阅读说明：本技术 一种高载硒量的介孔二氧化硅长效抗菌纳米材料的制备方法 (Preparation method of mesoporous silica long-acting antibacterial nanomaterial with high selenium loading ) 是由 倪似愚 陈晶晶 魏媛媛 杨雪霞 金熙 江浩 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种高载硒量的介孔二氧化硅长效抗菌纳米材料的制备方法。该方法包括：扩孔的介孔二氧化硅制备,硒源和抗坏血酸混合溶液制备,载硒的介孔二氧化硅抗菌纳米材料制备。该方法获得的Se-MSNs具有载硒量高、可调控性强,分散性好,颗粒均一,Se可以充分填充在MSNs的孔道中,相较于纯Se,Se-MSNs颗粒在分散度方面有明显的优势,因此Se-MSNs具有长效释放,持久抗菌等特点,有望作为一种新型无毒无害型的长效抗菌材料。(The invention relates to a preparation method of a mesoporous silica long-acting antibacterial nano material with high selenium loading. The method comprises the following steps: preparing expanded mesoporous silica, preparing a selenium source and ascorbic acid mixed solution, and preparing a selenium-loaded mesoporous silica antibacterial nano material. The Se-MSNs obtained by the method have the advantages of high selenium loading, strong controllability, good dispersibility, uniform particles, Se can be fully filled in pore channels of the MSNs, and the Se-MSNs particles have obvious advantages in dispersion compared with pure Se, so that the Se-MSNs have the characteristics of long-acting release, long-acting antibiosis and the like, and are expected to be used as a novel non-toxic and harmless long-acting antibacterial material.)

一种高载硒量的介孔二氧化硅长效抗菌纳米材料的制备方法

技术领域

本发明属于抗菌材料制备领域，特别涉及一种高载硒量的介孔二氧化硅长效抗菌纳米材料的制备方法。

背景技术

硒作为人体必需的微量元素之一，是人体多种酶的组成成分。一直以来，它在抗癌、拮抗重金属、增强人体免疫功能等方面发挥着重要作用。有研究显示硒纳米颗粒与乙酰胆碱氯化物和槲皮素复合对超级细菌具有高抗菌和杀菌活性，并且不会产生耐药性。另外，有研究发现羟基磷灰石上的纳米硒涂层对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌具有良好的抗菌性。从生物安全性的角度考虑，硒元素的内源性与药物或外源性生长因子的高成本、复杂的制造和非预期的副作用相比，具有更加可靠的安全性和经济性。但是硒的营养活性剂量与其毒性剂量之间范围较窄，过量会导致硒中毒。纳米硒的发明不仅保留了传统硒的优点，并能有效改善这一难题。然而，纳米硒极易发生团聚，严重影响其生物活性和生物利用度。因此，构建适当的纳米硒可调节释放体系，可以降低其副作用和提高其生物学活性。

介孔二氧化硅(MSNs)因其粒子尺寸均一可调、可调节的介孔结构、载药效率高、生物相容性好和易功能化及表面修饰等优势，被广泛用于构建药物速释、缓释和控释系统等方面。目前一些常用元素已被负载于MSNs中发挥各种各样的功能：对MSNs表面进行氨基修饰并负载纳米银作为抗菌剂，载银量达到7.27％(李炳坤,王超丽,陈鹏,et al.载银介孔纳米二氧化硅复合抗菌材料的制备及其性能研究[J].南开大学学报(自然科学版),2018,v.51(02):33-40.)。利用原位一锅法制备的掺铜Cu-MSNs用于促成骨的免疫调节剂，载Cu量达到5％(Shi M,Chen Z,Farnaghi S,et al.Copper-doped mesoporous silicananospheres,a promising immunomodulatory agent for inducing osteogenesis[J].Acta Biomaterialia,2016,30:334-344.)；利用表面电荷作用制备介孔硅包覆纳米硒用于抗肿瘤，尺寸在380nm左右(Yu B,Zhou Y,Song M,et al.Synthesis of seleniumnanoparticles with mesoporous silica drug-carrier shell for programmedresponsive tumor targeted synergistic therapy[J].Rsc Advances,2016,6(3):2171-2175.)。因此结合纳米Se的多功能性，MSNs负载纳米Se颗粒，可以构建多功能单元。

