及

(2)检测所述细胞群中选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达的检测步骤，以及

(3)生产包含表达所述基因的细胞群的悬液、细胞片或细胞球体的步骤。

项E2

根据项E1所述的方法，其中步骤(1)是在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养干细胞的步骤。

项E3

根据项E1或E2中任一项所述的方法，其中，所述基因是选自POU6F2和LMX1B组成的组中的至少一种基因。

项F1

治疗需要角膜移植患者的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群的步骤，

(2)检测细胞群中选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达的步骤，以及

(3)将表达所述基因的细胞群移植至需要角膜移植的患者的步骤。

项F2

根据项F1所述的方法，其中步骤(1)是在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养干细胞的步骤。

项F3

根据项F1或F2中任一项所述的方法，其中所述基因是选自POU6F2和LMX1B组成的组中的至少一种基因。

项G1

生产包含细胞群的悬液的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备在适于培养角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群的步骤，

(2)检测所述细胞群中选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达的步骤，

(3)生产包含表达所述基因的细胞群的悬液、细胞片或细胞球的步骤。

项G2

根据G1项所述的方法，其中，在适于培养所述角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群包括来自角膜内皮的细胞。

项G3

根据项G1或G2中任一项所述的方法，其中所述基因是选自POU6F2和LMX1B组成的组中的至少一种基因。

项H1

治疗需要角膜移植的患者的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)制备在适于培养角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群的步骤，

(2)检测所述细胞群中选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达的步骤，以及

(3)将表达所述基因的细胞群移植至需要角膜移植的患者的步骤。

项H2

根据项H1所述的方法，其中在适于培养所述角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群包括来自角膜内皮的细胞。

项H3

根据项H1或H2中任一项所述的方法，其中所述基因是选自POU6F2和LMX1B组成的组中的至少一种基因。

项I1

选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因来确定细胞群是否适于移植至角膜中的用途。

项I2

根据项I1所述的用途，其中所述基因是选自POU6F2和LMX1B组成的组中的至少一种基因。

发明的有益效果

在一个实施方案中，提供了判断细胞群是否适于角膜移植的方法。在一个实施方案中，提供了用于高效生产适于角膜移植的细胞群的方法。

附图说明

图1显示人体组织样品中TFAP2B的表达水平。

图2显示培养的人体细胞样品中TFAP2B的表达水平。

图3显示人体组织样品中LMX1B的表达水平。

图4显示培养的人体细胞样品中LMX1B的表达水平。

图5显示人体组织样品中POU6F2的表达水平。

图6显示培养的人体细胞样品中POU6F2的表达水平。

图7显示检测iPS细胞(iPS)的诱导细胞(神经嵴细胞(iNC)等)，以及眼内组织中的基因表达的定量PCR结果。使用如下缩写：iPS：iPS细胞，iNC：iPS细胞诱导的神经嵴细胞，HCEC：培养角膜内皮细胞，HCEP：角膜内皮祖细胞，dHCEP：分化诱导角膜内皮祖细胞，Cendo：活体角膜内皮，CS：角膜基质，IS：虹膜基质，CB：睫状体，TM：小梁网，Clim：角膜缘部上皮，Cepi：角膜中央上皮，LF：角膜缘成纤维细胞，Cj：结膜上皮，LN：晶状体，IE：虹膜上皮，RPE：视网膜色素上皮，Retina：视网膜，ON：视神经。

图8显示成人来源的人角膜内皮和人类胎儿来源的角膜内皮的POU6F2、LMX1B和TFAP2B的RNA-seq数据分析的结果。

具体实施方式

在下文中，将主要描述上述的代表性发明。

“细胞群”是指由多个细胞组成的群。形成细胞群的单个细胞可以是相同类型的细胞或不同类型的细胞。

“适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件”指适于诱导细胞分化为角膜内皮细胞的已知(或以后开发)的条件。适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件的实例包括WO2013/051722、WO2016/114242、WO2016/114285或WO2016/035874中公开的条件。WO2013/051722、WO2016/114242、WO2016/114285和WO2016/035874通过引用并入本文。“在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群”也可以称作“诱导分化为角膜内皮细胞的细胞群”。诱导分化为角膜内皮细胞的细胞群可以包括角膜内皮细胞和/或角膜内皮祖细胞。

