阅读说明：本技术 一种脱除异种角膜细胞的方法 (Method for removing heterogeneous corneal cells ) 是由 王海利 张晋南 宇咏梅 唐小琪 马百双 甘良波 于 2019-11-04 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种脱除异种角膜细胞的方法,包括预脱步骤和脱除步骤,所述预脱步骤包括：将角膜密封后置于液氮中冷冻,再将冷冻后的角膜置于水浴中解冻；所述脱除步骤包括：将解冻后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡,再将振荡后的角膜置于等渗液中进行超声,以脱除角膜细胞；所述脱细胞试剂包含0.2-1.0％中性蛋白酶和0.01-0.20％EDTA。本发明使用温和的中性蛋白酶和EDTA作为脱细胞试剂,有利于保持角膜的微观结构；本发明将角膜浸于脱细胞液中振荡处理之后,再在等渗液中进行超声,有效缩短角膜与酶的接触时间,在达到脱掉细胞目的的同时,能够使角膜胶原纤维基本结构得以保持。(The invention discloses a method for removing heterogeneous corneal cells, which comprises a pre-removing step and a removing step, wherein the pre-removing step comprises the following steps: sealing the cornea, freezing the cornea in liquid nitrogen, and unfreezing the frozen cornea in water bath; the removing step comprises: placing the unfrozen cornea into a cell removal reagent for oscillation, and then placing the oscillated cornea into isotonic solution for ultrasonic treatment to remove the corneal cells; the decellularization reagent contains 0.2-1.0% of neutral protease and 0.01-0.20% of EDTA. The invention uses mild neutral protease and EDTA as acellular reagent, which is beneficial to maintaining the microstructure of the cornea; the invention soaks the cornea in the acellular fluid for oscillation treatment, and then carries out ultrasound in the isotonic fluid, thereby effectively shortening the contact time between the cornea and the enzyme, and keeping the basic structure of the corneal collagen fiber while achieving the purpose of acellular removal.)

一种脱除异种角膜细胞的方法

技术领域

本发明属于组织工程技术领域，具体涉及一种脱除异种角膜细胞的方法。

背景技术

随着组织工程学的兴起，组织工程角膜材料作为解决因角膜盲病患者带来了新的希望。组织工程角膜是将天然的动物角膜作为原材料，利用脱细胞的方法去除异种角膜的外源细胞及抗原物质，从而获得异种无细胞的角膜细胞外基质材料。组织工程角膜在临床应用须要满足三个最基本的要求，一是异种角膜细胞被脱除的彻底性，二是角膜的透明度，三是角膜的生理弧度。因此，异种细胞脱除是否彻底是组织工程角膜能否应用于临床的首要因素，如果异种细胞脱除不彻底，将产生免疫排斥反应，导致移植效果欠佳甚至失败。

常用的脱细胞方法包括化学法、物理法和生物酶法。常规单一的化学法或者物理法脱细胞需要长时间的作用才能达到脱细胞效果，且长时间的作用又会造成角膜胶原蛋白的微观结构破坏。专利文献201510074946.7(专利名称：一种人工角膜的制备方法)利用板层刀制备板层角膜，钻取指定大小的角膜片，通过冻融、超声联合核酸内切酶降解法进行脱细胞。该方法中利用板层刀获取板层角膜，无法保证切面的平整性，从而影响移植后与植床的贴合性，导致术后透明度的恢复。专利文献201410230365.3(专利名称：一种板层角膜基质支架及其制备方法)将动物角膜依次进行低渗溶胀、反复冻融、利用DNA酶和RNA酶的缓冲体系进行酶消化处理。专利文献201610080864.8(专利名称：利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法)将牛角膜浸泡在低渗溶液中，取出角膜上皮细胞得到包含前弹力层和比分基质层的牛角膜基质，反复冻融后再用缓冲液漂洗，放入脱细胞试剂中浸泡脱细胞，再用超纯水对牛角膜基质进行冲洗，最后放入脱水剂中浸泡、灭菌，制得牛角膜基质。以上两件专利技术均使用了低渗溶液，这种溶液致使角膜易溶胀，对角膜基质结构破坏性较大。