中国专利CN109179430A公开了溶胶-凝胶原位法制备了负载纳米Se的MSNs，该方法制备的Se-MSNs材料粒径可控性不强，负载的纳米Se多随机吸附在MSNs表面，当Se含量大于10wt.％时，则Se/MSNs以核壳结构的形式存在。因此，该方法的局限性主要在于无法精确调控Se的负载量，当载Se量达到10wt.％后，则为核壳结构，同时粒径变大，不利于纳米Se的释放，影响其生物活性。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种高载硒量的介孔二氧化硅长效抗菌纳米材料的制备方法，以克服现有技术硒不能大量均匀负载在介孔二氧化硅的孔道中的缺陷。

本发明采用超声辅助-熔融渗透(Ultrasonication assisted-meltinfiltration，UA-MI)方法制备Se-MSNs可以很好地改善了以上缺陷，并具有如下特点：(1)MSNs的介孔孔道可进一步利用化学刻蚀剂反应，扩大孔径；(2)利用Se的低熔点性(217℃)及MSNs较大的介孔结构，在一定温度下，使熔融态Se借助流动性和虹吸效应灌注到MSNs的介孔结构中，将Se单质均匀地填充到MSNs的孔道中并调节其负载量，有效地利用了MSNs介孔结构的优势，显著提高Se的负载率。

本发明提供一种载硒的介孔二氧化硅抗菌纳米材料的制备方法，包括：

(1)将介孔二氧化硅MSNs与刻孔剂水溶液混合，搅拌，离心，洗涤，冷冻干燥，得到扩孔的介孔二氧化硅；其中MSNs与刻孔剂质量比为0.125～0.25；

(2)将硒源与步骤(1)中扩孔的介孔二氧化硅加入到水中，将抗坏血酸加入到水中，超声条件下将得到的抗坏血酸溶液迅速滴加入得到的硒源和扩孔的介孔二氧化硅溶液中反应，得到混合溶液，其中混合溶液中扩孔的介孔二氧化硅浓度为5mg/mL～10mg/mL，硒源浓度为30mmol/L～60mmol/L，抗坏血酸浓度为45mmol/L～137mmol/L；

(3)将步骤(2)中混合溶液冷冻干燥，然后煅烧，洗涤，离心，冷冻干燥，得到载硒的介孔二氧化硅抗菌纳米材料Se-MSNs。

所述步骤(1)中介孔二氧化硅MSNs的制备方法包括：将模板剂和pH调节剂溶解于水中，在80℃搅拌反应50min～70min，滴加入硅源，继续反应50min～70min，冷却至室温，离心，冷冻干燥，然后煅烧，即得。

