阅读说明：本技术 永生化汗腺肌上皮细胞 (Immortalized sweat gland muscle epithelial cells ) 是由 早川智久 仓田隆一郎 藤田郁尚 冈田文裕 关口清俊 于 2018-08-07 设计创作，主要内容包括：一种永生化汗腺肌上皮细胞,其表达α-SMA和广谱细胞角蛋白,在至少5次传代后具有球体形成能力；以及一种永生化汗腺肌上皮细胞的制造方法,其中,一边将在表面露出有汗腺肌上皮细胞的细胞结构体以悬浮在培养基中的状态进行培养一边将永生化基因导入至该细胞中,将所得到的基因导入体以悬浮在培养基中的状态进行培养,得到永生化汗腺肌上皮细胞。(An immortalized sweat gland muscle epithelial cell expressing α -SMA and a broad-spectrum cytokeratin and having a sphere-forming ability after at least 5 passages, and a method for producing an immortalized sweat gland muscle epithelial cell, wherein an immortalizing gene is introduced into a cell structure having a sweat gland muscle epithelial cell exposed on the surface thereof while culturing the cell structure in a state of being suspended in a culture medium, and the obtained gene-introduced body is cultured in a state of being suspended in the culture medium to obtain an immortalized sweat gland muscle epithelial cell.)

永生化汗腺肌上皮细胞

技术领域

本发明涉及永生化汗腺肌上皮细胞。更详细地说，本发明涉及在止汗剂、除臭剂等外用剂、汗腺功能的改善剂等的开发等中有用的永生化汗腺肌上皮细胞及其制造方法。

背景技术

汗腺的功能不全和功能的异常亢进有时会引起中暑等疾病、皮肤的发粘、不适感等。汗腺肌上皮细胞是构成汗腺的细胞之一。汗腺肌上皮细胞参与汗的分泌时的汗腺的运动。另外，根据本发明人的报告，汗腺肌上皮细胞为汗腺的干细胞(例如，参见非专利文献1)。因此，为了开发出改善汗腺的功能不全和功能的异常亢进的手段，考虑了将汗腺肌上皮细胞用于汗腺的功能的评价等。

但是，从汗腺分离出的汗腺肌上皮细胞在汗腺中存在的量少，而且可传代培养的次数少，因此具有获得性和处理性差的缺点。因此，希望使汗腺肌上皮细胞永生化，对汗腺肌上皮细胞赋予长期的细胞增殖能力。

作为使汗腺细胞永生化的方法，报告了使以贴附在培养容器上的状态进行培养的汗腺细胞感染猿猴病毒40(下文中称为“SV40”)的方法(例如，参见非专利文献2)。但是，由于上述方法中将汗腺细胞在与生物体环境不同的环境下进行培养，因此具有难以得到与生物体内的汗腺细胞具有同样的功能和性质的永生化汗腺细胞的缺点。另一方面，考虑了将汗腺细胞以悬浮在培养基中的状态进行培养。但是，本发明人在当前还未发现具体记载有能够向悬浮状态的汗腺细胞中导入外来基因的技术的文献。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：仓田隆一郎等，“Isolation And Characterization Of SweatGland Myoepithelial Cells From Human Skin(来自人皮肤的汗腺肌上皮细胞的分离和鉴定)”，Cell Structure and Function，第39卷，2014年发行，pp.101-112

非专利文献2：CATHERINE M.LEE et al.,“NCL-SG3:a human eccrine sweatgland cell line that retains the capacity for transepithelial ion transport(NCL-SG3：具有跨上皮离子传输能力的人外分泌汗腺细胞株)”，Journal of CellScience，第92卷，1989年发行，pp.241-249

发明内容

发明所要解决的课题

本发明是鉴于上述现有技术而进行的，其目的在于提供一种永生化汗腺肌上皮细胞、以及能够以高制造效率制造该永生化汗腺肌上皮细胞的永生化汗腺肌上皮细胞的制造方法，该永生化汗腺肌上皮细胞与生物体内的汗腺肌上皮细胞具有同样的功能和性质，能够使具有该功能和性质的细胞长期增殖。

用于解决课题的手段

本发明涉及：

(1)一种永生化汗腺肌上皮细胞，其特征在于，该细胞表达α-平滑肌肌动蛋白和广谱细胞角蛋白，在至少5次传代后具有球体形成能力；

(2)如上述(1)所述的永生化汗腺肌上皮细胞，其中，该细胞进一步表达ATP1a1；

(3)一种永生化汗腺肌上皮细胞的制造方法，其是制造永生化汗腺肌上皮细胞的方法，该方法包括下述工序：

(I)一边将在表面露出有汗腺肌上皮细胞的细胞结构体以悬浮在培养基中的状态进行培养一边将永生化基因导入至该汗腺肌上皮细胞中而得到基因导入体的工序；以及

(II)将由上述工序(I)得到的基因导入体以悬浮在培养基中的状态进行培养而得到永生化汗腺肌上皮细胞的工序；

(4)如(3)所述的永生化汗腺肌上皮细胞的制造方法，其中，在上述工序(I)中，藉由病毒载体将永生化基因导入至上述汗腺肌上皮细胞中；

(5)如上述(3)或(4)所述的永生化汗腺肌上皮细胞的制造方法，其中，进一步包括下述工序：在进行上述工序(I)之前，从所采取的皮肤组织中除去至少胶原纤维的全部或一部分，得到含有汗腺的组织；在上述工序(I)中，使用上述含有汗腺的组织作为上述细胞结构体；以及

(6)如上述(3)或(4)所述的永生化汗腺肌上皮细胞的制造方法，其中，进一步包括下述工序：在进行上述工序(I)之前，将汗腺细胞以悬浮在培养基中的状态进行培养，形成在表面露出有汗腺肌上皮细胞的球体；在上述工序(I)中，使用上述球体作为上述细胞结构体。

发明的效果

根据本发明的永生化汗腺肌上皮细胞，可发挥出下述的优异效果：该细胞与生物体内的汗腺肌上皮细胞具有同样的功能和性质，能够使具有该功能和性质的细胞长期增殖。另外，根据本发明的永生化汗腺肌上皮细胞的制造方法，可发挥出能够以高制造效率制造本发明的永生化汗腺肌上皮细胞的优异效果。

附图说明

图1的(A)是示出参考例1中得到的病毒感染汗腺球体的荧光显微镜观察的结果的附图代用照片，(B)是示出参考例2中得到的病毒感染汗腺细胞的荧光显微镜观察的结果的附图代用照片，(C)是示出参考例1中得到的病毒感染汗腺球体的相位差显微镜观察的结果的附图代用照片，(D)是示出参考例2中得到的病毒感染汗腺细胞的共聚焦显微镜观察的结果的附图代用照片。

图2的(A)是示出试验例2(1)中对实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的汗腺细胞的球体形成能力与传代数的关系进行调查的结果的附图代用照片，(B)是示出试验例2(1)中对比较例1中得到的解离汗腺细胞的球体形成能力与传代数的关系进行调查的结果的附图代用照片。

图3的(A)是示出对细胞的种类与广谱细胞角蛋白表达量的关系进行调查的结果的图，(B)是示出对细胞的种类与α-SMA表达量的关系进行调查的结果的图。

图4的(A)是示出试验例3中对实施例2中得到的病毒感染组织中包含的汗腺细胞的球体形成能力与传代数的关系进行调查的结果的附图代用照片，(B)是示出试验例3中对比较例1中得到的解离汗腺细胞的球体形成能力与传代数的关系进行调查的结果的附图代用照片。

具体实施方式

如上所述，本发明的永生化汗腺肌上皮细胞的特征在于，其表达α-平滑肌肌动蛋白和广谱细胞角蛋白，在至少5次传代后具有球体形成能力。

本说明书中，“永生化”是指在至少5次传代后细胞具有球体形成能力。另外，“从汗腺分离出的汗腺肌上皮细胞”是指从汗腺分离且进行了原代培养的汗腺肌上皮细胞(下文中也称为“原代汗腺肌上皮细胞”)。

