阅读说明：本技术 氨基酸发酵菌体的酶解工艺 (Enzymolysis process of amino acid fermentation thallus ) 是由 赵兰坤 时夫龙 王伟涛 张婷婷 于 2019-12-13 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,公开了氨基酸发酵菌体的酶解工艺,包括如下步骤：步骤1)分离菌体,步骤2)高压匀浆,步骤3)离心,步骤4)超声处理,步骤5)酶解,步骤6)蒸发浓缩。本发明不采用酸或碱水解的方式,减少了环境污染的压力,避免了对设备的腐蚀,而且仅仅通过酶解的方式,条件比较温和,不会对营养物质造成破坏,而且酶解产物成分较为稳定,质量可控,利于规模化发酵体系的质量控制。(The invention belongs to the technical field of biology, and discloses an enzymolysis process of amino acid fermentation thalli, which comprises the following steps: step 1) separating thalli, step 2) high-pressure homogenizing, step 3) centrifuging, step 4) ultrasonic processing, step 5) enzymolysis, and step 6) evaporating and concentrating. The method does not adopt an acid or alkali hydrolysis mode, reduces the pressure of environmental pollution, avoids corrosion to equipment, is mild in condition and free from damage to nutrient substances only by an enzymolysis mode, has stable components of enzymolysis products and controllable quality, and is beneficial to quality control of a large-scale fermentation system.)

氨基酸发酵菌体的酶解工艺

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及氨基酸发酵菌体的酶解工艺。

背景技术

氨基酸生物发酵中的发酵主体是微生物，谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸等是产量较大的氨基酸类型，氨基酸发酵过程中会产生大量的微生物菌体。以谷氨酸发酵为例，每生产1吨谷氨酸可从发酵液中提取干菌体200kg左右，其菌体蛋白质含量为70％左右，因此，仅仅是谷氨酸一种氨基酸，每年就可以产生大量的废弃菌体。

阜丰集团是全球生产谷氨酸、苏氨酸、赖氨酸、色氨酸以及亮氨酸等氨基酸及衍生产品的龙头企业，是全球第一大味精生产企业、全球第一大黄原胶生产企业、中国生物发酵行业的航母。阜丰集团每年发酵产生的废弃菌体在几十万吨以上，并且每年以10%以上的速度增长，如何处理菌体蛋白，提高附加值，是近年来研究的重点。

谷氨酸菌体是一种单细胞蛋白，含有丰富的蛋白质和其他营养物质。目前我国味精厂的发酵废液中含有大量的谷氨酸菌体，许多工厂将其直接排放，既造成严重的环境污染又浪费了大量的蛋白质。许多国外的味精厂则是将谷氨酸菌体回收作为饲料蛋白。在我国，这方面的消费目前不是很多，但随着人们生活水平的提高，蛋白质水解物将会有广阔的市场。目前对谷氨酸菌体蛋白进行水解的方法主要有化学法和酶法。化学方法虽然简单，但反应要求条件高，污染严重，因而很受限制，而且有机酸或者碱类会破坏氨基酸本身的结构以及维生素等组分，造成营养价值下降。酶法水解是利用蛋白酶水解蛋白质，反应条件温和，能耗低，副反应少，应用较为广泛。试验利用复合蛋白酶法水解谷氨酸菌体蛋白，可以提高酶解效率，获得复合氨基酸水解液，但是不同酶的最佳反应条件不同，很难进行有效地配伍。

关于酶法水解菌体蛋白，现有技术中已经有较多的报道，如“谷氨酸茵体蛋白的酶解条件优化，周大伟等，中国酿造”采用响应面法对谷氨酸菌体蛋白的酶解条件进行优化，以蛋白水解度为参考指标，确定最佳酶解工艺为酸性蛋白酶与β－葡聚糖酶的添加比例为3：l，总加酶量为2％(相对于底物)，pH值为4.0，水解温度50℃，底物浓度15％，水解时间l0h，在上述条件下，蛋白水解度达到18％左右；“红曲霉菌体蛋白复合酶解的研究，邓毛程等，中国酿造” 采用中性蛋白酶和碱性蛋白酶对红曲霉菌体进行复合酶解，通过试验，确定了适宜的复合酶解条件，在最佳条件下，复合酶解的水解度达到10.60％。上述文献对最佳酶解工艺进行了优化，但是蛋白水解度仍然较低，氨基酸含量较低，利用价值不高。“谷氨酸发酵废菌体的水解与替代酵母膏生产多聚谷氨酸，刘旭等，环境工程学报”，为研究谷氨酸发酵废菌体水解液用作培养基氮源的可行性，以蛋白质水解度和溶解度为衡量指标,采用化学、生物、物理以及这几种方法的联合处理,通过正交优化实验,得出了菌体蛋白水解的最佳工艺条件为化学-生物联合处理,在盐酸浓度3mol/L、温度110℃、料液比1∶0.5、水解12h后使用酸性蛋白酶酶解,调节料液pH为4、酶底比2.5％、温度55℃、酶解8h,水解完成后蛋白质水解度达到47.18％，在总氮相等的情况下,将水解液和酵母膏以不同的比例组合,替代正常发酵产γ-聚谷氨酸过程的氮源，结果表明谷氨酸发酵废菌体经过最佳工艺水解后，其水解液可以用作发酵产γ-聚谷氨酸的氮源，可见，采用酸解和酶解相结合的方式，可以提高水解度，但是酸解对设备要求较高，污染较重，会破坏部分氨基酸的活性，而且部分酸残留于水解产物中，对微生物增殖有一定的影响，不利于规模化发酵体系的质量控制。