所述模板剂包括十六烷基三甲溴化铵CTAB或十六烷基三甲氯化铵CTAC。

所述pH调节剂包括氟化铵NH₄F、三乙醇胺TEA或氢氧化钠NaOH。

所述硅源包括正硅酸乙酯TEOS、正硅酸丙酯TPOS或正硅酸丁酯TBOS。

所述搅拌反应转速为200～300rpm。

所述离心速度为10000～10500rpm，离心时间为10～15min。

所述煅烧的工艺参数为：升温速度为1～2℃/min，600℃煅烧5h。煅烧是为了除去MSNs中的模板剂。

所述步骤(1)中刻孔剂包括碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾。

所述步骤(1)中刻孔剂水溶液浓度为0.2～0.5mol/L。

所述步骤(1)中搅拌温度为21～25℃，搅拌时间为7～9h。

所述步骤(1)中搅拌转速为200～300rpm。

所述步骤(1)中离心速度为10000～10500rpm，离心时间为10～15min。

所述步骤(1)中洗涤为：用去离子水和无水乙醇各洗涤三次。

所述步骤(2)中硒源包括***钠Na₂SeO₃或硒酸钠Na₂SeO₄。

所述步骤(2)中硒源和抗坏血酸摩尔比为1:3～1:4。

所述步骤(2)中反应为：出现沉淀后继续反应15min。

所述步骤(3)中煅烧温度为235℃，煅烧时间为5h。

所述步骤(3)中洗涤为：用去离子水反复洗涤静置直到废液为澄清透明。

所述步骤(3)中Se-MSNs的Se负载量为5wt.％-45wt.％；Se-MSNs粒径为119.2±4.7nm。

本发明还提供一种上述方法制备得到的载硒的介孔二氧化硅抗菌纳米材料。

本发明还提供一种上述方法制备得到的载硒的介孔二氧化硅抗菌纳米材料的应用。

本发明采用溶胶-凝胶方法制备得到介孔二氧化硅(MSNs)，并进一步利用化学刻蚀法处理获得一种较大孔径的介孔二氧化硅，然后通过超声辅助-熔融渗透方法(Ultrasonication assisted-melt infiltration，UA-MI)负载高量纳米硒(Se)，超声条件下将抗坏血酸溶液迅速滴加入硒源和扩孔的介孔二氧化硅溶液中反应，得到混合溶液，然后将混合溶液冷冻干燥，煅烧，这样可以使纳米Se充分填充在孔道内，从而负载高量纳米硒，由于纳米Se充分填充在孔道内，可达到缓慢持久的释放效果。本发明制备的扩孔的MSNs平均孔径和孔容分别为9.60nm和0.24cc/g，将其作为载体负载纳米硒Se得到的Se-MSNs，其中含硒量最高可达45wt.％，且负载量在5wt.％-45wt.％可精确调控，粒径为119±4nm。

本发明中Se-MSNs功能单元结构稳定、尺寸可控、具有良好的分散性，更重要的是可以利用更少量的MSNs负载更多量的Se，提高了纳米Se的负载率和MSNs的利用率。

有益效果

本发明获得的Se-MSNs具有载硒量高、可调控性强，分散性好，颗粒均一，Se可以充分填充在MSNs的孔道中。相较于纯Se，Se-MSNs颗粒在分散度方面有明显的优势，因此Se-MSNs具有长效释放，持久抗菌等特点，对金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC6538)有良好的杀菌作用，同时，Se-MSNs材料经过两次回收后杀菌率依然达到100％，可作为一种可重复使用的长效抗菌材料。本发明工艺简单，可控性强，成本低。

附图说明

图1为实施例1-4中不同含Se量的Se-MSNs在不同pH下的释放曲线，其中(a)pH＝5.5；(b)pH＝7.4。

图2为实施例1-4中未刻蚀MSNs和刻蚀MSNs的氮气等温吸脱附曲线(a)和BJH模型孔径分布图(b)。

图3为实施例1-4中不同载Se量Se-MSNs的场发射扫描电镜图，其中(a)载Se量为30wt.％，(b)载Se量为35wt.％，(c)载Se量为40wt.％，(d)载Se量为45wt.％。

图4为实施例1-2和4-5中不同含Se量的Se-MSNs样品的XRD图。

图5为实施例1和3-4中不同含Se量的Se-MSNs和纯Se(a)、第一次回收的实施例3中Se-MSNs和纯Se(b)、第二次回收的实施例3中Se-MSNs(c)对S.aureus的抑制作用图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

选择分析纯的***钠，抗坏血酸，十六烷基三甲溴化铵(CTAB，国药集团工业股份有限公司)，氟化铵(NH₄F，国药集团工业股份有限公司)，正硅酸乙酯(TEOS，国药集团工业股份有限公司)，通过该制备方法合成载Se量30wt.％的Se-MSNs。其具体步骤为：

称取0.90g CTAB、1.50g NH₄F，随后加入250mL去离子水，反应温度80℃，充分搅拌1h，转子转速控制在200～300rpm；反应1h后，向反应体系中逐滴加入1.8mL的TEOS，继续反应1h后，冷却至室温将样品离心，将沉淀冷冻干燥得到的白色粉末置于马弗炉600℃煅烧5h，除去MSNs中的CTAB；称取1.59g无水碳酸钠溶解在50mL去离子水中，得到浓度为0.3mol/L的刻蚀液；搅拌条件下将0.50g MSNs加入刻蚀液中，转速控制在200～300rpm，温度控制在21～25℃，时间保持在8h，10000～10500rpm离心后用去离子水和无水乙醇洗涤三次，最后冷冻干燥离心后的沉淀产物，得到扩孔的MSNs。