α-平滑肌肌动蛋白和广谱细胞角蛋白是生物体内的汗腺肌上皮细胞的标志物。α-平滑肌肌动蛋白参与引起汗腺收缩这样的汗腺肌上皮细胞的功能的表达。另外，广谱细胞角蛋白形成了汗腺肌上皮细胞的细胞骨架。本发明的永生化汗腺肌上皮细胞表达α-平滑肌肌动蛋白和广谱细胞角蛋白，因此与生物体内的汗腺肌上皮细胞具有同样的功能和性质。此外，本发明的永生化汗腺肌上皮细胞在至少5次传代后具有球体形成能力，因此与原代汗腺肌上皮细胞相比，能够使与生物体内的汗腺肌上皮细胞具有同样的功能和性质的细胞长期增殖。

原代汗腺肌上皮细胞在第4次传代前即丧失球体形成能力。与之相对，本发明的永生化汗腺肌上皮细胞在至少5次、优选7次以上、更优选9次以上、进一步优选18次以上、再进一步优选100次以上的传代后仍具有球体形成能力。因此，与原代汗腺肌上皮细胞相比，本发明的永生化汗腺肌上皮细胞可更长期地维持细胞增殖能力。

作为“与生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能同样的功能”，可以举出例如汗的分泌时的汗腺的收缩运动等，但本发明并不仅限于上述例示。作为“与生物体内的汗腺肌上皮细胞的性质同样的性质”，可以举出例如向汗腺管腔细胞等的分化能力、自我复制能力、α-平滑肌肌动蛋白表达阳性、广谱细胞角蛋白表达阳性、钠/钾ATP酶的α亚基(ATP1a1)表达阳性等，但本发明并不仅限于上述例示。

本发明的永生化汗腺肌上皮细胞优选进一步表达ATP1a1。ATP1a1在汗腺以外的器官来源的肌上皮细胞(例如乳腺肌上皮细胞等)中并不表达，因此是汗腺细胞的标志物。因此，表达ATP1a1的本发明的永生化汗腺肌上皮细胞能够与汗腺以外的器官来源的肌上皮细胞相区分。

本发明的永生化汗腺肌上皮细胞与生物体内的汗腺肌上皮细胞具有同样的功能和性质，因此可期待被用于例如被测物质所具有的汗腺肌上皮细胞的分化调节作用的评价方法中。该评价方法例如包括下述步骤：

(A)将本发明的永生化汗腺肌上皮细胞在不存在被测物质的条件下以悬浮在培养基中的状态进行培养而得到细胞培养物的步骤；

(B)将本发明的永生化汗腺肌上皮细胞在被测物质的存在下以悬浮在培养基中的状态进行培养而得到细胞培养物的步骤；以及

(C)调查由上述步骤(A)得到的细胞培养物(A)中的分化标志物的表达谱和由上述步骤(B)得到的细胞培养物(B)中的分化标志物的表达谱，基于上述细胞培养物(A)中的分化标志物的表达谱与上述细胞培养物(B)中的分化标志物的表达谱的差异，评价上述被测物质所具有的汗腺肌上皮细胞的分化调节作用的步骤。

在利用本评价方法确认到被测物质具有促进汗腺肌上皮细胞的分化的作用的情况下，该被测物质可期待被用于例如因汗腺肌上皮细胞的功能的异常亢进所引起的状态的改善。另外，在利用本评价方法确认到被测物质具有抑制汗腺肌上皮细胞的分化的作用的情况下，该被测物质可期待被用于例如因汗腺肌上皮细胞的功能不全所引起的状态的改善。

本发明的永生化汗腺肌上皮细胞例如可以通过一边将在表面露出有汗腺肌上皮细胞的细胞结构体以悬浮在培养基中的状态进行培养，一边将永生化基因导入至该汗腺肌上皮细胞中等来进行制造。

本发明的永生化汗腺肌上皮细胞的制造方法的特征在于，其包括下述工序(下文中也称为“本发明的方法”)：

(I)一边将在表面露出有汗腺肌上皮细胞的细胞结构体以悬浮在培养基中的状态进行培养一边将永生化基因导入至该汗腺肌上皮细胞中而得到基因导入体的工序；以及

(II)将由上述工序(I)得到的基因导入体以悬浮在培养基中的状态进行培养而得到永生化汗腺肌上皮细胞的工序。

根据本发明的方法，由于采用了一边将在表面露出有汗腺肌上皮细胞的细胞结构体以悬浮在培养基中的状态进行培养一边将永生化基因导入至该汗腺肌上皮细胞中的操作，因此能够将永生化基因以高导入效率导入至汗腺肌上皮细胞中。因此，根据本发明的方法，能够以高制造效率制造永生化汗腺肌上皮细胞。

在工序(I)中，一边将在表面露出有汗腺肌上皮细胞的细胞结构体以悬浮在培养基中的状态进行培养，一边将永生化基因导入至该汗腺肌上皮细胞中，得到基因导入体。

细胞结构体只要在表面露出有汗腺肌上皮细胞，也可以含有其他汗腺细胞等。作为其他汗腺细胞，可以举出例如汗腺管腔细胞、汗腺分泌细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。作为细胞结构体，可以举出例如在表面露出有汗腺肌上皮细胞的含有汗腺的组织、在表面露出有汗腺肌上皮细胞的球体等，但本发明并不仅限于上述例示。

含有汗腺的组织是皮肤组织中的含有汗腺的部分的组织。含有汗腺的组织中包含的汗腺的表层被汗腺肌上皮细胞所覆盖。另外，汗腺中存在有从表层朝向内部进一步进行分化的汗腺细胞。含有汗腺的组织可以通过例如从所采取的皮肤组织中除去至少胶原纤维的全部或一部分等而进行分离。在使用含有汗腺的组织作为细胞结构体的情况下，本发明的方法可以进一步包括下述工序：在进行工序(I)之前，从所采取的皮肤组织中除去至少胶原纤维的全部或一部分，得到在表面露出有汗腺肌上皮细胞的含有汗腺的组织。

作为含有汗腺的组织的制造方法，可以举出例如包括下述工序的方法等：

(a1)从所采取的皮肤组织中分离出包含汗腺的组织片的工序；以及

(a2)从由工序(a1)得到的组织片中除去胶原纤维等而得到在表面露出有汗腺肌上皮细胞的含有汗腺的组织的工序，

但本发明并不仅限于上述例示。

作为所采取的皮肤组织，例如可以举出从外科手术时产生的剩余皮肤等取得的活体状态的皮肤组织等，但本发明并不仅限于上述例示。从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，所采取的皮肤组织优选为新鲜的组织。在所采取的皮肤组织为冷藏保存的组织的情况下，从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，优选为切除后48小时以内的组织。需要说明的是，本说明书中的“活体状态的皮肤组织”是指显示出与生物体内本来的生物学活性和本来的活动同样的生物学活性和活动的状态的皮肤组织。作为皮肤组织的供给源，可以举出例如人等，但本发明并不仅限于上述例示。

在工序(a1)中，从所采取的皮肤组织中分离出包含汗腺的组织片。在工序(a1)中，出于能够辨认出汗腺并且容易地分离出包含汗腺的组织片的原因，优选将皮肤组织用中性红等染色试剂进行染色而使汗腺可见。在对皮肤组织进行染色的情况下，从降低染色试剂对汗腺带来的影响的方面和降低微生物等的污染的方面出发，优选对从皮肤组织分离出的组织片进行清洗。

接着，在工序(a2)中，从由工序(a1)得到的组织片中除去胶原纤维等，得到在表面露出有汗腺肌上皮细胞的含有汗腺的组织。在工序(a2)中，可以使用例如分散酶(DISPASE)、胶原酶等酶、物理性的切除手段等从组织片中除去胶原纤维。在工序(a2)中，从防止其他表皮附属器官的混入的方面出发，优选从组织片中进一步除去毛囊、皮脂腺等。

球体是汗腺细胞的聚集块。球体具有由汗腺肌上皮细胞形成的表面层。球体中存在有从表面层朝向内部进一步进行分化的汗腺细胞。球体可以通过例如将汗腺细胞以悬浮在培养基中的状态进行培养等来制造。在使用球体作为细胞结构体的情况下，本发明的方法可以进一步包括下述工序：在进行工序(I)之前，将汗腺细胞以悬浮在培养基中的状态进行培养，形成在表面露出有汗腺肌上皮细胞的球体。