只要能够达到目的，用于诱导分化为角膜内皮细胞的培养基没有限制。在一个实施方案中，培养基优选为无血清培养基。无血清培养基指不含有未条件化或未纯化的血清的培养基；含有经过纯化的血液来源的成分或动物组织来源的成分(例如，生长因子)的培养基属于无血清培养基。

培养基的实例包括用于培养动物细胞的DMEM培养基、BME培养基、αMEM培养基、无血清DMEM/F12培养基、BGJb培养基、CMRL1066培养基、Glasgow MEM培养基、Improved MEMZinc Option培养基、IMDM培养基、Medium 199培养基、Eagle MEM培养基、Ham’s培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、McCoy’s培养基、Williams E培养基、Essential8培养基、mTeSR1(Stem Cell Technologies)、TeSR-E8 medium(Stem Cell Technologies)、StemSure(和光纯药)、mESF培养基(和光纯药)、StemFit(味之素)、S-medium(DS Pharma)、ReproXF(Reprocell)、PSGro-free人iPSC/ESC生长培养基(StemRD)、hPSC生长培养基(Takara Bio)、ReproFF2(Reprocell)、EX-CELL 302培养基(SAFC)，KnockOut TMDMEM、Medium154、StemPro(注册商标)hESC SFM、EX-CELL-CD-CHO(SAFC)或STEMdiff APEL培养基(Stemcell Technologies)等，以及这些培养基的混合物。在一个实施方案中，培养基优选为干细胞培养基。

所述培养基可以含有血清替代物。血清替代物，举例来说，包括白蛋白(例如富脂白蛋白)、转铁蛋白、脂肪酸、胶原蛋白前体、微量元素(例如锌、硒)、B-27(注册商标)添加剂、N2添加剂、KnockOut血清替代物(KSR：由Invitrogen制造)、2-巯基乙醇、3'-巯基甘油等。以B-27添加剂为例，培养基中血清替代物的浓度为0.01至10％重量，或0.5至4％重量。

在培养基中可适当添加细胞的维持和生长和/或分化诱导所需的各种成分。这些成分的实例包含例如甘油、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蜂蜜、淀粉、糊精等碳源，例如脂肪酸、脂肪和油、卵磷脂、醇等烃类，例如硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、尿素、硝酸钠等氮源，例如食盐、钾盐、磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等无机盐，以及磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化钠、硫酸亚铁、钼酸钠、钨酸钠和硫酸锰、各种维生素类、氨基酸类等。

培养基可以含有或不含有例如BMP4(Bone morphogenetic protein4，骨形态发生蛋白4)、转化生长因子和激活素等分化诱导剂。在一个实施方案中，培养基优选为实质上不含上述一种或以上、两种或以上、或全部分化诱导剂。在此，“实质上不含有”指浓度小于0.5nM以下或检测不到的水平。

培养基可以含有或不含有例如高浓度的视黄酸、BMP抑制剂、TGFβ抑制剂以及头蛋白(Noggin)等分化诱导促进剂。高浓度视黄酸指约1μM、尤其是10μM的视黄酸。在一个实施方案中，培养基优选为实质上不包含上述一种或以上、两种或以上或全部分化诱导促进剂。培养基可以含有或不含有Wnt、Wnt信号激活剂、腱蛋白(Chordin)等。在一个实施方案中，培养基优选为实质上不含有以上物质。

在一个实施方案中，培养基优选为含有GSK3抑制剂、视黄酸，TGFb2、胰岛素和ROCK抑制剂组成的组中的一种或以上、两种或以上、三种后以上或四种或以上，或包含全部分化诱导因子。

培养基的pH值调节范围为5.5～9.0、6.0～8.0或6.5～7.5。培养温度可以设置为36℃～38℃或36.5℃～37.5℃。培养的气体环境为1％～25％O₂和1％～15％CO₂。