酶解菌体得到的复合氨基酸组分齐全，此外还含有丰富的维生素等，非常适合作为氨基酸发酵培养基的组分进行使用，能够替代价格昂贵的酵母膏以及维生素等组分，降低了发酵成本；但是如何获得高营养价值的酶解菌体产物，并且质量可控，维持发酵效率的稳定性，是我们需要解决的技术问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明提供了氨基酸发酵菌体的酶解工艺，该工艺操作简单，不采用酸或碱水解的方式，减少了污染，避免了对设备的腐蚀，而且仅仅通过酶解的方式，条件比较温和，不会对营养物质造成破坏，而且酶解产物成分较为稳定，质量可控，利于规模化发酵体系的质量控制。

本发明是通过如下方案来实现的：

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：步骤1）分离菌体，步骤2）高压匀浆，步骤3）离心，步骤4）超声处理，步骤5）酶解，步骤6）蒸发浓缩。

根据权利要求1所述的酶解工艺，其特征在于，所述酶解工艺包括如下步骤：

步骤1）分离菌体：将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，收集菌体沉淀；

步骤2）高压匀浆：往菌体沉淀中添加磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为100-300g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理；

步骤3）离心：停止匀浆处理，1000rpm离心3-5min，收集上层液体和沉淀物；

步骤4）超声处理：往沉淀物中添加5-10倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用超声波进行处理，处理时间为20-30min；

步骤5）酶解：调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，酶解时间为6-9h；

步骤6）蒸发浓缩：然后升温至90-100℃，灭酶3-5min，再与步骤3）所得上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为60-70％的浸膏。

根据权利要求2所述的酶解工艺，其特征在于，所述碟片离心机的转速为4000-5000rpm，离心时间为3-5min。

根据权利要求2所述的酶解工艺，其特征在于，所述磷酸二氢钾水溶液的浓度为5-10g/L。

根据权利要求2所述的酶解工艺，其特征在于，所述匀浆处理参数为：匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次。

根据权利要求2所述的酶解工艺，其特征在于，所述超声波的频率为20kHz。

根据权利要求2所述的酶解工艺，其特征在于，所述中性蛋白酶的添加量为500u酶活力/g干物质。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明不采用酸或碱水解的方式，减少了污染，避免了对设备的腐蚀，而且仅仅通过酶解的方式，条件比较温和，不会对营养物质造成破坏，而且酶解产物成分较为稳定，质量可控，利于规模化发酵体系的质量控制。

本发明首先采用高压匀浆处理，能够充分破碎细胞壁，释放胞内蛋白，采用磷酸二氢钾水溶液作为缓冲液，能够提高破碎率，并且磷酸二氢钾还可作为发酵培养基的组分，一举两得；

匀浆处理的操作压力对细胞破碎及释放蛋白都至关重要，综合破碎动力学和破碎工艺效果匀浆压力，进行多次试验，选择为90MPa为宜；匀浆前2次细胞破碎率迅速上升，再次匀浆，细胞破碎率并没有明显提升，但是第3次匀浆后，大分子蛋白也会在匀浆作用下裂解成小分子短肽或游离氨基酸，氨基酸态氮的含量有一定量的增加，蛋白水解度增大，继续增加匀浆次数，蛋白水解度并没有明显增加，而且对设备有一定的损害；