作为球体的制造方法，可以举出例如包括下述工序的方法等：

(b1)从所采取的皮肤组织中分离出包含汗腺的组织片的工序；

(b2)从由工序(b1)得到的组织片中得到解离状态的汗腺细胞的工序；以及

(b3)将由工序(b2)得到的汗腺细胞以悬浮在培养基中的状态进行培养，形成在表面露出有汗腺肌上皮细胞的球体的工序，

但本发明并不仅限于上述例示。

在工序(b1)中，从所采取的皮肤组织中分离出包含汗腺的组织片。工序(b1)中的组织片的采取可以通过与含有汗腺的组织的制造方法的工序(a1)中的组织片的采取相同的方法来进行。

接着，在工序(b2)中，从由工序(b1)得到的组织片中获得解离状态的汗腺细胞。在工序(b2)中，通过使细胞解离用试剂作用于组织片等而使汗腺细胞从组织片中解离，由此可以得到解离状态的汗腺细胞。作为细胞解离用试剂，可以举出例如嗜热菌蛋白酶、分散酶、胶原酶、胰蛋白酶等酶等，但本发明并不仅限于上述例示。

接着，在工序(b3)中，将由工序(b2)得到的解离状态的汗腺细胞以悬浮在球体形成用培养基中的状态进行培养，形成在表面露出有汗腺肌上皮细胞的球体。作为球体形成用培养基，可以举出例如含有表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、细胞培养用人工基底膜基质以及无血清培养基的培养基等，但本发明并不仅限于上述例示。在球体形成用培养基为含有表皮生长因子的培养基的情况下，球体形成用培养基中的表皮生长因子的含量根据皮肤组织的供给源的种类等而不同，因而不能一概而论，因此优选根据皮肤组织的供给源的种类等而适当决定。在皮肤组织的供给源为人的情况下，关于球体形成用培养基中的表皮生长因子的含量，通常从使细胞适度地增殖并且适度地分化的方面出发，优选为0.01ng/mL以上、更优选为1ng/mL以上，从抑制细胞的过度增殖和分化的方面出发，优选为1μg/mL以下、更优选为100ng/mL以下。在球体形成用培养基为含有碱性成纤维细胞生长因子的培养基的情况下，球体形成用培养基中的碱性成纤维细胞生长因子的含量根据皮肤组织的供给源的种类等而不同，因而不能一概而论，因此优选根据皮肤组织的供给源的种类等而适当决定。在皮肤组织的供给源为人的情况下，关于球体形成用培养基中的碱性成纤维细胞生长因子的含量，通常从使细胞适度地增殖并且抑制细胞的过度分化的方面出发，优选为0.01ng/mL以上、更优选为1ng/mL以上，从抑制细胞的过度增殖并且使细胞适度分化的方面出发，优选为1μg/mL以下、更优选为100ng/mL以下。作为无血清培养基，可以举出例如Stem Cell Technologies公司制造的商品名Complete MammoCult Human Medium、ThermoFisher Scientific株式会社制造的商品名Gibco(注册商标)Keratinocyte-SFM等，但本发明并不仅限于上述例示。

汗腺细胞的培养条件根据皮肤组织的供给源的种类等而不同，因而不能一概而论，因此优选根据皮肤组织的供给源的种类等而适当决定。汗腺细胞的培养条件例如包括培养温度、培养时间、培养基的pH、培养气氛中的二氧化碳浓度等。在皮肤组织的供给源为人的情况下，关于培养温度，从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，优选为35℃以上、更优选为36.5℃以上，从与上述同样地更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，优选为38℃以下、更优选为37.5℃以下。具体地说，从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，上述培养温度通常优选为35～38℃、更优选为36.5～37.5℃。另外，在皮肤组织的供给源为人的情况下，培养时间根据培养温度等而不同，因而不能一概而论，因此优选根据培养温度等而适当决定。从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，培养时间优选为60小时以上、更优选为144小时以上，从与上述同样地更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，优选为672小时以下、更优选为168小时以下。具体地说，从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，上述培养时间通常优选为60～672小时、更优选为144～168小时。此外，在皮肤组织的供给源为人的情况下，从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，培养基的pH优选为6.8以上、更优选为7.0以上，从与上述同样地更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，优选为7.6以下、更优选为7.4以下。具体地说，从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，上述pH通常优选为6.8～7.6、更优选为7.0～7.4。从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，培养气氛中的二氧化碳浓度优选为4体积％以上、更优选为5体积％以上，从与上述同样地更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，优选为10体积％以下、更优选为7体积％以下。具体地说，从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，上述二氧化碳浓度通常优选为4～10体积％、更优选为5～7体积％。“汗腺细胞以悬浮在培养基中的状态”只要是汗腺细胞不与该汗腺细胞的培养中使用的培养容器的壁面接触的状态即可，没有特别限定。培养容器可以是在内表面具有抑制汗腺细胞贴附的物质的容器。

工序(I)中，一边将细胞结构体以悬浮在培养基中的状态培养，一边进行永生化基因向汗腺肌上皮细胞中的导入。“细胞结构体以悬浮在培养基中的状态”只要是细胞结构体不与该细胞结构体的培养中使用的容器的内表面接触的状态即可，没有特别限定。细胞结构体的培养中使用的容器可以是在内表面具有抑制细胞结构体粘附的物质的容器。用于将细胞结构体以悬浮的状态进行培养的培养基(下文中也称为“悬浮培养用培养基”)只要是含有使汗腺肌上皮细胞存活的营养成分的培养基即可，可以是血清等抑制基因导入的成分的含量少的培养基，也可以是不包含该成分的培养基。悬浮培养用培养基可以是在低血清培养基或无血清培养基中补充营养成分而成的培养基，也可以是能够容易地以商业方式获得的培养基。作为营养成分，可以举出例如氨基酸、维生素、无机盐、糖类、细胞增殖促进因子(例如表皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、氢化可的松-21-半琥珀酸酯等)等，但本发明并不仅限于上述例示。悬浮培养用培养基中的营养成分的含量根据低血清培养基或无血清培养基的种类、营养成分的种类等而不同，因而不能一概而论，因此优选根据低血清培养基或无血清培养基的种类、营养成分的种类等而适当设定。这些营养成分可以单独使用，也可以将两种以上合用。作为无血清培养基，可以举出例如Stem Cell Technologies公司制造的商品名Complete MammoCult Human Medium、Thermo Fisher Scientific株式会社制造的商品名Gibco(注册商标)Keratinocyte-SFM、Thermo Fisher Scientific株式会社制造的商品名Opti-MEM(注册商标)I Reduced Serum Medium等，但本发明并不仅限于上述例示。低血清培养基可以使用在上述无血清培养基中添加血清而得到的培养基。从更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，低血清培养基的血清浓度优选为0.01体积％以上、更优选为0.1体积％以上，从与上述同样地更好地维持生物体内的汗腺肌上皮细胞的功能和性质的方面出发，优选为0.5体积％以下、更优选为0.1体积％以下。具体地说，上述血清浓度优选为0.1～0.5体积％、更优选为0.01～0.1体积％。

作为永生化基因向汗腺肌上皮细胞中的导入方法，可以举出例如使用病毒载体的方法、转染法等，但本发明并不仅限于上述例示。这些方法中，出于可通过简便的操作得到高基因导入效率的原因，优选使用病毒载体的方法。因此，上述工序(I)中，优选藉由病毒载体将永生化基因导入至上述汗腺肌上皮细胞中。

作为病毒载体，可以举出例如慢病毒载体、逆转录病毒载体等，但本发明并不仅限于上述例示。这些病毒载体中，出于对汗腺肌上皮细胞具有高基因导入效率、能够进行永生化基因的稳定导入的原因，优选慢病毒载体。作为永生化基因，可以举出例如人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因、SV40t(小t)抗原基因、SV40T(大T)抗原基因、c-myc基因、***瘤病毒E6基因、***瘤病毒E7基因等，但本发明并不仅限于上述例示。这些永生化基因可以单独使用，也可以将两种以上合用。这些永生化基因中，出于得到针对汗腺肌上皮细胞的高基因导入效率的原因，优选将hTERT基因、SV40t抗原基因以及SV40T抗原基因合用。

