具体实施方式

本发明提供一种茶叶中农药检测方法及装置，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或无线耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的全部或任一单元和全部组合。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)，具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语，应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样被特定定义，否则不会用理想化或过于正式的含义来解释。

发明人经过研究发现，现有对茶叶中农药残留的检测在便携性以及精确度上存在不足。

为了解决上述问题，在本发明实施例中，制备SERS基底，其中，所述SERS基底包括固化物、银盐以及氢氧化铵；将所述SERS基底涂抹在预设的多孔载体的检测面，直至所述SERS基底固化，得到SERS涂层；对所述SERS涂层进行还原处理，得到包含银纳米颗粒的检测层，并将所述检测层与所述多孔载体作为检测组件；获取待检测的茶叶，并使用预设的提取剂对所述茶叶进行化合物提取，得到待测溶液；使所述待测溶液穿透所述检测组件的检测层，以使所述待测溶液与所述银纳米颗粒接触并反应；用一激光束照射反应后的检测组件，使得该检测组件散射所述激光束，产生散射光；收集所述散射光并根据所述散射光生成所述茶叶的检测拉曼光谱，并基于预设的参考拉曼光谱以及检测拉曼光谱，确定所述茶叶中是否存在目标农药及所述目标农药的含量。

举例说明，本发明实施例可以应用到茶叶生产后质检、在采摘茶叶前对某一片区的茶叶进行抽样检测、周期性对茶叶中的农药残余进行检测等场景中。

需要注意的是，上述应用场景仅是为了便于理解本发明而示出，本发明的实施方式在此方面不受任何限制。相反，本发明的实施方式可以应用于适用的任何场景。

下面结合附图，通过对实施例的描述，对发明内容作进一步说明。

如图1所示，本实施提供了一种茶叶中农药检测方法，所述方法可以包括以下步骤：

S10，制备SERS基底，其中，所述SERS基底包括固化物、银盐以及氢氧化铵。

具体地，在对茶叶中的农药残余进行检测之前，先制备包含银盐溶液的SERS基底。

银盐在后续处理过程中会被还原，形成银纳米颗粒。相较于金纳米颗粒，银纳米颗粒对包含有机磷酸盐和氨基甲酸酯类在内的农药检测活跃更高，且更易被检测，因此选用银纳米颗粒作为SERS检测的金属纳米颗粒。

SERS基底中还包括固化物，固化物是指在一定条件下会固化的化合物，以将后续还原反应生成的银纳米颗粒固定在固化形成的孔洞，以及承载SERS基底的多孔载体的孔洞中。固化物可采用可进行溶胶-凝胶反应的原料，即凝胶原料。凝胶中一般存在多个孔洞，孔洞之间彼此连通，因此凝胶一方面能够固定银纳米颗粒，一方面能够使得需要检测的物质穿透凝胶与银纳米颗粒接触。本实施例中，所需要检测的物质即茶叶提取物。作为固化物的凝胶原料的选择可根据凝胶的稳定性、成本、形成的孔洞大小等诸多因素选择。

纳米颗粒的规模大小也影响着对不同化合物的检测灵敏度。采用最常使用的银盐，AgNO3，产生的纳米颗粒的规模为10～20nm，这一尺寸的纳米颗粒一方面容易从多孔载体以及固化物固化后形成的孔洞中丢失，一方面，更难与农药接触，在785nm即发光的激发下灵敏度也更低。为了形成较大规模的银纳米颗粒，本实施例中对SERS基底的成分进行改进，SERS中还包括氢氧化铵。

氢氧化铵(NH₃OH)的作用是提高银盐中的银离子的稳定性。在溶液中，铵根离子与银离子发生反应，形成配位胺络合物([Ag(NH₃)₂](OH)或即[Ag(NH₃)₂]+)。在配位胺络合物中，银离子是配位形式，因此能维持+1的氧化态电荷。这种共价配位的形式非常稳定，相较于一般的银盐中的银离子，更难被还原，因此还原速度较慢，在形成银纳米颗粒的过程中，纳米颗粒的分形更大。更大分形的纳米颗粒不仅在后续形成的银纳米颗粒更难被释放到玻璃小瓶中，减少由于纳米颗粒的体型小导致的损失，提高检测的灵敏性，还能提高对农药检测的灵敏度。此外，在制备SERS基底过程中，碱性的溶液环境能够启动碱催化的凝胶固化过程。本实施例中，最终形成的银纳米颗粒的规模大小为100～200nm。该规模大小的银纳米颗粒可以被牢牢稳定在孔洞中，还可增加与农药成分接触的概率，且该尺寸的银纳米颗粒在785nm的激发光下体现更高的灵敏度。