培养时间没有特别的限制，例如，可以设定范围为1周～8周、2周～6周、3周～5周。

培养时可以使用用于细胞培养的任何容器。容器的实例包括微型板、微孔板、多平台(multiplates)、多孔板、微玻片、室玻片、皿(Schale)、烧瓶、组织培养瓶、培养皿、皮氏(Petri)培养皿、组织培养皿和多孔皿、管、盘、培养袋、滚瓶等。

培养容器的内表面可以涂覆胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白或层粘连蛋白片段(例如层粘连蛋白E8片段和层粘连蛋白511E8片段)、玻连蛋白、基底膜基质、明胶、透明质酸、多聚赖氨酸、玻连蛋白和透明质酸中的任何一种或多种。

在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下用于培养的细胞的类型没有特别的限制。在一个实施方案中，所述细胞优选为干细胞。干细胞的实例包括诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells；iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、胎儿原始生殖细胞衍生的多能干细胞(EG细胞)、睾丸来源的多能性干细胞(GS細胞)以及能够分化为角膜内皮细胞的人成体干细胞(组织干细胞)。在一个实施方案中，干细胞优选为iPS细胞。

iPS细胞可以通过任何方法获得，包括已知方法和以后开发的方法。例如，可以通过将特异性的重编程因子以DNA或蛋白质形式引入体细胞中来产生iPS细胞。重编程因子的实例包括Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas，ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3和Glis1等。重编程因子可以单独或组合使用。重编程因子的组合的实例记载在，例如，WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194，WO2009/058413和WO2009/057831等。体细胞的类型没有特别限制，包括迄今已证实产生iPS细胞的任何细胞以及以后报道的任何细胞。在一个实施方案中，体细胞的优选实例包括成纤维细胞和白细胞等。优选的体细胞的来源于人。

ES细胞可以通过任何可用技术获得，例如，通过从哺乳动物(优选人)的受精卵的胚泡中取出内部细胞团，并在成纤维细胞饲养层上培养内部细胞团来建立。哺乳动物没有特别限制，但优选为人。可以使用添加了例如白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor(LIF))和/或碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor(bFGF))等物质的培养液通过传代培养来维持ES细胞。可以使用例如OCT-3/4、NANOG和ECAD等基因标志物的表达作为指标选择ES细胞。

EG细胞是从胚胎原始生殖细胞建立的，具有与ES细胞相同的多能性，在存在LIF、bFGF和干细胞因子等物质的情况下，可以通过培养原始生殖细胞来建立(Y.Matsui et al.(1992)，Cell，70:841-847；J.L.Resnick et al.(1992),Nature，359:550-551)。

GS细胞是睾丸衍生的多功能干细胞，是***形成的起源。与ES细胞相似，GS细胞可以诱导分化为各种类型的细胞。GS细胞能够在含有神经胶质细胞源性神经营养因子(glialcell line-derived neurotrophic factor(GDNF))的培养基中自我更新，可以通过与ES细胞相同的培养条件下进行重复传代培养来获得***干细胞(M.Kanatsu-Shinohara et al.(2003)Biol.Reprod.,69:612-616)。

能够分化为角膜内皮细胞的成体细胞干细胞的实例包括角膜基质衍生的神经嵴干细胞(COPs)、间充质干细胞和皮肤衍生的多能祖细胞(skin-derived precursors:SKPs)等，优选为COPs和SKPs。例如，COPs的制备方法如下：从角膜去除上皮和内皮后，用胶原酶处理角膜基质，然后在含有EGF、FGF2、B27添加物以及LIF的DMEM/F12培养基中培养分离的细胞。SKPs可以根据例如Nat Cell Biol.，2001vol.3，778-784中描述的方法制备。

“适于培养角膜内皮细胞的条件”指在保持角膜内皮细胞的特性的同时适于其生长的条件。“适于培养角膜内皮细胞的条件”可以是或不是能够使角膜内皮细胞增殖的条件。“适于培养角膜内皮细胞的条件”包含在保持角膜内皮细胞的特性的同时适于其生长的已知的(例如，WO2014/104366中公开的条件)或今后开发的条件。在适于培养角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群可以包括角膜内皮细胞和/或角膜内皮祖细胞。