发明内容

针对现有技术的缺点和局限，本发明提供一种采用低毒性试剂和温和的处理方法制备得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质的方法，包括预脱步骤和脱除步骤：

所述预脱步骤包括：将角膜密封后置于液氮中冷冻，再将冷冻后的角膜置于水浴中解冻；

所述脱除步骤包括：将解冻后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡，再将振荡后的角膜置于等渗液中进行超声，以脱除角膜细胞；

所述脱细胞试剂包含0.2-1.0％(w/v)中性蛋白酶和0.01-0.20％(w/v)EDTA；

所述等渗液具有不会使角膜胶原纤维结构改变的渗透压参数。

中性蛋白酶具有破坏细胞结构，加速细胞的裂解的作用，EDTA具有结合金属离子，破坏细胞对ECM的粘附的作用，二者一起使用时，EDTA能够促进中性蛋白酶的脱细胞效果，并且有利于保持角膜板层胶原纤维基本结构不被破坏。与现有技术相比，本发明使用温和的中性蛋白酶和EDTA作为脱细胞试剂，有利于保持角膜的微观结构；本发明将角膜浸于脱细胞液中振荡处理之后，再在等渗液中进行超声，有效缩短角膜与酶的接触时间，在达到脱掉细胞目的的同时，能够使角膜胶原纤维基本结构得以保持。

在本发明非限制性的实施方式中，所述密封是指将角膜置于密闭容器中加以密封，防止在冷冻过程中染菌污染。

在本发明非限制性的实施方式中，所述冷冻是指将角膜密封后置于液氮中5-60min；本领域技术人员可以根据角膜的具体数量选择冷冻所需的具体时长，冷冻时间过短可能起不到细胞冰冻结晶，进而使细胞破碎的目的，导致细胞破碎不彻底，冷冻时间过长可能导致角膜胶原纤维损伤，进而导致角膜基本结构难以恢复，并且生产成本增加。

在本发明非限制性的实施方式中，所述解冻是指使被冷冻的角膜解冻变为类似冷冻前状态的过程，本领域技术人员可以利用本领域常用的解冻办法对冷冻后的角膜进行解冻，例如将角膜放置常温空气中解冻。在本发明非限制性的实施方式中，优选将角膜置于水浴中进行解冻。

在本发明非限制性的实施方式中，水浴的优选温度是20-37℃，温度过高将使角膜变性，温度过低则达不到使角膜细胞有效破碎的目的。

在本发明非限制性的实施方式中，除了水浴的温度，将冷冻后的角膜置于水浴中的持续时长也将影响角膜细胞的破碎，进而影响角膜细胞的脱除，置于水浴中时间过短起不到解冻的效果，置于水浴中时间过长则会使角膜泡发，使角膜基本结构难以复原，优选将冷冻后的角膜板层置于水浴中的持续时长为10-30min。

在本发明非限制性的实施方式中，通过预脱步骤的冷冻和解冻促使细胞破碎，进而有利于细胞脱除。预脱步骤更有利于细胞破碎和去除，但重复次数过多将使角膜基本结构受到破坏。优选重复预脱步骤1-5次，以脱除步骤为结束。

在本发明非限制性的实施方式中，通过预脱步骤在温和的环境中使细胞破碎进而利于脱除，本领域的技术人员熟知，重复脱除步骤更有利于细胞彻底脱除，但重复次数过多将使角膜基本结构受到破坏。优选重复脱除步骤1-8次。

在本发明非限制性的优选实施方式中，所述振荡处理优选为：在4-45℃的脱细胞试剂中振荡10-120min。本领域的技术人员熟知，角膜与酶的接触时间越短，越有利于其基本结构的保持，申请人经过多次试验总结认为，使角膜浸没在脱细胞液中同时进行振荡处理之后，再在等渗液中进行超声，可以有效缩短角膜与酶的接触时间，并且在达到脱掉细胞目的的同时，能够使角膜胶原纤维基本结构得以保持。