在将银盐、氢氧化铵以及固化物进行混合时，加入一定的水作为溶剂。以固化物为四甲氧基硅烷(Tetramethoxysilane，TMOS)为例，将1～2体积的0.1～1.0mol/L的硝酸银，28％NH₃OH(aq)和1体积的TMOS混合1～5分钟，即得到SERS基底。其中，硝酸盐的浓度的最佳浓度为1mol/L。

进一步地，调整固化物的成分以及各个成分的比例，可调整后续形成的孔洞的大小。本实施例以固化物为TMOS以及甲基三甲氧基硅烷(Methyltrimethoxysilane，MTMS)为例进行描述。

图2的检测对象为农药混合物，该农药混合物包括西维因和硫酸硫丹(体积比1：1)，含量为50ppb(50ng/ml)。采用不同配方的SERS基底制成检测组件，并对该农药混合物进行检测。(A)纯TMOS，(B)TMOS与MTMS体积比为5：1，(C)TMOS与MTMS的体积比为1：1。纯TMOS配方显示出对西维因的优先选择性结合，而对硫丹的增强作用非常小。在TMOS配方中加入MTMS后，对硫丹和西维因的增强作用更大。这一结果显示了同时检测混合物中多种农药的能力。1:1的配方在检测混合物中的各种农药方面具有普遍的敏感性。经更多的实验，TMOS与MTMS的体积比从1：1～1：10，或者两者的纯溶液都可以作为固化物，而两者混合时浓度超过这一比例，SERS基底很难在多孔载体上附着。其中，拉曼光谱中的虚线是XY光标，用于指引感兴趣的峰；横坐标为拉曼位移(Raman shift)，单位是cm^-1，纵坐标为相对光强度(Relative Intensity)。后文中附图中无另外标注的，横纵坐标的定义与图2一致。

进一步地，本实施例所选用的固化物包括硅酸乙酯(Tetraethyl Orthosilicate，TEOS)以及甲基三乙氧基硅烷(Methyltriethoxysilane，MTES)。

在溶胶-凝胶反应中，反应速度、程度以及反应机制都受到多种因素的影响，例如溶胶中的烷基配体的大小、酸碱值、溶剂的类型以及溶剂的浓度、温度、压力、化学结构以及过渡态的性质。每一个因素都会影响到最终形成的凝胶的特性以及适用性。例如，对于反应速度过快的固化物，无法均匀地附着在多孔载体的表面。

在酸性环境下，水解后的产物为链状的凝胶，而在碱性环境下，包含TEOS水解后的产物是三维网络结构的凝胶，更易于束缚银纳米颗粒。

此外，TEOS的毒性更小，在溶胶-凝胶反应中，TEOS形成的乙醇，而很多凝胶原料，形成的是有毒物质，例如TMOS水解后形成的是有毒的甲醇。

固化物中的MTES能够帮助TEOS的溶胶-凝胶反应，MTES能够与TEOS兼容，且使得SERS基底的极性更小，更加疏水。而且MTES在溶胶-凝胶反应中形成的长链使得其极性比常用的MTMS更低，使得SERS基底具有更高的极性，有助于从溶液中提取农药。此外，MTES在溶胶-凝胶反应中的产物为乙醇，毒性更小。

进一步地，本实施例中的多孔载体为玻璃制品，SERS基底中还包括硅烷偶联剂。硅烷偶联剂能够改善玻璃纤维和树脂的粘合性能，将其添加至SERS基底中，SERS基底后续在玻璃小瓶表面形成涂层时，能够增加该涂层与玻璃小瓶之间的粘附性。本实施例中选用的硅烷偶联剂为3-氨丙基三乙氧基硅烷(3-aminopropyltriethoxysilane，APTES)。APTES有一个垂悬的铵根(-NH₂)基团，在铵根基团中氮以带有一个孤对电子的形式存在。而银是阳性，因此能够与铵根基团相互作用，更为稳定。因此加入APTES还有助于后续还原过程中将银固定在涂层中，进一步减少银的流失。相较于银而言，金为阴性，因此若SERS基底使用的金属盐中的金属为金，则使用硅烷偶联剂的孤对电子无法明显地稳定金纳米颗粒。本实施例中，TEOS以及MTES作为一个整体，与APTES的体积比为10：1。

在对茶叶进行成分提取时，常常使用有机溶剂作为提取剂，而TEOS、MTES以及APTES这一组合与有机溶剂的兼容性较强，尤其是对乙醇的兼容性，因此，在采用有机溶剂，例如乙醇，作为提取剂时，化合物提取后的待测溶液更容易进入由本实施例所提供的SERS基底形成的涂层中。