适于培养角膜内皮细胞的条件的具体实例包括通常用于上述动物细胞培养的培养基中的培养条件。在一个实施方案中，可以将葡萄糖添加到培养基中。培养基中的葡萄糖浓度为2.0g/L或以下，或0.1～1.0g/L。在一个实施方案中，优选地将例如肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、重组EGF(rEGF)、胰岛素和/或成纤维细胞生长因子(FGF)等生长因子添加至培养基。可以向培养基中单独添加这些因子中的一种，或两种或多种因子的组合。培养基中生长因子的浓度通常为1～100ng/mL，优选为2～5ng/mL。从高效培养角膜内皮细胞的角度出发，优选向培养基中添加5

1000μg/mL的抗坏血酸衍生物，例如抗坏血酸2-磷酸酯。另外，用于培养基的pH、温度、培养容器等如上描述。培养时间没有特别限制，例如可以培养至细胞发生汇合(稳定状态)为止(例如1

5天)。在一个实施方案中，优选为使用间充质干细胞(MSC)的条件培养基培养角膜内皮细胞。

对于在适于培养角膜内皮细胞的条件下用于培养的细胞的类型没有特别的限制。例如，可以使用从角膜分离的角膜内皮细胞，或通过诱导分化为角膜内皮细胞而获得除角膜内皮细胞以外的细胞(例如，在上述“适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件”下通过诱导分化获得的细胞)。

从角膜分离角膜内皮细胞的方法没有特别限制，可以适当选择本领域已知方法以及以后开发的方法。例如，从带有附着于Descemet膜的角膜内皮细胞的人角膜缘分离Descemet膜的后，将其切碎并在37℃的5％CO₂中并含有约0.2％胶原酶的培养基中培养1-3小时。培养基可以使用含有15％胎牛血清(FCS)和2ng/mL碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的DME培养基。然后，通过离心洗涤除去成纤维细胞等，并进行胰蛋白酶消化，从而得到含有丸状的角膜内皮细胞的细胞群(原代培养细胞)。

“POU6F2”是编码属于具有POU同源域的POU家族的转录因子的基因。已经报告其在中枢神经系统、视网膜神经节细胞和无长突细胞中的表达，也被称作视网膜源性POU域因子-1(retina-derived POU-domain factor-1(RPF-1))(Zhou H et al.JNeurosci.1996.PMID:8601806)。并且，也已经报告在Wilms肿瘤患者中存在种系突变，表明了POU6F2在肾脏发育阶段负责基因表达控制(Perotti D et al.Hum Mutat.2004.PMID:15459955,Fiorino A et al.Int J Biochem Cell Biol.2016.PMID:27425396)。

“LMX1B”是编码属于LIM同源域家族的转录因子的基因。LMX1B是Nail-Patella综合症(指甲-髌骨综合征)的致病基因，已经报告其不仅与四肢发育相关，也与肾脏的肾小球基底膜的发育相关。

“TFAP2B”是编码属于AP-2家族的转录因子的基因。已经有报告其为以特殊面部特征、动脉导管未闭和第五指中指骨发育不全为主要症状的Char综合症的致病基因(SatodaM et al.Nat Genet.2000.PMID:10802654)。

制备在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群的步骤可以通过在适于诱导分化为上述角膜内皮细胞的条件下培养上述细胞来进行。在一个实施方案中，在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群可以是通过称为角膜内皮细胞标记物的分子作为指标来筛选。角膜内皮细胞标记物的实例包括在WO2009/057831中公开的分子(例如ZP4、MRGPRX3、GRIP1、GLP1R、HTR1D、CLRN1、SCNN1D、PKD1、CNTN6、NSF、CNTN3、PPIP5K1和PCDHB7)。利用角膜内皮细胞标记物作为指标筛选细胞群可以使用任何方法，例如使用FACS进行。在一个实施方案中，优选地，在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下，培养以角膜内皮标记物作为指标的筛选得到的细胞群。