在本发明非限制性的优选实施方式中，所述等渗液为生理盐水或/和PBS缓冲液，所述等渗液具有不会使角膜胶原纤维结构改变的渗透压参数。

在本发明非限制性的优选实施方式中，脱除步骤所述超声的频率和持续时长参数与水浴的参数具有类似的道理，超声频率过高或过低、持续时长过短或过长都会影响角膜细胞的脱除效果，所述超声的优选频率为10-100kHz，超声持续时长优选为8-15min。

在本发明非限制性的实施方式中，在所述预脱步骤之前还包括去除角膜上皮层之后进行削切，本领域技术人员也可根据后续处理要求及临床使用需求确定板层角膜的厚度。申请人经过大量试验总结认为，当厚度为200-500μm时，既便于后续处理，又使制成的角膜能够满足临床使用需求。

在本发明非限制性的优选实施方式中，在所述脱除步骤之后还包括将脱细胞后的角膜放入软化液中静置，所述软化液具有促进角膜胶原微观结构恢复的作用，使角膜更加透明，提高临床应用效果。在本发明非限制性的上述实施方式中，所述软化液含有聚乙烯比咯烷酮。含有聚乙烯比咯烷酮的软化液能够保护板层角膜在软化液中不被溶胀，促进角膜胶原结构的恢复，使角膜更加透明，提高临床应用效果。

在本发明非限制性的优选实施方式中，所述软化液含有聚乙烯比咯烷酮和透明质酸。

在本发明非限制性的优选实施方式中，所述软化液含有聚乙烯比咯烷酮和L-天冬氨酸。

在本发明非限制性的优选实施方式中，所述软化液含有聚乙烯比咯烷酮以及透明质酸和L-天冬氨酸。

在本发明非限制性的上述实施方式中，所述软化液的成分优选为：0.1-5％聚乙烯比咯烷酮、0.1-3％透明质酸、0.1％-4％L-天冬氨酸，其余为水。含有聚乙烯比咯烷酮、透明质酸、天冬氨酸的软化液能够保护板层角膜在软化液中不被溶胀，促进角膜胶原结构的恢复，使角膜更加透明，提高临床应用效果。

在本发明非限制性的优选实施方式中，所述软化液的温度优选为2-37℃，所述静置的持续时长优选为10-60min。

在本发明非限制性的实施方式中，所述异种为猪。但本领域技术人员熟知，本发明提供的技术方案是针对哺乳动物角膜细胞进行的处理，与哺乳动物的细胞种类并无关系，只要是哺乳动物角膜细胞即可适用于此方法进行处理，进而得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

与现有技术相比，本发明使用温和的中性蛋白酶和EDTA作为脱细胞试剂，有利于保持角膜的微观结构；本发明将角膜浸于脱细胞液中振荡处理之后，再在等渗液中进行超声，有效缩短角膜与酶的接触时间，在达到脱掉细胞目的的同时，能够使角膜胶原纤维基本结构得以保持；在本发明非限制性的优选实施方式中，将脱细胞后的角膜放入软化液中静置，能够有效促进角膜胶原微观结构的恢复；进而得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

附图说明

附图1本发明实施例9和10制备得到的脱细胞角膜基质的扫描电镜照片

具体实施方式

下面结合附图对本发明非限制性的实施方式进一步说明。需要说明的是，下述具体实施方式仅为举例说明，不应理解为对本发明技术方案的限定。

本发明所述板层角膜是指去除角膜上皮层而获取的包括前弹力层和基质层且能够用于临床移植的角膜，如未特殊标注，本发明具体实施方式所述角膜与板层角膜含义相同；如未特殊标注，本发明具体实施方式的试验环境为满足三类医疗器械洁净度的环境；本发明具体实施方式所使用的水为注射用水；本发明具体实施方式所述脱细胞试剂成分以及软化液成分的百分比％含量单位均为质量体积比。