进一步地，SERS基底中还包括阳离子表面活性剂，阳离子表面活性剂在本实施例中的作用是有机模板剂，阳离子表面活性剂在溶胶-凝胶反应中，通过有机物和无机物之间的界面作用组装生成多孔凝胶，使得了最终形成的涂层中的孔径大小可调节。

本实施例选用的阳离子表面活性剂为十六烷基三甲基氯化铵(Cetyltrimethylammonium chloride，CTAC)。CTAC的体积比与APTES的体积比为1：1，或者TEOS以及MTES作为一个整体与CTAC的体积比为10：1，即TEOS/MTES＝10：1。在本实施例的SERS基底中，CTAC的终浓度为10^(-4)M。

CTAC的作用包括：

1)促进银纳米颗粒的形成，为SERS提供更多可使用的金属纳米颗粒。在包含CTAC的涂层中，银纳米颗粒更容易被束缚。因此检测时，能够提高检测的灵敏性。

2)CTAC有助于预浓缩更多的疏水性化合物，农药大多数都是疏水性化合物。当包含农药的待测溶液进入到涂层中时，CTAC的头部氨基，会与银纳米颗粒相互作用，而起疏水尾部会与待测溶液中的农药分子相互作用，使得他们更容易集中在银纳米颗粒的表面，提高检测的灵敏度。现有的电解质，例如氯化锂、氯化钠、硝酸盐、硫酸盐或柠檬酸盐，常常作为银或金胶体溶液的聚集剂。但是这些聚集剂会在金属纳米颗粒上形成亲水表面，而疏水性化合物，例如农药，会更难与金属纳米颗粒进行接触，因此检测的灵敏性更低。

S20，将所述SERS基底涂抹在预设的多孔载体的检测面，直至所述SERS基底固化，得到SERS涂层。

具体地，制备得到SERS基底后，将其涂抹在预先准备好的多孔载体的检测面，检测面即后续与待检溶液，直接接触，用于进行待测溶液检测的那一面。然后将多孔载体在一定温度下密封一段时间，以使得SERS基底在多孔载体表面固化或者凝胶化后固化，得到SERS涂层。

多孔载体的材质可包括陶瓷、玻璃等。多孔载体的形状包括瓶状、片状、试管状等。多孔载体的材质以及形状可根据用户的需求进行调整。

为便于说明，本实施例采用的多孔载体为玻璃小瓶，检测面主要为玻璃小瓶的内壁。由于本实施例是基于SERS进行的，所以为了保证散射光能够被有效地检测，玻璃小瓶为无色透明。

由于SERS基底在多孔载体上固化的均一度直接影响后续样品与金属纳米颗粒的接触，因此在本实施例中，将SERS基底加入到玻璃小瓶后，将玻璃小瓶在200-25000rpm的辊或摇床上进行旋转，速度越慢，最终形成的薄涂层越均匀。这种方式还能够节约SERS基底，本实施例采用的玻璃小瓶的体积为1-5mL，一个玻璃小瓶仅需要50-500ml即可实现对玻璃小瓶内壁的覆盖。此外，本实施例采用的固化温度为20-25摄氏度，时间可根据固化的情况进行调整。

进一步地，由于玻璃小瓶的主要化学成分是硅和氧，在得到SERS涂层后，为了增强涂层与玻璃小瓶的表面的结合，可以预先对玻璃小瓶进行预处理。

本实施例的第一种预处理方式为以无水乙醇、饱和氢氧化钾、水洗的顺序预先对玻璃小瓶的检测面进行预处理，从而羟基化玻璃小瓶的表面，使得SERS基底通过玻璃小瓶表面的-Si-O-H键更有效地结合。

由于硅烷偶联剂也可实现对玻璃小瓶的检测面进行表面修饰。本实施例的第二种预处理方式是将硅烷偶联剂，例如溶解于无水乙醇的1％APTES，预先处理玻璃小瓶的检测面，并持续较长时间，一般推荐24小时，然后将无水乙醇和1％APTES丢弃，并清洗玻璃小瓶。

S30，对所述SERS涂层进行还原处理，得到包含银纳米颗粒的检测层，并将所述检测层与所述多孔载体作为检测组件。

形成SERS涂层后，银仍然以银离子的形式存在于SERS涂层内，为得到银纳米颗粒，采用强还原剂对SERS涂层进行还原处理，本实施例采用的强还原剂为硼氢化钠，体积为1～5ml，浓度为0.01～0.03mol/L。除硼氢化钠外，其他可实现将银离子还原为银纳米颗粒的物质就可作为本实施例采用的强还原剂，例如硼氢化钾等硼氢化物。