称取0.38g***钠和0.50g扩孔的MSNs溶解到50mL去离子水中，记为A液；称取1.20g抗坏血酸溶解到20mL去离子水中，记为B液；充分搅拌(转速控制在200～300rpm)使其全部溶于去离子水中；超声条件下，将B液用注射器迅速滴加到A液，待反应液出现红色物质后继续反应15min，记为C液；将C液冷冻干燥，然后将产物置于马弗炉235℃煅烧5h，最后用去离子洗涤至废液为澄清透明，将沉淀冷冻干燥得到红色粉末30wt.％Se-MSNs。

实施例2

通过该制备方法合成载硒量20wt.％的Se-MSNs。其具体步骤为：

扩孔的MSNs制备方法与实施例1相同。

根据实施例1，将***钠用量改为0.25g，抗坏血酸用量改为0.75g，其余均与实施例1相同，得到红色粉末20wt.％Se-MSNs。

经测试，其抗菌性能所得结果与实施例1相似。

实施例3

通过该制备方法合成载硒量35wt.％的Se-MSNs。其具体步骤为：

扩孔的MSNs制备方法与实施例1相同。

根据实施例1，将***钠用量改为0.437g，抗坏血酸用量改为1.29g，其余均与实施例1相同，得到红色粉末35wt.％Se-MSNs。

经测试，其抗菌性能所得结果与实施例1相似。

实施例4

通过该制备方法合成载硒量40wt.％的Se-MSNs。其具体步骤为：

扩孔的MSNs制备方法与实施例1相同。

根据实施例1，将***钠用量改为0.50g，抗坏血酸用量改为1.50g，其余均与实施例1相同，得到红色粉末40wt.％Se-MSNs。

经测试，其抗菌性能所得结果与实施例1相似。

实施例5

通过该制备方法合成载硒量45wt.％的Se-MSNs。其具体步骤为：

扩孔的MSNs制备方法与实施例1相同。

根据实施例1，将***钠用量改为0.563g，抗坏血酸用量改为1.69g，其余均与实施例1相同，得到红色粉末45wt.％Se-MSNs。

经测试，其抗菌性能所得结果与实施例1相似。

表1是利用刻蚀过的MSNs通过AU-MI法负载纳米Se的理论负载量与实际负载量的比较，该数据通过电感耦合等离子光谱产生仪(ICP)测出，结果表明，利用MI方法能够成功制备出高载Se量的Se-MSNs纳米功能单元。

表1

实施例1-5中Se-MSNs的释放性能和抗菌性能的测试如下：

Se的释放性能测试采用如下方法：

(1)配制pH＝5.5和pH＝7.4的两种PBS缓冲溶液各500mL；

(2)选取30wt.％、35wt.％、40wt.％和45wt.％四种Se-MSNs样品，每个样品各称取10mg装入透析袋(截留分子量5000)，并加入1mL相应pH的PBS缓冲溶液，然后将透析袋用尼龙扎带密闭封口。每个样品每种pH分别设置3组平行实验；