在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群的形式没有特别限制。例如，根据常规方法，细胞群可以是单层、多层、片、球或悬浮的形式。在一个实施方案中，细胞群优选为悬浮形式。当在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群为单层时，可以按照常规方法使细胞群处于悬浮形式。可以通过使用例如，蛋白水解酶(例如胰蛋白酶)和/或用于破坏细胞间粘附分子的螯合剂来悬浮细胞群而获得悬浮样细胞群。在检测选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达之前或之后的任何时间，制备例如单层、多层、片、球或悬浮的任何形式的细胞群。

在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群中，或在适于培养角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群中，可以使用任何已知的方法或今后开发的检测细胞内基因表达的方法进行检测选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达。检测能够判断基因是否表达即可，在一个实施方案中，优选为定量测定。例如，优选为通过PCR法或类似方法检测细胞内每个基因mRNA水平(优选为定量测定)。

在一个实施方案中，选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因，优选地包含POU6F2或LMX1B，优选地包含POU6F2。在一个实施方案中，优选地仅检测POU6F2的表达，在其他实施方案中，优选地检测POU6F2和LMX1B的组合，或POU6F2、LMX1B和TFAP2B的组合。

如后述实施例所示，POU6F2、LMX1B和TFAP2B的基因在角膜内皮细胞和角膜内皮祖细胞中特异性表达。因此，利用这些基因的表达作为指标，能够获得适于移植至角膜的角膜内皮细胞或细胞群，也能够利用这些基因的表达作为指标来判断细胞群是否适于移植至角膜。也就是说，如果这些基因在细胞群中表达，则可以判断其适于移植至角膜；如果这些基因不表达，则可以判断其不适于移植至角膜。并且，POU6F2在相对成熟的角膜内皮细胞中高水平表达。因此，能够利用POU6F2的表达或其表达水平作为指标来获得相对成熟的角膜内皮细胞或适合移植至角膜的细胞群。

选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达水平的检测可以直接检测组成在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群的所有细胞，或者不需要检测所有细胞；通过检测组成细胞群的部分细胞的基因表达水平，可以间接检测组成细胞群的其余细胞中的基因表达水平。在一个实施方案中，所述基因表达的检测优选在组成细胞群的一部分细胞上进行，而间接检测其余的细胞的基因表达，尤其是涉及导致细胞死亡的检测基因表达的方法。

细胞群中的选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因高水平表达，表明该细胞群适于移植至角膜中。在一个实施方案中，所述基因在细胞群中的表达水平优选为等于或高于预设的参考值。参考值可以从适于移植至角膜的角度出发任意地确定。例如，参考值可以设定为等于或高于活体角膜内皮细胞和/或培养角膜内皮中所述基因的表达水平。

判断在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群不表达选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组的至少一种基因，或所述细胞中选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组的至少一种基因的表达水平不足时，可以在更适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养所述细胞群。可以持续这样条件的进一步培养，直至细胞群表达的所述基因或判断基因的表达水平已经足够(例如，直到其等于或高于参考值)。

因此，可以将已经确定选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因表达的细胞群用作适于移植至角膜的细胞群。所述细胞群可以用作再生角膜内皮的细胞制剂。包含所述细胞群的细胞制剂可以包含用以帮助维持、生长或向患病区域施用的支架材料、成分和其它药学上可接受的载体。细胞维持或生长的成分的实例包括碳源、氮源、维生素、矿物质、盐、各种细胞因子等培养基成分，或例如Matrigel^TM等细胞外基质制剂等。

支架材料或成分的实例包括生物降解的聚合物，例如胶原蛋白、聚乳酸、透明质酸、纤维素及其衍生物，和含有上述两种或以上成分构成的复合物等；注射溶液，例如生理盐水、培养基、PBS等生理缓冲溶液，以及含有葡萄糖或/或其他佐剂的等渗溶液(例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠)。

细胞制剂可包含增溶剂，例如醇(具体为乙醇)，多元醇，例如丙二醇、聚乙二醇、非离子表面活性剂(例如聚山梨酸酯80，HCO-50等)。

其它药学上可接受的载体包括药学上可接受的有机溶剂、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、***胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、以及可用作药物添加剂的表面活性剂、缓冲剂、乳化剂、助悬剂、舒缓剂、稳定剂等。