将预先配置好的硼氢化钠溶液与多孔载体的检测面进行接触。例如当多孔载体为玻璃小瓶时，将硼氢化钠倒入玻璃小瓶中。此时，硼氢化钠应当与SERS涂层完全接触，例如对于片状的多孔载体，硼氢化钠应当完全覆盖SERS涂层；多孔载体为玻璃小瓶时，硼氢化钠的体积应当与玻璃小瓶的体积相当或者足以完全填充玻璃小瓶的内壁。

在进行还原处理后，应当对多孔载体进行多次清洗，避免残留的强还原剂影响被还原的银颗粒聚集，从而影响最终形成的银纳米颗粒的粒径。

在被强还原剂还原后，银离子转换为金属银，并相互聚集，形成若干个银纳米颗粒，这些银纳米颗粒由于其体型，会被约束在多孔载体中的孔洞中，以及检测层的孔洞中。将包含有银纳米颗粒的SERS涂层作为检测层，得到包含金属纳米颗粒的检测组件。

进一步地，为了避免硼氢化钠残留，在采用硼氢化钠还原后，先用水冲洗掉多余的硼氢化钠2次，然后用70％的稀硝酸进行中和，最后用稀盐酸进行洗涤，得到含有银纳米颗粒的SERS凝胶。

S40、获取待检测的茶叶，并使用预设的提取剂对所述茶叶进行化合物提取，得到待测溶液。

具体地，茶叶本身是固体，因此需要先对茶叶进行成分的提取，将茶叶的残留物溶解在溶液中，得到待测溶液。茶叶的化合物提取可采用化学法、煮沸法、波幅照提取法等。但上述方案对提取条件具有一定的要求，本实施例中提取采用的是提取剂提取，更为简单且快速。在本实施例的第一种实施方式中，提取剂为乙醇和水，乙醇与水的体积比为1：1。在环境温度(4～40摄氏度)下进行化合物提取。

某些农药，例如西维因，在乙醇中的溶解度和稳定性大于在水中。而大多数农药都有一定的疏水性，水可以促进农药的水解以及降解。然而，即便这些农药对乙醇的溶解度更高，相对而言，在乙醇中也仅仅是微溶，大多数农药在乙腈(Methyl Cyanide，MeCN)中有较高的溶解度，例如双对氯苯基三氯乙烷(Dichlorodiphenyltrichloroethane，DDT)。在本实施例的第二种实施方式中，提取剂为乙醇、水以及MeCN，其中，乙醇，水以及MeCN的体积比为1：1：1，在环境温度(4～40摄氏度)下进行化合物提取。

虽然农药在MeCN中具有较高的溶解度，但是茶叶中的其他化合物，例如咖啡因，在MeCN中也具有较高的溶解度。因此，针对所要检测的农药的成分的不同，可对乙醇、水以及MeCN的体积比进行调整，以减少不需要检测的化合物的含量。

虽然还有其他的提取剂可以化合物提取茶叶中的农药成分，但是很多有机溶剂会破坏SERS检测层的活性，以及检测层脱落，影响检测效率，而EtOH以及MeCN不会影响本实施例的检测层，因此作为最佳的提取剂成分。

S50、使所述待测溶液穿透所述检测组件的检测层，以使所述待测溶液与所述银纳米颗粒接触。

最后将所述处理液添加至检测组件的检测面，并使所述处理液穿透所述检测组件中的检测层，以使所述待测溶液与所述金属纳米颗粒接触。

而使待测溶液穿透检测组件的检测层可通过重力、摇晃产生的外力等方式实现。例如片状的多孔载体，将混合水的待测溶液滴加在检测层的表面，由于重力的作用，待测溶液会渗透检测层并与银纳米颗粒接触。例如多孔载体为玻璃小瓶时，将待测溶液加入到玻璃小瓶中，然后摇晃一段时间，以使得待测溶液被动穿过检测层，与银纳米颗粒接触。本实施例优选采用的玻璃小瓶作为多孔载体，摇晃时间为1～5分钟。由于低温环境下待测溶液会凝固，而过高的温度会影响检测层成分的稳定性，因此反应温度推荐为4～40摄氏度，在一般的常温下即可完成反应。