(3)采用50mL塑料小瓶作为容器，每个小瓶子装入40mL PBS缓冲溶液；

(4)放在37℃摇床中培养，转速为180rpm。分别取0，3，7，11，20，30，40，50，60天的样品，取上层清液4毫升进行ICP测试；

(5)取多少缓冲液，在取样结束后重新补充相同量相应pH的缓冲液。

抗菌性能的测试采用如下方法：

实验菌种采用金黄色葡萄球菌(S.aureus，ATCC6538)。称取含琼脂培养基16g加400mL去离子水于锥形瓶中配制成400mL LB琼脂培养基，称取1.25g不含琼脂培养基加50mL去离子水配成50mL LB培养基，pH调为7.2，准备1mL离心管及枪头若干，PBS溶液等湿热灭菌待用。将灭菌结束的固体培养基倒平板，静置冷却凝固后放入37℃恒温培养箱培养12h。将保存于平板的菌种挑取一个菌落放入液体培养基中，37℃摇床中摇菌6h，从液体培养基中取适量用紫外分光光度计测其OD₆₀₀值，其值在0.8-1.0时菌悬液浓度的数量级为10⁸CFU/mL。称取扩孔的MSNs 0.10g、30wt.％、40wt.％和45wt.％Se-MSNs各0.1g、未加入分散剂合成的纯Se 0.05g加入到锥形瓶中湿热灭菌备用。取100μL菌液加入到装有25mL LB培养基的锥形瓶中和材料共培养，材料组和对照组均设置3个平行样。共培养时间设置为12h、24h、36h、48h和60h。共培养时间到达后，取菌悬液用PBS稀释，稀释梯度依次为10⁰，10^-1，10^-2到10^-8。点样法判断抑菌性，用移液枪吸取不同浓度的稀释液各10μL依次点样到琼脂培养基上，拍照并计算样品的抑菌率。

第一次抗菌测试后，样品进行回收。灭菌、分散处理后，按照上述步骤进行二次抗菌测试，并计算杀菌率，此步骤重复2-3次。

抑菌率＝(C-T)/C×100％

式中：

C-对照组细菌菌落的平均值；

T-材料组共培养后计算得到的细菌菌落平均值。

图1为载Se量分别为30wt.％、35wt.％、40wt.％和45wt.％Se-MSNs在pH分别为5.5和7.4时的累积60天的释放曲线，可以看出Se-MSNs材料中的Se可以长期、稳定地释放，并且，随着载Se量的增加，Se的累积释放量也在增加。

图2a可以看出未经刻蚀的MSNs在P/P₀为0.5-0.8范围内吸附曲线和脱附曲线分离，符合IV型等温线特点，说明该材料有介孔结构。由BJH方法得到的孔径分布图2b可看出，未经刻蚀的MSNs平均孔径为2.45nm左右，比表面积为298.53m²/g，平均孔容为0.20cc/g。经过刻蚀的MSNs孔径分布在9.60nm左右，比表面积为229.40m²/g，平均孔容为0.24cc/g。

图3可以看出Se-MSNs保持完整的球状，分散度良好，粒径没有发生明显改变，维持在114±9nm。

图4可以看出Se-MSNs复合材料含有Se，并可以成功制备出不同含Se量的Se-MSNs样品。其晶型为六方晶型：Se 23.498(100)、Se 29.681(101)、Se 41.304(110)、Se 43.616(012)、Se 45.336(111)。

图5为Se-MSNs对金黄色葡萄球菌的抗菌实验，从图5a可以看出分散性不好的纯Se，即团聚的Se在24h前，并没有表现出明显的抑菌效果，24h才开始有明显抑菌效果。而Se-MSNs相较于较团聚的Se，对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，其载Se量分别为30wt.％和40wt.％时，在12h杀菌率即可达到97.6％以上，作为对照的扩孔的MSNs完全不具有明显的抗菌性能。考虑到样品能否可以进行循环利用，对样品40wt.％Se-MSNs和纯Se进行二次和三次离心回收，并重复抗菌实验，结果分别见图5b和5c。图5b表明，纯Se在进行回收后没有明显的抑菌效果，而40wt.％Se-MSNs比首次使用表现出更好的抑菌作用。图5c表明第二次回收后，40wt.％Se-MSNs具有比第一次回收更明显的抑菌效果，在12h时的抑菌率达到99.99％。

本发明与中国专利CN109179430A相比：

(1)本发明载体MSNs进行扩孔，中国专利CN109179430A中载体MSNs并未进行扩孔，本发明和中国专利CN109179430A中MSNs比较见表s-1；

(2)本发明采用超声辅助-熔融渗透方法制备Se/MSNs，中国专利CN109179430A采用的是溶胶凝胶原位方法；

(3)本发明中Se/MSNs的含硒量在5％-45％(见表1)，中国专利CN109179430A中Se/MSNs的含硒量为5％-10％；

(4)本发明中Se/MSNs的粒径控制在114±9nm，而中国专利CN109179430A中Se/MSNs粒径直径为50-200nm。

表s-1.BET数据比较

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。