给予细胞制剂的对象(患者)没有特别限制，只要认为必要即可。例如，受试者伴有的症状可以包括例如福克斯(Fuchs)角膜内皮营养不良等遗传性内皮疾病，伴随青光眼的角膜内皮异常，内眼手术后的角膜内皮疾病，疱疹等病毒感染后的角膜内皮疾病，角膜移植后角膜内皮减少相关的综合症等。在一个实施方案中，向其施用细胞制剂的受试者可以是具有角膜内皮功能障碍的患者(例如，角膜内皮细胞泵送和屏障功能下降的患者)，大疱性角膜病变、角膜浮肿、角膜白斑和/或圆锥角膜患者。细胞制剂的给药形式没有特别限制。例如，可以通过注射针注射入眼球中。

3.判断细胞群是否适于移植至角膜的方法B

在一个实施方案中，判断细胞群是否适于移植至角膜的方法优选为包含以下的检测步骤，即在适于诱导分化为角膜内皮细胞的条件下培养的细胞群中检测选自POU6F2、LMX1B和TFAP2B组成的组中的至少一种基因的表达水平的步骤。

实施例

以下实施例进一步说明本发明，但本发明不限于此。

获取人角膜缘片，在显微镜下剥离Descemet膜以收集活体角膜内皮。收集的角膜内皮立即放入RNAlater RNA稳定试剂(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)中，在-70℃下保存。然后，使用Qiagen miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN Inc.)根据制造商的说明提取总RNA，并为三个样品制备了Heliscope CAGE文库(Kanamori-Katayama M,et al.(2011),GenomeRes.21:1150-1159.)，然后通过SeqLL(Boston,MA)使用HeliScope^TM单分子测序仪(HelicosBioSciences Corp.,Cambridge,MA)进行测序。

将如上分离的Descemet膜在StemPro Accutase(Thermo Fisher)中于37℃温育30分钟，从Descemet膜分离角膜内皮细胞。将分离的角膜内皮细胞通过温和离心和收集，放入添加了50U/mL青霉素、50μg/mL链霉素、10％胎牛血清(ICN Biomedicals,Inc.，Aurora，俄亥俄州)和2ng/mL的碱性成纤维细胞生长因子(bFGF；Invitrogen)的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)中悬浮后，在具有细胞粘附试剂的培养皿上接种，在5％CO₂的加湿条件下，在37℃下培养。随后，使用Qiagen miRNeasy Mini试剂盒(QIAGEN Inc.)根据制造商的说明提取出总RNA。并且，RNA提取中使用的细胞全部来自第一代。为两个样品在制备Heliscope CAGE文库后通过SeqLL(Boston,MA)使用HeliScope^TM单分子测序仪(Helicos BioSciencesCorp.,Cambridge,MA)进行测序。

以hg19作为参考基因组，使用Delve(Djebali S,et al.(2012),Nature 489,101-108.)对获取的序列数据进行定位。此外，对FANTOM5项目中鉴定的184,827个启动子区域的标签数量进行了统计。对于活体角膜内皮，表达水平与通过FANTOM5分析的182个人体组织样本的数据进行比较，对于培养角膜内皮细胞，表达水平与通过FANTOM5分析的536个人体培养细胞样本的数据进行比较。通过已定位的标签总量进行校正，以tpm(tags permillion)为单位计算表达水平。使用edgeR(Robinson,M.D.et al.,(2010),Bioinformatics 26,139-140.)进行表达变动分析，满足以下条件时认定为角膜内皮细胞的特异表达的基因标记物：1)角膜内皮样品和其他样品中低于0.01的错误发现率((falsediscovery rate，(FDR))，2)在角膜内皮样品中表达水平为或高于10tpm，3)角膜内皮以外的所有样品中的平均表达水平低于3tpm，4)尽管角膜内皮以外的所有样品中表达水平最高，但其表达水平低于角膜内皮样品中的平均表达水平，5)角膜内皮样品中的平均表达水平是所有其他样品中平均表达水平的32倍或更高。从获得的角膜内皮特异性基因候选物中，将TFAP2B，LMX1B和POU6F2认定为活体角膜内皮和培养的角膜内皮细胞共同的特异性表达的转录因子。作为人类转录因子的参考，参考如下：

http://fantom.gsc.riken.jp/5/sstar/Browse_Transcription_Factors_hg19。

图1显示TFAP2B在人组织样品中的表达水平。a，b，c分别表示TFAP2B在中脑黑质，脑干蓝斑和附睾中的表达水平。证实了TFAP2B在活体角膜内皮中表达水平最高。