S60、用一激光束照射反应后的检测组件，使得该检测组件散射所述激光束，产生散射光。

具体地，然后发射一束激光束至待测溶液与银纳米颗粒充分接触的检测组件，检测组件中的物质会产生拉曼散射。

S70、收集所述散射光并根据所述散射光生成所述茶叶的检测拉曼光谱，并基于预设的参考拉曼光谱以及检测拉曼光谱，确定所述茶叶中是否存在目标农药及所述目标农药的含量。

将拉曼散射收集，并通过检测器将散射光的光子能量转换为电信号强度，生成该待测溶液对应的检测拉曼光谱。由于SERS基底包含有银纳米颗粒，与普通的拉曼散射相比，银纳米颗粒表面上的分子的拉曼散射信号与常规的拉曼信号相比更强。

由于不同物质在拉曼光谱上具有特异性的形状，因此其在拉曼光谱上的形状可作为该物质的“指纹”，基于预先保存的待检测的农药的“指纹”，可对待测溶液的物质成分进行定性检测。同时，若预先根据已知浓度制备该农药的拉曼光谱，这可制备该农药的标准量的拉曼光谱，从而实现定量测量。本实施预先保存待测农药的参考拉曼光谱，该光谱中不仅包含有该农药的“指纹”，还包含不同浓度的农药含量对应的光强度，以实现对农药的定性以及定量检测。

本实施例中预先准备多种农药的SERS光谱，如氨基甲酸酯类(例如西维因)、有机氯类(例如硫丹)、有机磷类(例如邻氨基甲酸酯、二甲氨基甲酸酯或毒死蜱)以及DDT。图3与图4列出了常见的农药的SERS光谱，包括西维因(Carbaryl)、硫丹(Endosulfan)、乐果(Dimethoate)、地虫磷(Fonofos)、马拉硫磷(Methyl Parathion)以及DDT。

图5的检测农药为氨基甲酸酯类农药克百威，采用激光照射后样品后收集到的散射光形成的检测光谱。曲线A的样品是从红茶中提取待测溶液进行反应后的本实施例提供的检测组件，曲线B是一定浓度的克百威溶液，曲线C是在泡有红茶的水溶液。三者都是在150mW，785nm的即发光下照射两秒，5次(总共10秒)。其中，检测组件的SERS基底中固化物为TMOS。

图6的检测农药为有机磷农药O-甲酸酯，采用激光照射后样品后收集到的散射光形成的检测光谱。曲线A样品是从红茶中提取待测溶液进行反应后的本实施例提供的检测组件，其中，提取时间为5分钟。曲线B是包含一定浓度的O-甲酸酯溶液。曲线C是并未提取的红茶水溶液。三者都是在150mW，785nm的即发光下照射两秒，5次(总共10秒)。

在绿茶、黑茶等其他种类的茶中，所得到的检测结果都类似在红茶中的检测结果。

如图7所示，(A)氨基甲酸酯类农药西维因(Carbaryl)、(B)有机氯类农药硫丹和(C)有机磷类农药二甲酸酯(dimethoat)分别在纯TMOS配方的SERS基底制成的检测组件得到的拉曼光谱。

由于农药的特异性不同，在实际养殖过程中，养殖人员一般是多种农药联合使用，因此当存在多种农药混合时本实施例提供的检测组件是否能够有效地检测出农药的成分以及含量是值得验证的。

如图8所示，采用本实施例中的检测组件针对低浓度的农药(D)西维因，(E)西维因以及硫丹硫酸酯的混合物(体积比为1：1)，(F)为西维因以及硫丹硫酸酯以及O-甲酸酯的混合物(体积比为1：1：1)进行检测。每种成分的含量为50ppb。因此，本实施例采用的检测组件可同时对多种农药进行检测，且即便浓度很低也能实现精确的检测。

基于上述茶叶中农药的检测方法，本实施例提供了一种茶叶中农药的检测装置，其中，所述茶叶中农药的检测装置包括如前文所述的检测组件以及拉曼光谱分析仪。

拉曼光谱分析仪包括发射组件、接收组件和分析组件。发射组件可对检测组件发射激光束，以使检测组件对激光束散射，生成散射光，也就是拉曼光。接收组件用于采集拉曼光，并将拉曼光的光子能量转换为电信号强度，生成与检测组件中的检测目标对应的检测拉曼光谱。最后分析组件根据想要检测的农药的参考拉曼光谱，确定检测拉曼光谱中是否存在该农药以及农药的含量。

在本实施例中，拉曼光谱分析仪可采用市面上常规的拉曼光谱分析仪，只要在针对这些拉曼光谱分析仪针对性地设计多孔载体，并采用上述的制备检测组件的方式即可得到本实施例提供的检测装置。由于制备检测组件的方式在前文已描述，故在此不再赘述。