实施例1

本实施例示例了一种采用低毒性试剂和温和的处理方法制备得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质的方法，具体包括预脱步骤和脱除步骤：所述预脱步骤包括：将猪角膜密封后置于液氮中冷冻，再将冷冻后的角膜置于水浴中解冻；所述脱除步骤包括：将解冻后的角膜放入脱细胞试剂中进行振荡，再将振荡后的角膜置于等渗液中进行超声，以脱除角膜细胞；所述脱细胞试剂包含0.2-1.0％(w/v)中性蛋白酶和0.01-0.20％(w/v)EDTA；所述等渗液具有不会使角膜胶原纤维结构改变的渗透压参数。

本实施例未记载的试验条件及参数，本领域的技术人员均可选择本领域通常选用的参数进行实施，进而得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。本实施例中，中性蛋白酶的作用是破坏细胞结构，加速细胞的裂解，EDTA的作用是结合金属离子，破坏细胞对ECM的粘附，二者一起使用时，EDTA能够促进中性蛋白酶的脱细胞效果，并且有利于保持角膜胶原纤维基本结构不被破坏。与现有技术相比，本发明使用温和的中性蛋白酶和EDTA作为脱细胞试剂，有利于保持角膜的微观结构；本发明将角膜浸于脱细胞液中振荡处理之后，再在等渗液中进行超声，有效缩短角膜与酶的接触时间，在达到脱掉细胞目的的同时，能够使角膜胶原纤维基本结构得以保持。

实施例2

本实施例示例了一种脱除异种角膜细胞的方法，在实施1的基础上，将角膜密封后置于液氮中60min；取出后先放入20℃水浴中30min，再放入4℃的含有1.0％中性蛋白酶和0.01％EDTA的水溶液中振荡120min，随后置于生理盐水中超声处理8min，超声频率为10kHz；得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

实施例3

本实施例示例了一种脱除异种角膜细胞的方法，在实施1的基础上，将角膜密封后置于液氮中5min；取出后先放入37℃水浴中10min，再放入45℃的含有0.2％中性蛋白酶和0.20％EDTA的水溶液中振荡10min，随后置于PBS缓冲液中超声处理15min，超声频率为100kHz；得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

实施例4

本实施例示例了一种脱除异种角膜细胞的方法，在实施1的基础上，将角膜密封后置于液氮中45min；取出后先放入26℃水浴中19min，再放入25℃的含有0.6％中性蛋白酶和0.10％EDTA的水溶液中振荡100min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理11min，超声频率为60kHz；得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

实施例5

本实施例示例了一种脱除异种角膜细胞的方法，在实施1的基础上，将角膜密封后置于液氮中15min；取出后先放入23℃水浴中15min，交替重复冷冻和解冻5次。再放入14℃的含有0.3％中性蛋白酶和0.12％EDTA的水溶液中振荡110min，随后置于生理盐水中超声处理9min，超声频率为60kHz；重复脱除2次；得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

实施例6

本实施例示例了一种脱除异种角膜细胞的方法，在实施1的基础上，先去除角膜上皮层之后进行削切，以获取厚度为500μm的板层角膜。再将角膜密封后置于液氮中50min；取出后先放入30℃水浴中19min，交替重复冷冻和解冻2次。再放入25℃的含有0.9％中性蛋白酶和0.02％EDTA的水溶液中振荡60min，随后置于PBS缓冲液中超声处理15min，超声频率为90kHz；重复脱除1次；得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

实施例7

本实施例示例了一种脱除异种角膜细胞的方法，在实施1的基础上，先去除角膜上皮层之后进行削切，以获取厚度为200μm的板层角膜。再将角膜密封后置于液氮中5min；取出后先放入27℃水浴中30min，交替重复冷冻和解冻1次。再放入24℃的含有0.2％中性蛋白酶和0.01％EDTA的水溶液中振荡10min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理8min，超声频率为12kHz；重复脱除8次；最后将脱细胞后的角膜放入含有5％聚乙烯比咯烷酮的2℃的软化液中静置。得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

实施例8

本实施例示例了一种脱除异种角膜细胞的方法，在实施1的基础上，先去除角膜上皮层之后进行削切，以获取厚度为350μm的板层角膜。再将角膜密封后置于液氮中45min，取出后先放入20℃水浴中30min。再放入20℃的含有0.4％中性蛋白酶和0.01％EDTA的水溶液中振荡10min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理15min，超声频率为10kHz；重复脱除3次；最后将脱细胞后的角膜放入含有0.1％聚乙烯比咯烷酮的37℃的软化液中静置。得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