图2显示TFAP2B在人培养细胞中的表达水平。a，b，c分别表示TFAP2B在嗅觉上皮，小梁网状细胞，结膜成纤维细胞中的表达水平。证实TFAP2B在培养的角膜内皮细胞中表达水平最高。

图3表示LMX1B在人组织样品中的表达水平。a，b，c分别表示LMX1B在腮腺，唾液腺，下颌下腺中的表达水平。证实LMX1B在活体角膜内皮中表达最高。

图4显示LMX1B在人培养细胞样品中的表达水平。a，b，c分别表示LMX1B在小梁网状细胞，角膜基质细胞，成纤维细胞中的表达水平。在小梁网状细胞中观察到与角膜内皮细胞相同水平的表达。证实了它在角膜基质细胞中的表达。由于角膜内皮、角膜基质和小梁网都是来源于眼周神经嵴的组织，因此LMX1B有望不仅用作角膜内皮标记物，而且还可用作眼周神经嵴来源组织的标记物。

图5表示POU6F2在人组织样品中的表达水平。尽管活体角膜内皮中的表达水平为100tpm左右，但其它观察其表达的脑组织中的表达水平低于10tpm并且是高度特异性的。

图6表示POU6F2在人培养的细胞样品中的表达水平。a表示POU6F2在肝细胞中的表达水平。培养的角膜内皮细胞中的表达水平为或高于100tpm，而在通过FANTOM5分析的536个人体培养细胞样品中的535个中没有观察到表达。唯一观察到的肝细胞中的表达水平非常低，低于2tpm。

根据图1至图6所示的结果，POU6F2、LMX1B和TFAP2B均在角膜内皮细胞中实质性高水平表达，因此可用作角膜内皮细胞标记物，并且还可以用于诱导角膜内皮细胞。

在角膜内皮及其他组织中对以上三个基因进行定量表达分析。图7显示了通过定量PCR测定的iPS细胞(iPS)衍生细胞(例如神经嵴细胞(iNC))，以及眼内各组织中的表达的结果。如图7所示，证实了POU6F2，LMX1B和TFAP2B在培养角膜内皮细胞(HCEC)，角膜内皮祖细胞(HCEP)，分化诱导角膜内皮祖细胞(dHCEP)和活体角膜内皮(Cendo)中高度表达。相反地，角膜基质(CS)、虹膜基质(IS)、睫状体(CB)、小梁网(TM)、角膜缘部上皮(Clim)、角膜中央上皮(Cepi)、角膜缘成纤维细胞(LF)、结膜上皮(Cj)、晶状体(LN)、虹膜上皮(IE)、视网膜色素上皮(RPE)、视网膜(Retina)和视神经(ON)中几乎不表达POU6F2。LMX1B还在神经嵴来源组织的小梁网、角膜基质和虹膜基质中表达。TFAP2B在iPS衍生的神经嵴细胞中高度表达。根据这些结果，POU6F2、LMX1B和TFAP2B被认为可用作角膜内皮细胞的标志物。

成人/胎儿来源的角膜内皮细胞中的RNA-seq数据分析结果(Chen Y,et al.(2013),Hum Mol Genet 22:1271-1279)，显示TFAP2B和LMX1B的表达水平无明显变化；相反地，POU6F2在成人来源的角膜内皮中的表达水平显著上升(图8)。这表明POU6F2在功能成熟的角膜内皮上表达，并且与角膜内皮的终末分化有关。因此，POU6F2对于角膜内皮细胞产物的质量评估是有用的，并且由于其是转录因子，因此可以认为对角膜内皮细胞的生产是有用的。