匀浆后进行离心，上层液体含有氨基酸态氮水平较高，无需对该部分产物进行酶解处理，从而降低了酶的使用量，降低了成本；沉淀物为细胞碎片和大分子蛋白质，而且细胞壁碎片中仍然含有一定量的蛋白，而且部分蛋白会黏附在细胞壁碎片上，通过对沉淀物进行超声处理，使得细胞碎片上的蛋白和多糖释放出来，多糖被菌株作为营养物质利用，超声处理后，进而采用中性蛋白酶进行酶解处理，酶的使用量和作用时间大幅降低，节约了成本。

本发明制备的膏状物与常规使用的氮源酵母膏（干物质含量为65-70％），氨基酸态氮含量更高，营养成分更加全面，有利于微生物利用。

附图说明

图1：高压匀浆次数对菌体细胞破碎率的影响；

图2：高压匀浆次数对水解度的影响。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为5g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为200g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后往沉淀物中添加10倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为20min，然后调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

实施例2

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为4000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为7g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为250g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心4min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后添加8倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为30min，然后调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为7h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为70％的浸膏。

实施例3

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为10g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为220g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后往沉淀物中添加9倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为20min，然后调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

对比例1

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀干燥，粉碎，然后采用中性蛋白酶水解，添加量为5000u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

对比例2

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；往菌体沉淀中添加浓度为5g/L的磷酸二氢钾水溶液，配置成浓度为200g/L的菌体细胞悬液，采用高压匀浆器对菌体细胞悬浮液进行匀浆处理， 匀浆压力为90Mpa，温度为25℃，匀浆3次；停止匀浆处理，1000rpm离心5min，收集上层液体和沉淀物（细胞壁碎片和大分子蛋白），然后添加10倍重量的纯化水，搅拌均匀，调整温度为45℃，采用中性蛋白酶水解，添加量为500u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，再与上层液体混合，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

对比例3

氨基酸发酵菌体的酶解工艺，包括如下步骤：

将氨基酸发酵液通过碟片分离机进行分离，转速为5000rpm，离心时间为3min，收集菌体沉淀；将菌体沉淀干燥，粉碎，添加10倍重量的纯化水，搅拌均匀，采用20kHz的超声波进行处理，处理时间为20min，然后采用中性蛋白酶水解，添加量为1000u酶活力/g干物质，酶解时间为6h，然后升温至95℃，灭酶3min，最后蒸发浓缩，得到干基重量份数为65％的浸膏。

实施例4

以谷氨酸发酵液为例，发酵使用的微生物为谷氨酸棒杆菌。

总氮的测定：采用凯氏定氮法测定总氮，计为N1；

氨基酸态氮的测定：采用甲醛滴定法测定氨基酸态氮，计为N2。

水解度：（N2/N1）×100％。

高压匀浆次数对菌体细胞破碎率、水解度的影响，设置次数为1,2,3,4次，如图1-2所示，匀浆前2次细胞破碎率迅速上升，再次匀浆，细胞破碎率并没有明显提升，但是第3次匀浆后，氨基酸态氮的含量有一定量的增加，大分子蛋白也会在匀浆作用下裂解成小分子短肽或游离氨基酸，蛋白水解度增大，继续增加匀浆次数，蛋白水解度并没有明显增加，而且匀浆次数过多对设备有一定的损害；因此，选择3次高压匀浆最为合适。

磷酸二氢钾水溶液对菌体细胞破碎率、水解度的影响。对照组：采用纯化水替代磷酸二氢钾水溶液，实验组：实施例1，具体见表1：

表1

组别	细胞破碎率%	水解度%
			实验组	97.8	7.1
对照组	91.3	5.4

采用磷酸二氢钾水溶液作为缓冲液，能够提高破碎率，并且磷酸二氢钾还可作为发酵培养基的组分，不会对后续的产品造成影响，

实施例5

不同因素对水解度的影响。

检测实施例1和对比例1-3的水解度，具体见表2所示。

表2

组别	水解度%
		实施例1	86.7
对比例1	38.6
		对比例2	70.3
对比例3	62.5

如表2所示，与对比例1-3相比较，实施例1的水解度最高，相应的氨基酸态氮的含量也最高，其中，对比例1使用的酶活力较多，达到5000u酶活力/g干物质，是实施例1的10倍，水解度仅为38.6%，对比例2没有对细胞壁碎片和大分子蛋白进行超声波处理，水解度下降了16个百分点，对比例3没有采用高压均浆处理，尽管使用的酶活总量是实施例1的两倍，但是水解度下降明显；可见，合适的高压匀浆和超声波等预处理工艺，能够大幅减少酶的用量，降低成本，并且水解度较高。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。