实施例9

本实施例示例了一种脱除异种角膜细胞的方法，在实施1的基础上，先去除角膜上皮层之后进行削切，以获取厚度为250μm的板层角膜。再将角膜密封后置于液氮中10min，取出后先放入24℃水浴中20min，此处交替重复冷冻和解冻5次。再放入24℃的含有0.4％中性蛋白酶和0.3％EDTA的水溶液中振荡30min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理6min，超声频率为40kHz；重复脱除1次；最后先将脱细胞后的角膜放入含有最后将脱细胞后的角膜放入含有3％聚乙烯比咯烷酮、0.1％透明质酸、4％L-天冬氨酸的27℃的软化液中静置，再放入水中振荡处理10min。得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

实施例10

本实施例示例了一种脱除异种角膜细胞的方法，在实施1的基础上，先去除角膜上皮层之后进行削切，以获取厚度为350μm的板层角膜。再将角膜密封后置于液氮中45min，取出后先放入37℃水浴中10min，此处交替重复冷冻和解冻1次。再放入24℃的含有1.0％中性蛋白酶和0.2％EDTA的水溶液中振荡20min，随后置于任意比例的生理盐水和PBS缓冲液中超声处理15min，超声频率为12kHz。最后将脱细胞后的角膜放入含有2％聚乙烯比咯烷酮、3％透明质酸、0.1％L-天冬氨酸的37℃的软化液中静置。得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

上述实施例1-10未记载的试验条件及参数，本领域的技术人员可在不付出创造性劳动的情况下选择本领域通常选用的参数进行试验，得到角膜细胞脱除彻底，且微观胶原结构接近于人体角膜的脱细胞角膜基质。

实施例11

分别取实施例9和实施例10制备的脱细胞角膜基质，按以下步骤进行扫描电镜观察：

(1)2.5％戊二醛4℃固定4h；

(2)PBS缓冲液浸泡清洗10min/次×2次；

(3)DMSO冷冻切割：

①将角膜依次浸泡于预冷的12.5％、25％、50％DMSO中各30min，中间换液一次；

②向割断装置内注满液氮，待割断台充分预冷后，用吸管将50％DMSO滴在台上呈直径约6-8mm圆柱状，并迅速将角膜放入DMSO液珠中，DMSO迅速冷却固化，角膜则被包埋其中。用木锤叩击刀片，将液珠内角膜割断，而后用冷却的镊子把断开的角膜包埋块放入50％DMSO中，经10-15min，周围固化的DMSO即被融化；

③将角膜样品用PBS缓冲液浸洗10min/次×6次；

④置于0.1％锇酸内常温放置4h，并在4℃冰箱过夜；

⑤双蒸水清洗样品20min/次×3次。

(4)脱水：

①30％、50％、70％、90％、100％无水乙醇进行梯度脱水，其中100％无水乙醇2次，15min/次；

②50％无水乙醇与50％乙酸异戊酯混合浸泡15min；

③100％乙酸异戊酯浸泡15min/次×2次。

(5)临界点干燥4h(温度>35℃，压力>75大气压)；

(6)取出角膜，将角膜纵断面、上皮面和内皮面分别向上粘导电胶条，镀以金膜，在扫描电镜下观察并拍照。

扫描电镜照片见附图1，其中照片1为实施9制备的脱细胞角膜基质，照片2为实施10制备的脱细胞角膜基质。

在1000倍下扫描电镜照片结果显示：实施例9和实施例10制备得到的脱细胞角膜基质，角膜胶原纤维排列规则、均匀，胶原纤维束构成片状，层层紧密相叠，板层与板层之间平行，可以看出角膜中的细胞脱除干净，并且这些性状保证了角膜的透明性、曲率以及应用于临床移植的可行性，保障患者术后视力恢复。

以上所述仅为本发明具体实施方式中较佳实施例，并非对本发明保护的技术方案的限定，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术方案范围内，对本发明的技术方案的发明构思进行等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。