工序(I)中，在通过使用病毒载体的方法向汗腺肌上皮细胞中导入永生化基因的情况下，使整合有永生化基因的病毒载体包装而成的重组病毒颗粒感染在表面露出有汗腺肌上皮细胞的细胞结构体，由此能够将永生化基因导入至汗腺肌上皮细胞中。重组病毒颗粒可以通过例如下述方法等进行制备：将在病毒载体中整合有永生化基因的重组病毒载体和保有病毒的包装所需要的基因的载体共转染至共转染用细胞中，对重组病毒颗粒进行回收。重组病毒颗粒可以是能够容易地以商业方式获得的重组病毒颗粒。永生化基因向细胞结构体中的导入可以通过在基因导入辅助剂的存在下使重组病毒颗粒接触并感染细胞结构体来进行。作为共转染用细胞，可以举出例如293T细胞等，但本发明并不仅限于上述例示。作为基因导入辅助剂，可以举出例如聚凝胺、鱼精蛋白等，但本发明并不仅限于上述例示。

作为细胞结构体与重组病毒颗粒的接触方法，可以举出例如向包含悬浮状态的细胞结构体的病毒感染用培养基中添加重组病毒颗粒的方法、将细胞结构体与包含重组病毒颗粒的病毒感染用培养基混合的方法等，但本发明并不仅限于上述例示。作为病毒感染用培养基，可以举出例如在上述无血清培养基中补充氢化可的松-21-半琥珀酸酯、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、谷氨酸、非必需氨基酸等而成的培养基、能够容易地以商业方式获得的培养基等，但本发明并不仅限于上述例示。

在使用在表面露出有汗腺肌上皮细胞的含有汗腺的组织作为细胞结构体的情况下，关于每100μL的上述含有汗腺的组织和重组病毒颗粒的混合物中的该含有汗腺的组织中包含的汗腺数，从提高基因导入效率、提高制造效率的方面出发，优选为1个以上、更优选为4个以上，从与上述同样地提高基因导入效率、提高制造效率的方面出发，优选为20个以下、更优选为10个以下。具体地说，每100μL的上述混合物中的该含有汗腺的组织中包含的汗腺数优选为1～20个、更优选为4～10个。另外，在使用上述含有汗腺的组织作为细胞结构体的情况下，感染病毒颗粒数与汗腺数之比(感染病毒颗粒数/汗腺数)优选为1×10²～1×10¹⁰。

在使用在表面露出有汗腺肌上皮细胞的球体作为细胞结构体的情况下，关于每100μL的上述球体和重组病毒颗粒的混合物中的上述球体数，从提高基因导入效率、提高制造效率的方面出发，优选为1个以上、更优选为4个以上，从与上述同样地提高基因导入效率、提高制造效率的方面出发，优选为20个以下、更优选为10个以下。具体地说，每100μL的上述混合物中的上述球体数优选为1～20个、更优选为4～10个。另外，在使用上述球体作为细胞结构体的情况下，感染病毒颗粒数与球体数之比(感染病毒数/球体数)优选为1×10²～1×10¹⁰。

接着，在工序(II)中，将由上述工序(I)得到的基因导入体以悬浮在培养基中的状态进行培养，得到永生化汗腺肌上皮细胞。

工序(II)中使用的培养基与工序(I)中使用的悬浮培养用培养基相同。工序(II)中的基因导入体的培养条件与球体的制造方法中的汗腺细胞的培养条件相同。

在使用在表面露出有汗腺肌上皮细胞的含有汗腺的组织作为细胞结构体的情况下，由于由工序(I)得到的基因导入体包含汗腺以外的组织等，因此可以进一步进行从基因导入体中分离永生化汗腺肌上皮细胞的工序。永生化汗腺肌上皮细胞从基因导入体中的分离可以通过例如使细胞解离用试剂作用于基因导入体、对基因导入体施加力学刺激、合用细胞解离用试剂和力学刺激等来进行。细胞解离用试剂与上述球体的制造方法的工序(b2)中使用的细胞解离用试剂相同。作为力学刺激，可以举出由吹吸产生的刺激等，但本发明并不仅限于上述例示。

在基因导入体包含永生化汗腺肌上皮细胞以外的细胞的情况下，本发明的方法在工序(II)之后可以进一步包含分离永生化汗腺肌上皮细胞的工序。作为永生化汗腺肌上皮细胞的分离方法，可以举出例如利用汗腺肌上皮细胞特异性标志物作为指标的细胞分选等，但本发明并不仅限于上述例示。

由本发明的方法得到的永生化汗腺肌上皮细胞可以通过调查下述的汗腺肌上皮细胞的特征(i)～(iii)来进行鉴定：

(i)α-平滑肌肌动蛋白表达阳性；

(ii)显示出广谱细胞角蛋白表达阳性和ATP1a1表达阳性；和

(iii)在5次以上的传代后具有球体形成能力。

α-平滑肌肌动蛋白、广谱细胞角蛋白和ATP1a1各自的表达的有无可以通过例如荧光免疫细胞染色法、实时RT-PCR法等来确认。球体形成能力可以通过与上述球体的制造方法相同的方法来确认。

如以上所说明，根据本发明的永生化肌上皮细胞，能够具有与生物体内的汗腺肌上皮细胞同样的功能和性质，并能够使具有该功能和性质的细胞长期增殖。另外，根据本发明的永生化肌上皮细胞的制造方法，能够以高制造效率得到本发明的永生化汗腺肌上皮细胞。因此，本发明的永生化肌上皮细胞和本发明的永生化肌上皮细胞的制造方法可期待被用于止汗剂、除臭剂等外用剂、汗腺功能的改善剂等的开发等中。

实施例

以下通过实施例进一步详细说明本发明，但本发明并不仅限于这些实施例。下文中，各缩略语和各术语的含义如下所述。

<缩略语和术语的说明>

EDTA：乙二胺四乙酸

FBS：胎牛血清

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶

GFP：绿色荧光蛋白

GFP重组病毒：保有GFP基因的重组慢病毒

hTERT重组病毒：保有hTERT基因的重组慢病毒

PBS：磷酸缓冲生理盐水

SV40Tt重组病毒：保有SV40t抗原基因和SV40T抗原基因的重组慢病毒

α-SMA：α-平滑肌肌动蛋白

制造例1

在基础培养基[Stem Cell Technologies公司制造，商品名：Complete MammoCultHumanMedium]中添加氢化可的松-21-半琥珀酸酯、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、肝素和青霉素/链霉素混合液[青霉素浓度10000单位/mL、链霉素浓度10000μg/mL]，使各自的浓度为10.5μg/mL(氢化可的松-21-半琥珀酸酯)、10ng/mL(重组人表皮生长因子)、10ng/mL(重组人碱性成纤维细胞生长因子)、4μg/mL(肝素)和100μg/mL(青霉素/链霉素混合液)，得到培养基(I)。

制造例2

在基础培养基[Stem Cell Technologies公司制造，商品名：Complete MammoCultHumanMedium]中添加氢化可的松-21-半琥珀酸酯、重组人表皮生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、肝素、青霉素/链霉素混合液和细胞培养用人工基底膜基质[CorningInc.制造，商品名：Growth Factor Reduced Matrigel Matrix]，使各自的浓度为10.5μg/mL(氢化可的松-21-半琥珀酸酯)、10ng/mL(重组人表皮生长因子)、10ng/mL(重组人碱性成纤维细胞生长因子)、4μg/mL(肝素)、100μg/mL(青霉素/链霉素混合液)和2体积％(细胞培养用人工基底膜基质)，得到培养基(II)。

制造例3

在基础培养基[Stem Cell Technologies公司制造，商品名：Complete MammoCultHumanMedium]中添加氢化可的松-21-半琥珀酸酯、重组人表皮生长因子和重组人碱性成纤维细胞生长因子，使各自的浓度为10.5μg/mL(氢化可的松-21-半琥珀酸酯)、10ng/mL(重组人表皮生长因子)和10ng/mL(重组人碱性成纤维细胞生长因子)，得到培养基(III)。在培养基(III)中添加聚凝胺使其浓度为10μg/mL，得到病毒感染用培养基。

制造例4

通过将胰蛋白酶溶液[Thermo Fisher Scientific株式会社制造，商品名：2.5％Trypsin(胰蛋白酶)(10×)、无酚红]、Dulbecco PBS[Thermo Fisher Scientific株式会社制造，商品名：DPBS，无钙，无镁]和EDTA溶液[Nippon Gene公司制造，商品名：0.5M EDTA]混合而得到0.5质量％胰蛋白酶-EDTA溶液。

制造例5

通过将粉末状的分散酶[Thermo Fisher Scientific株式会社制造，商品名：Dispase II，粉末]溶解在DulbeccoPBS[Thermo Fisher Scientific株式会社制造，商品名：DPBS，无钙，无镁]中而得到5U/mL分散酶液。

参考例1

(1)解离状态的汗腺细胞的制造

作为皮肤组织，使用从生物体(68岁的人)切除后立即在4℃冷藏保存的切除后48小时以内的眼睑的皮肤组织。将皮肤组织浸泡在含有10μM中性红(Neutral Red)的PBS中，由此使中性红进入到上述皮肤组织中的汗腺中。接着，在光学显微镜下使用镊子和剪刀从上述皮肤组织中分离出包含汗腺的组织片。将分离出的组织片收集在15mL容量管中的无菌PBS内。将含有上述组织片的PBS轻轻振荡后，将该PBS供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清，由此对上述组织片进行清洗。

将由制造例1得到的培养基(I)10mL与上述管中的上述组织片混合。接着，向上述管中的培养基(I)中添加胶原酶II，使其浓度为600U/mL。之后，一边利用旋转混匀仪使上述管中的上述组织片旋转，一边在37℃的5体积％二氧化碳气氛中进行温育，由此从上述组织片中除去胶原纤维。

从温育开始时起经过4小时后，将上述管中的培养基(I)和胶原纤维除去后的组织片转移至直径10cm的皿中。在光学显微镜下使用移液器采取上述皿上的上述组织片。将所采取的组织片收集在15mL容量管中的无菌PBS内。将含有上述组织片的PBS轻轻振荡后，将该PBS供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清，由此对上述组织片进行清洗。

将清洗后的组织片和由制造例4得到的0.5质量％胰蛋白酶-EDTA溶液1mL在15mL容量管中混合。使用移液器将上述管中的汗腺搅拌3分钟，由此使构成汗腺的汗腺细胞相互解离，得到解离状态的汗腺细胞(下文中也称为“解离汗腺细胞”)。

(2)球体培养

将上述(1)“解离状态的汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞和2质量％FBS/PBS溶液9mL混合。将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，从该混合液中除去上清。向上述管中的解离汗腺细胞中添加由制造例5得到的5U/mL分散酶液1mL后，使用移液器对上述管中的解离汗腺细胞进行搅拌。接着，使上述管中的含有解离汗腺细胞的混合液通过细胞过滤器[网孔尺寸：40μm、Corning公司制造，商品名：Falcon(注册商标)40μm细胞过滤器、蓝色、灭菌、独立包装]而除去聚集的细胞，由此得到解离汗腺细胞的悬浮液。

将2质量％FBS/PBS溶液9mL与上述管中的解离汗腺细胞的悬浮液混合。将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，从该混合液中除去上清，由此得到含有细胞的液体。使用含有细胞的液体的一部分和血细胞计数板，计算出含有细胞的液体的细胞数。向上述管中添加由制造例2得到的培养基(II)以使解离汗腺细胞的浓度为1×10³～7×10³个/mL，得到含有解离汗腺细胞的混合液。将所得到的混合液加入到低粘附板[Corning公司制造，商品名：超低粘附板24孔]中。在悬浮于上述孔板中的培养基(II)中的状态下将上述解离汗腺细胞在37℃的5体积％二氧化碳气氛中进行温育。

培养开始后，在形成了球体的时刻将上述球体转移至15mL容量管中。将上述球体供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去液体成分。接着，将细胞回收用溶液(Corning公司制造，商品名：Cell Recovery Solution)1mL与上述管中的球体混合，得到含有球体的液体。之后将加入有所得到的含有球体的液体的管在冰上静置1～2小时。

(3)病毒感染

按照聚乙二醇沉淀法对GFP重组病毒颗粒溶液[Applied Biological Materials公司制造，商品名：GFP Control Lentivirus(GFP对照慢病毒)、GFP重组病毒颗粒浓度：1×10⁶U/mL]进行浓缩。将所得到的浓缩物用上述病毒感染用培养基稀释，使GFP重组病毒颗粒浓度为1×10⁸U/mL，由此得到GFP重组病毒稀释液。

将上述(2)“球体培养”中得到的含有球体的液体与PBS 9mL混合。接着，将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清。将离心分离后的球体4～10个与制造例3中得到的病毒感染用培养基90μL混合。向所得到的混合液中添加上述GFP重组病毒稀释液10μL，得到球体-病毒混合液。将上述球体-病毒混合液在37℃的5体积％二氧化碳气氛中温育，使重组病毒感染构成球体的汗腺细胞，由此将GFP基因导入至构成球体的细胞中。从病毒感染开始时起经过24小时后，回收病毒感染汗腺球体。

参考例2

将参考例1的(1)“解离状态的汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞与PBS9mL混合。接着，将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清。将离心分离后的解离汗腺细胞5×10²～1×10⁵个与制造例3中得到的病毒感染用培养基90μL混合。向所得到的混合液中添加上述GFP重组病毒稀释液10μL，得到球体-病毒混合液。将上述球体-病毒混合液在37℃的5体积％二氧化碳气氛中温育，使重组病毒感染解离汗腺细胞，由此将GFP基因导入至解离汗腺细胞中。从病毒感染开始时起经过24小时后，回收病毒感染汗腺细胞。

试验例1

在荧光显微镜下对参考例1中得到的病毒感染汗腺球体和参考例2中得到的病毒感染汗腺细胞中的基于GFP的荧光进行观察。另外，在共聚焦显微镜下对参考例1中得到的病毒感染汗腺球体和参考例2中得到的病毒感染汗腺细胞进行观察。

将在荧光显微镜下对参考例1中得到的病毒感染汗腺球体中的基于GFP的荧光进行观察的结果示于图1的(A)，将在荧光显微镜下对参考例2中得到的病毒感染汗腺细胞中的基于GFP的荧光进行观察的结果示于图1的(B)，将在共聚焦显微镜下对参考例1中得到的病毒感染汗腺球体进行观察的结果示于图1的(C)，将在共聚焦显微镜下对参考例2中得到的病毒感染汗腺细胞进行观察的结果示于图1的(D)。图中的比例尺表示153μm。另外，图1的(A)中的箭头表示病毒感染汗腺球体，图1的(B)中的箭头表示病毒感染汗腺细胞。

由图1的(A)和(C)所示的结果可知，在参考例1中得到的病毒感染汗腺球体中，在存在于表面上的全体细胞中表达有GFP。与之相对，参考例2中得到的病毒感染汗腺细胞中几乎不存在表达GFP的细胞。由这些结果可知，与使病毒感染解离状态的汗腺细胞的情况相比，通过以将球体悬浮在培养基中的状态使病毒感染该球体中包含的汗腺细胞，能够以更高的效率将基因导入至汗腺细胞中。

实施例1

将参考例1的(2)“球体培养”中得到的含有球体的液体与PBS 9mL混合。接着，将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清。将离心分离后的球体4～10个与制造例3中得到的病毒感染用培养基100μL混合。向所得到的混合液中添加hTERT重组病毒颗粒溶液[Applied Biological Materials公司制造的商品名：High TiterLentivirus containing hTERT(含有hTERT的高滴度慢病毒)、hTERT重组病毒颗粒浓度：1×10⁹U/mL]0.5μL和SV40Tt重组病毒颗粒溶液[Applied Biological Materials公司制造的商品名：High Titer Lentivirus expressing SV40 large and small T antigens(表达SV40大T抗原和小T抗原的高滴度慢病毒)、SV40Tt重组病毒颗粒浓度：1×10⁹U/mL]0.5μL，得到球体-病毒混合液。将上述球体-病毒混合液在37℃的5体积％二氧化碳气氛中温育，使重组慢病毒感染构成球体的汗腺细胞，由此将永生化基因导入至构成球体的细胞中。从病毒感染开始时起经过24小时后，回收病毒感染汗腺球体。

比较例1

通过进行与参考例1的(1)“解离状态的汗腺细胞的制造”和(2)的“球体培养”同样的操作而得到球体。

试验例2

(1)球体传代培养

将进行以下的(1-1)和(1-2)的操作定义为“1次传代培养”。

(1-1)解离汗腺细胞的制造

将实施例1中得到的病毒感染汗腺球体与制造例4中得到的0.5质量％胰蛋白酶-EDTA溶液1mL在15mL容量管中混合。使用移液器，将上述管中的汗腺搅拌3分钟，由此使构成汗腺的汗腺细胞相互解离，得到解离汗腺细胞。

另外，在上述操作中，使用比较例1中得到的球体来代替实施例中得到的病毒感染汗腺球体，除此以外进行与上述同样的操作，得到解离汗腺细胞。

(1-2)球体培养

将上述(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞与2质量％FBS/PBS溶液9mL混合。将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清。向上述管中的解离汗腺细胞中添加制造例5中得到的5U/mL分散酶液1mL后，使用移液器对上述管中的解离汗腺细胞进行搅拌。接着，使上述管中的含有解离汗腺细胞的混合液通过细胞过滤器[网孔尺寸：40μm、Corning制造，商品名：Falcon(注册商标)40μm细胞过滤器、蓝色、灭菌、独立包装]而除去聚集的细胞，由此得到解离汗腺细胞的悬浮液。

将2质量％FBS/PBS溶液9mL与上述管中的解离汗腺细胞的悬浮液混合。将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清。接着，向上述管中添加制造例2中得到的培养基(II)使解离汗腺细胞的浓度为2.3×10³～2.7×10³个/mL，得到含有解离汗腺细胞的混合液。将所得到的混合液加入到低粘附板[Corning公司制造，商品名：超低粘附板24孔]中。在悬浮于上述孔板中的培养基(II)中的状态下将上述解离汗腺细胞在37℃的5体积％二氧化碳气氛中进行温育。

培养开始后，在形成了球体的时刻将上述球体转移至15mL容量管中。将上述球体供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去液体成分。接着，将细胞回收用溶液(Corning公司制造，商品名：Cell Recovery Solution)1mL与上述管中的球体混合，得到含有球体的液体。之后将加入有所得到的含有球体的液体的管在冰上静置1～2小时。

(1-3)球体形成能力的评价

反复进行包括上述(1-1)“解离汗腺细胞的制造”和(1-2)“球体培养”的一系列操作，基于上述(1-2)“球体培养”中的球体形成的有无来调查球体形成能力。

将对实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的汗腺细胞的球体形成能力与传代数的关系进行调查的结果示于图2的(A)，将对比较例1中得到的解离汗腺细胞的球体形成能力与传代数的关系进行调查的结果示于图2的(B)。图中，箭头表示球体。

由图2所示的结果可知，实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的汗腺细胞在9次传代后仍具有球体形成能力。与之相对，比较例1中得到的解离汗腺细胞在4次传代后不具有球体形成能力。

另外确认到，实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的汗腺细胞即使在传代20次以上的情况下也可形成球体。

由以上的结果可知，通过在使球体悬浮在培养基中的状态下使具有永生化基因的慢病毒感染该球体中包含的汗腺细胞，可得到永生化汗腺细胞。

(2)永生化汗腺细胞的鉴定

使用抗广谱细胞角蛋白抗体、针对抗广谱细胞角蛋白抗体的荧光标记二次抗体、抗α-SMA抗体和针对该抗α-SMA抗体的荧光标记二次抗体，进行上述(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞和比较例1中得到的解离汗腺细胞的荧光免疫染色。接着，测定免疫染色后的解离汗腺细胞中的基于广谱细胞角蛋白的荧光的强度[以下称为“荧光强度A”]和基于α-SMA的荧光的强度[以下称为“荧光强度B”]。

接着，由评价对象的细胞中的荧光强度A减去比较例1中得到的解离汗腺细胞中的荧光强度A，由此计算出评价对象的细胞中的广谱细胞角蛋白表达量。另外，由评价对象的细胞中的荧光强度B减去比较例1中得到的解离汗腺细胞中的荧光强度B，由此求出评价对象的细胞中的α-SMA表达量。

将对细胞的种类与广谱细胞角蛋白表达量的关系进行调查的结果示于图3的(A)中，将对细胞的种类与α-SMA表达量的关系进行调查的结果示于图3的(B)中。图3的(A)中，泳道1表示实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的永生化汗腺细胞中的广谱细胞角蛋白表达量，泳道2表示比较例1中得到的解离汗腺细胞中的广谱细胞角蛋白表达量。图3的(B)中，泳道1表示实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的永生化汗腺细胞中的α-SMA表达量，泳道2表示比较例1中得到的解离汗腺细胞中的α-SMA表达量。

由图3的(A)和(B)所示的结果可知，实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的永生化汗腺细胞(参照泳道1)表达了作为肌上皮细胞标志物的广谱细胞角蛋白和α-SMA这两者。由这些结果可知，上述永生化汗腺细胞为永生化汗腺肌上皮细胞。因此可知，通过在使球体悬浮在培养基中的状态下使病毒感染该球体中包含的汗腺细胞，可得到永生化汗腺肌上皮细胞。

(3)永生化汗腺肌上皮细胞中的汗腺细胞标志物的表达的研究

从上述(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞中提取总RNA。向所得到的总RNA中添加不含DNA酶/RNA酶的纯净水[Invitrogen公司制造，商品名：UltraPureDNase/RNase-Free Distilled Water(不含DNA酶/RNA酶的超纯净蒸馏水)]，使总RNA浓度为1μg/μL。使用逆转录试剂盒[QIAGEN公司制造，商品名：Quatitect ReverseTranscription Kit(Quatitect逆转录试剂盒)]由上述总RNA合成cDNA，得到测定试样。

以所得到的测定试样作为模板，使用PCR用试剂盒[东洋纺株式会社制造，商品名：THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix]、实时PCR装置[Applied bio systems制造，商品名：ViiA7]、以及用于扩增ATP1a1基因的引物对，测定以ATP1a1基因的cDNA为模板的核苷酸合成量达到阈值为止的循环数(下文中称为“Ct_A值”)。另外，在上述操作中，使用用于扩增作为对照基因的GAPDH基因的引物对来代替用于扩增ATP1a1基因的引物对，除此以外进行与上述同样的操作，测定以对照基因的cDNA为模板的核苷酸合成量达到阈值为止的循环数(下文中称为“Ct_B值”)。实时RT-PCR法中的热循环程序(thermal profile)是在95℃下、1分钟的处理后将95℃下5秒的变性、55℃下10秒的退火、以及72℃下20秒的延伸作为1个循环的40个循环的反应。

使用Ct_A值和Ct_B值，按照下述式(I)：

[数1]

求出实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的永生化汗腺肌上皮细胞中的ATP1a1基因的表达值。

另外，上述操作中，使用作为对照细胞的不表达ATP1a1基因的皮肤表皮细胞来代替上述(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞，除此以外进行与上述同样的操作，求出对照细胞中的ATP1a1基因的表达值。

通过由永生化汗腺肌上皮细胞中的ATP1a1基因的表达值减去对照细胞中的ATP1a1基因的表达值而求出永生化汗腺肌上皮细胞中的ATP1a1基因的校正表达值。接着，基于上述校正表达值，按照以下的评价基准评价永生化汗腺肌上皮细胞是否表达了ATP1a1基因。

<评价基准>

“永生化汗腺肌上皮细胞表达了ATP1a1基因”

···校正表达值为“正值”。

“永生化汗腺肌上皮细胞未表达ATP1a1基因”

···校正表达值为“0”或“负值”。

其结果，实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的永生化汗腺肌上皮细胞中的ATP1a1基因的表达值为正值，因此可知永生化汗腺肌上皮细胞表达了ATP1a1基因。ATP1a1是汗腺肌上皮细胞标志物之一。因此可知，实施例1中得到的病毒感染汗腺球体中包含的永生化汗腺肌上皮细胞表达了汗腺肌上皮细胞标志物。

实施例2

(1)含有汗腺的组织的制造

作为皮肤组织，使用从生物体(41岁的人)切除后立即在4℃冷藏保存的切除后48小时以内的眼睑的皮肤组织。将皮肤组织浸泡在含有10μM中性红的PBS中，由此使中性红进入到上述皮肤组织中的汗腺中。接着，在光学显微镜下使用镊子和剪刀从上述皮肤组织中分离出包含汗腺的组织片。将分离出的组织片收集在15mL容量管中的无菌PBS内。将含有上述组织片的PBS轻轻振荡后，将该PBS供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清，由此对上述组织片进行清洗。

将制造例1中得到的培养基(I)10mL与上述管中的上述组织片混合。接着，向上述管中的培养基(I)中添加胶原酶II使其浓度为600U/mL。之后，一边利用旋转混匀仪使上述管中的上述组织片旋转，一边在37℃的5体积％二氧化碳气氛中进行温育，由此从上述组织片中除去胶原纤维。

从温育开始时起经过4小时后，将上述管中的培养基(I)和胶原纤维除去后的组织片转移至直径10cm的皿中。在光学显微镜下使用移液器采取上述皿上的上述组织片。将所采取的组织片收集在15mL容量管中的无菌PBS内。将含有上述组织片的PBS轻轻振荡后，将该PBS供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清，由此对上述组织片进行清洗。

将清洗后的组织片和培养基(I)10mL在15mL容量管中混合。向所得到的混合液中添加分散酶使其浓度为1U/mL。将所得到的混合液转移至直径10cm的皿中，之后将上述混合液以静置状态在37℃的5体积％二氧化碳气氛中进行温育。从温育开始时起经过8小时后，向上述混合液中添加2质量％FBS/PBS溶液10mL，将混合液稀释，使酶反应停止。

在光学显微镜下使用移液器采取上述皿上的包含汗腺的组织片。将所采取的组织片收集在15mL容量管中的无菌PBS内。将包含上述组织片的PBS轻轻振荡后，将该PBS供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清，由此得到含有汗腺的组织。

(2)病毒感染

利用上述病毒感染用培养基将hTERT重组病毒颗粒溶液和SV40Tt重组病毒颗粒溶液进行稀释，使hTERT重组病毒颗粒浓度为1×10⁸U/mL、SV40Tt重组病毒颗粒浓度为1×10⁸U/mL，得到含有永生化基因的重组病毒稀释液。

将上述(1)“含有汗腺的组织的制造”中得到的含有汗腺的组织和PBS 9mL混合。接着，将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清。将离心分离后的含有4～10个汗腺的含有汗腺的组织和制造例3中得到的病毒感染用培养基100μL混合。向所得到的混合液中添加上述含有永生化基因的重组病毒稀释液2μL，得到组织-病毒混合液。将上述组织-病毒混合液在37℃的5体积％二氧化碳气氛中温育，使重组慢病毒感染构成汗腺的汗腺细胞。进一步，在病毒感染开始后每隔30分钟～12小时添加上述含有永生化基因的重组病毒稀释液2μL，使重组病毒感染上述含有汗腺的组织中包含的汗腺细胞，由此将永生化基因导入至汗腺细胞中。从病毒感染开始时起经过33小时后，回收病毒感染组织。

试验例3

在试验例2的(1)“球体传代培养”中，使用实施例2中得到的病毒感染组织来代替实施例1中得到的病毒感染汗腺球体，除此以外进行与试验例2的(1)“球体传代培养”同样的操作，进行球体传代培养。

将对实施例2中得到的病毒感染组织中包含的汗腺细胞的球体形成能力与传代数的关系进行调查的结果示于图4的(A)，将对比较例1中得到的解离汗腺细胞的球体形成能力与传代数的关系进行调查的结果示于图4的(B)。图中的箭头表示球体。

由图4所示的结果可知，实施例2中得到的病毒感染组织中包含的汗腺细胞在第7次的传代培养后仍能够形成球体，与之相对，比较例1中得到的解离汗腺细胞在第4次传代培养后无法形成球体。

另外确认到，实施例2中得到的病毒感染组织中包含的汗腺细胞即使在传代12次以上的情况下仍可形成球体。另外，调查了实施例2中得到的病毒感染组织中包含的汗腺细胞中的广谱细胞角蛋白和α-SMA的表达的有无，结果确认到表达了广谱细胞角蛋白和α-SMA。

由以上的结果可知，通过在使含有汗腺的组织悬浮在培养基中的状态下使病毒感染该含有汗腺的组织中包含的汗腺肌上皮细胞，可得到永生化汗腺肌上皮细胞。

参考例3～7

(1)解离汗腺细胞的制造

在参考例1的(1)“解离状态的汗腺细胞的制造”中，代替68岁的人的眼睑的皮肤组织，使用了20岁的人的眼睑的皮肤组织(参考例3)、71岁的人的眼睑的皮肤组织(参考例4)、74岁的人的眼睑的皮肤组织(参考例5)、51岁的人的腹部的皮肤组织(参考例6)或55岁的人的腹部的皮肤组织(参考例7)，除此以外进行与参考例1的(1)“解离状态的汗腺细胞的制造”同样的操作，得到解离汗腺细胞。

(2)球体培养

在参考例1的(2)“球体培养”中，代替参考例1的(1)“解离状态的汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞，使用了参考例3～7的(1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的各解离汗腺细胞，除此以外进行与参考例1的(2)“球体培养”同样的操作，得到含有球体的液体。

实施例3～7

在实施例1中，代替参考例1的(2)“球体培养”中得到的含有球体的液体，使用了参考例3中得到的含有球体的液体(实施例3)、参考例4中得到的含有球体的液体(实施例4)、参考例5中得到的含有球体的液体(实施例5)、参考例6中得到的含有球体的液体(实施例6)或参考例7中得到的含有球体的液体(实施例7)，除此以外进行与实施例1相同的操作，得到病毒感染汗腺球体。

比较例3～7

在参考例1的(1)“解离状态的汗腺细胞的制造”中，代替68岁的人的眼睑的皮肤组织，使用了20岁的人的眼睑的皮肤组织(比较例3)、71岁的人的眼睑的皮肤组织(比较例4)、74岁的人的眼睑的皮肤组织(比较例5)、51岁的人的腹部的皮肤组织(比较例6)或55岁的人的腹部的皮肤组织(比较例7)，除此以外进行与比较例1的(1)“解离状态的汗腺细胞的制造”同样的操作，得到解离汗腺细胞。

试验例4

在试验例2的(1)“球体传代培养”中，代替实施例1中得到的病毒感染汗腺球体，使用了实施例3～7中得到的病毒感染组织，除此以外进行与试验例2的(1)“球体传代培养”同样的操作，进行球体传代培养。

另外，在试验例2的(1)“球体传代培养”中，代替比较例1中得到的解离汗腺细胞，使用了比较例3～7中得到的解离汗腺细胞，除此以外进行与试验例2的(1)“球体传代培养”同样的操作，进行球体传代培养。将具有球体形成能力的细胞的传代数示于表1。

[表1]

由表1所示的结果可知，实施例3～7中得到的病毒感染汗腺球体中包含的汗腺细胞即使在至少18次传代后仍具有球体形成能力。与之相对，可知比较例3和5～7中得到的解离汗腺细胞在2次传代后丧失球体形成能力。另外可知，比较例4中得到的解离汗腺细胞在3次传代后丧失球体形成能力。

由这些结果可知，通过在使球体悬浮于培养基中的状态下使病毒感染该球体中包含的汗腺细胞，不论皮肤组织的供给源的种类如何，均可得到永生化汗腺细胞。

实施例1和3～7中使用的球体以及实施例2中使用的含有汗腺的组织均具有在表面露出有汗腺肌上皮细胞的结构。因此可知，通过一边将在表面露出有汗腺肌上皮细胞的细胞结构体以悬浮在培养基中的状态进行培养一边使保有永生化基因的病毒感染该细胞结构体，能够将永生化基因导入至肌上皮细胞中。

试验例5

(1)球体传代培养

将进行以下的(1-1)和(1-2)的操作定义为“1次传代培养”。

(1-1)解离汗腺细胞的制造

在试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中，代替实施例1中得到的病毒感染汗腺球体，使用了实施例3～7中得到的病毒感染汗腺球体，除此以外进行与试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”同样的操作，得到解离汗腺细胞。

(1-2)球体培养

将上述(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞的一部分(细胞数A的解离汗腺细胞)和2质量％FBS/PBS溶液9mL混合。将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清。向上述管中的解离汗腺细胞中添加制造例5中得到的5U/mL分散酶液1mL后，使用移液器对上述管中的解离汗腺细胞进行搅拌。接着，使上述管中的含有解离汗腺细胞的混合液通过细胞过滤器[网孔尺寸：40μm、Corning制造，商品名：Falcon(注册商标)40μm细胞过滤器、蓝色、灭菌、独立包装]而除去聚集的细胞，由此得到解离汗腺细胞的悬浮液。

将2质量％FBS/PBS溶液9mL与上述管中的解离汗腺细胞的悬浮液混合。将所得到的混合液供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去上清。

接着，将所得到的解离汗腺细胞加入到制造例2中得到的培养基(II)中，使解离汗腺细胞为2.5×10³个/mL，得到含有解离汗腺细胞的混合液。将所得到的混合液加入到低粘附板[Corning公司制造，商品名：超低粘附板24孔]中。在悬浮于上述孔板中的培养基(II)中的状态下将上述解离汗腺细胞在37℃的5体积％二氧化碳气氛中进行温育。

培养开始后，在形成了球体的时刻将上述球体转移至15mL容量管中。将上述球体供于350×g、4℃下5分钟的离心分离，除去液体成分。接着，将细胞回收用溶液(Corning公司制造，商品名：Cell Recovery Solution)1mL与上述管中的球体混合，得到含有球体的液体。之后将加入有所得到的含有球体的液体的管在冰上静置1～2小时。

(1-3)细胞增殖能力的评价

反复进行包括上述(1-1)“解离汗腺细胞的制造”和(1-2)“球体培养”的一系列操作直至球体形成停止为止。

使用上述细胞数A和在传代数n(n表示正整数)的球体传代培养时在上述(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞数(下文中称为“细胞数B”)，按照式(II)：

[各传代间的细胞增殖倍率(K_X)]＝[细胞数B]/[细胞数A](II)

求出各传代间的细胞增殖倍率(K_X)。使用各传代间的细胞增殖倍率(K_X)，按照式(III)：

[总细胞增殖倍率]＝K₁×K₂···×K_X(III)

(式中，X表示正整数)

求出实施例3～7中得到的球体中包含的汗腺细胞的总细胞增殖倍率。将其结果示于表2。

[表2]

“-”表示不能算出。

由表2所示的结果可知，实施例3～7中得到的球体中包含的永生化汗腺细胞的总细胞增殖倍率为2.6×10¹³倍以上。与之相对，未永生化的汗腺细胞的总细胞增殖倍率为2.1倍以下。由这些结果可知，与未永生化的汗腺细胞的细胞增殖能力相比，实施例3～7中得到的球体中包含的永生化汗腺细胞的细胞增殖能力提高。

试验例6

(1)解离汗腺细胞的制造

在试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中，代替实施例1中得到的病毒感染汗腺球体，使用了实施例3中得到的球体(实验编号1)、实施例4中得到的球体(实验编号2)或实施例5中得到的球体(实验编号3)，除此以外进行与试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”同样的操作，得到解离汗腺细胞。需要说明的是，上述操作中，作为实施例3中得到的球体，使用传代数5次的球体，作为实施例4中得到的球体，使用传代数8次的球体，作为实施例5中得到的球体，使用传代数14次的球体。

(2)解离汗腺细胞的冷冻保存

将试验例6的(1)“解离完成细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞按照表3所示的浓度混悬在冷冻保存液[Takara Bio株式会社制造，商品名CELLBANKER(注册商标)1plus]1mL中。将所得到的混悬液在保持于-80℃的冷柜中冷冻，得到冷冻细胞。将所得到的冷冻细胞在保持于-80℃的冷柜或液氮中保存表3所示的期间。之后将冷冻物解冻，得到实验编号1～3的解冻细胞。对所得到的解冻细胞数进行测定。下面使用解冻细胞数作为细胞数C。

[表3]

实验编号	浓度(个/mL)	保存期间(天)
			1	4.0×10<sup>5</sup>	75
2	5.3×10<sup>4</sup>	129
			3	4.5×10<sup>4</sup>	50

(2)球体形成

在试验例2的(1-2)“球体培养”中，代替试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞，使用了试验例6的(2)“解离汗腺细胞的冷冻保存”中得到的解冻细胞，除此以外进行与试验例2的(1-2)“球体培养”同样的操作，得到实验编号1～3的含有球体的液体A。

(3)球体传代培养

将进行以下的(3-1)和(3-2)的操作定义为“1次传代培养”。

(3-1)解离汗腺细胞的制造

在试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中，代替实施例1中得到的病毒感染汗腺球体，使用了试验例6的(2)“球体形成”中得到的含有球体的液体A中的实验编号3的含有球体的液体A，除此以外进行与试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”同样的操作，得到实验编号3的解离汗腺细胞。

(3-2)球体培养

在试验例2的(1-2)“球体培养”中，代替试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞，使用了试验例6的(3-1)“解离汗腺细胞的制造”中得到的解离汗腺细胞(实验编号3)，除此以外进行与试验例2的(1-2)“球体培养”同样的操作，得到实验编号3的含有球体的液体B。

(3-3)细胞增殖能力的评价

在试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”中，代替实施例1中得到的病毒感染汗腺球体，使用了实验编号1的含有球体的液体A中包含的球体、实验编号2的含有球体的液体A中包含的球体和实验编号3的含有球体的液体B中包含的球体(实验编号1～3的球体)，除此以外进行与试验例2的(1-1)“解离汗腺细胞的制造”同样的操作，得到传代培养细胞。测定所得到的传代培养细胞数(下文中称为“细胞数D”)。

接着，使用细胞数C和细胞数D，按照式(IV)：

[细胞增殖倍率]＝[细胞数D]/[细胞数C](IV)

求出将实验编号1～3的球体中包含的永生化汗腺细胞冷冻保存时的细胞增殖倍率。将细胞增殖能力的评价结果示于表4。表中，细胞增殖能力和球体形成能力的评价基准如下所述。

<细胞增殖能力的评价基准>

+：按照式(IV)计算出的细胞增殖率大于1。

–：按照式(IV)计算出的细胞增殖率为1以下。

<球体形成能力的评价基准>

+：在光学显微镜下确认到球体的形成。

–：在光学显微镜下未确认到球体的形成。

[表4]

由表4所示的结果可知，实验编号1～3的球体中包含的永生化汗腺细胞具有良好的细胞增殖能力和良好的球体形成能力。由这些结果可知，实验编号1～3的球体中包含的永生化汗腺细胞即使在进行了冷冻保存的情况下，细胞增殖能力和球体形成能力也优异，因此保存稳定性优异。

由以上说明可知，通过一边将在表面露出有汗腺肌上皮细胞的细胞结构体以悬浮在培养基中的状态进行培养一边将永生化基因导入至该汗腺肌上皮细胞中，可得到永生化汗腺肌上皮细胞。另外可知，通过进行上述操作而得到的永生化汗腺肌上皮细胞具有与生物体内的汗腺肌上皮细胞同样的功能和性质，能够使具有该功能和性质的细胞长期增殖。因此，本发明的永生化汗腺肌上皮细胞和永生化汗腺肌上皮细胞的制造方法可期待被用于止汗剂、除臭剂等外用剂、汗腺功能的改善剂等的开发等中。