阅读说明：本技术 一种基于内过滤效应的比率探针及其构建方法和应用 (Ratiometric probe based on internal filtering effect and construction method and application thereof ) 是由 汪晶 邱昱 李大权 温丝雨 胡军 于 2019-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及荧光检测技术领域,尤其涉及一种基于内过滤效应的比率探针及其构建方法和应用。所述比率探针包括n种发光碳点和m种吸光能量受体；所述n种发光碳点依次为A<Sub>1</Sub>发光碳点……A<Sub>n</Sub>发光碳点,且n≥1；所述n种发光碳点的形成x种不重合的荧光发射峰,x≥2,且发光碳点具有氰反应惰性；所述m种吸光能量受体依次为B<Sub>1</Sub>吸光能量受体……B<Sub>m</Sub>吸光能量受体,且m≥1；所述m种吸光能量受体形成y种荧光吸收峰,y种荧光吸收峰与v种荧光发射峰存在重合,且1≤v≤(x-1)；所述吸光能量受体具有氰反应活性。本发明比率探针通过多化学信号检测的方式提高了检测精度和灵敏度,并且具有低毒甚至无毒、检测范围大、构建简便高效等优点。(The invention relates to the technical field of fluorescence detection, in particular to a ratiometric probe based on an internal filtering effect and a construction method and application thereof. The ratiometric probe comprises n luminescent carbon dots and m light absorption energy receptors; the n kinds of luminescent carbon dots are A in sequence 1 Luminescent carbon dot … … A n Luminescent carbon dots, and n is more than or equal to 1; the n luminescent carbon points form x non-coincident fluorescence emission peaks, x is more than or equal to 2, and the luminescent carbon points have cyanogen reaction inertia; the m light absorption energy receptors are sequentially B 1 Light absorbing energy acceptor … … B m A light absorbing energy receptor, and m is more than or equal to 1; the m light absorption energy receptors form y fluorescence absorption peaks, the y fluorescence absorption peaks and the v fluorescence emission peaks are overlapped, and v is more than or equal to 1 and less than or equal to (x-1); the light absorbing energy acceptor is cyanogen reactive. The ratiometric probe improves the detection precision and sensitivity by a multi-chemical signal detection mode, and has the advantages of low toxicity, no toxicity, large detection range, simple and convenient construction, high efficiency and the like.)

一种基于内过滤效应的比率探针及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及荧光检测技术领域，尤其涉及一种基于内过滤效应的比率探针及其构建方法和应用。

背景技术

氰离子是一种致命的有毒阴离子，除了植物的生物过程产生，氰化物在工业上的应用也增加了水源被污染的风险。环境中的氰离子进入人体，能强烈抑制细胞色素c氧化酶的催化活性，造成呼吸和神经系统的紊乱甚至死亡。因此，我们迫切需要发展一种有效可行的方法检测环境中的氰离子。检测氰离子的方法有滴定法、光电化学法、液相色谱-质谱法和离子色谱法，样品前处理复杂，测试时间长。

荧光分析法来检测离子具有响应迅速，灵敏度高，成本低等优点，常用于快速实时检测。目前检测氰离子的荧光探针大多数是单一化学信号检测，易受激发光强度、探针浓度和仪器因素等变化影响结果准确性。近年来发展的具有自校准功能的比率检测方法，能提高检测灵敏度，又能通过色相的差异实现可视化识别分析物。有机染料、重金属量子点和碳点常作为荧光团构建探针，与前两者相比，碳点的毒性低、水溶性好、配体修饰基团可控、光稳定性强。银纳米颗粒具有易于化学修饰、消光系数高、尺寸依赖的光学特性变化的特点，能作为能量受体猝灭供体荧光。通过荧光团和猝灭剂的组合设计荧光探针是解决单个组分弱点和优化探针性能的最有吸引力的策略。

如中国专利局于2012年8月8日公开的一种检测氰根离子的纳米银荧光探针及其制备方法的发明专利申请，申请公开号为CN102627966A，其以寡聚核苷酸作为模板，在还原剂硼氢化钠的作用下反应制备得到序列为5'-AAAAAAAACCCCCCCCCTTTTTTTT-3'的纳米银荧光探针，其制备周期较长，且抗毒性(即抗杂质离子干扰能力)有限，并且仅能够进行定性检测，无法进行定量检测。

又如中国专利局于2013年6月5日公开的一种比率型氰离子荧光探针分子的应用方法的发明专利申请，申请公开号为CN103134787A，其通过利用1，2，2，3-四甲基-4，5-苯并吲哚琳对氰离子进行检测，主要是通过荧光发射峰的偏移或重构，改变荧光颜色来进行定性检测，难以有效用于定量检测，且其化学信号单一，易受激发光强度影响。

发明内容

为解决现有用于氰离子检测的荧光探针存在化学信号单一、易受外界环境干扰，且现有荧光探针的抗毒性较弱，在待测液中存在杂质离子时非常容易受到干扰，部分荧光探针甚至会受到氯离子干扰，导致其使用条件严苛、难以广泛推广适用等问题，本发明提供了一种基于内过滤效应的比率探针及其构建方法和应用。其目的在于：一、实现多化学信号检测，提高检测精度；二、提高比率探针的抗毒性，减少杂质离子对其产生的干扰，使其具有更高的稳定性，进而具有广泛的普适性以及更高的使用方便性；三、降低比率探针毒性，并提高比率探针的水溶性，更有利于实际样品的检测应用；四、采用荧光团与猝灭剂的组合实现内过滤，扩大比率探针的检测范围；五、简化比率探针的构建方法，提高制备效率；六、可快速实现氰离子的定性检测和定量检测。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

一种基于内过滤效应的比率探针，

所述比率探针包括n种发光碳点和m种吸光能量受体；

所述n种发光碳点依次为A₁发光碳点……A_n发光碳点，且n≥1；

所述n种发光碳点的形成x种不重合的荧光发射峰，x≥2，且发光碳点具有氰反应惰性；

所述m种吸光能量受体依次为B₁吸光能量受体……B_m吸光能量受体，且m≥1；

所述m种吸光能量受体形成y种荧光吸收峰，y种荧光吸收峰与v种荧光发射峰存在重合，且1≤v≤(x-1)；

所述吸光能量受体具有氰反应活性。

其中发光碳点(即荧光碳点)作为荧光团，吸光能量受体作为猝灭剂，两者组合实现内过滤，产生内过滤效应。并且其中y种荧光吸收峰与v中荧光发射峰存在部分或完全重合，其中重合的概念为峰面积的明显重叠，当光谱产生重合后，所发射的荧光会被吸光能量受体所吸收，进而降低荧光强度，设定发光碳点中不与荧光吸收峰重合的荧光发射峰总强度为I_A，发光碳点中与荧光吸收峰重合的荧光发射峰总强度为I_B，则在加入猝灭剂(吸收能量受体)并受其作用前荧光强度比值(I_B/I_A)₀＝a₀，在加入猝灭剂(吸收能量受体)并受其作用后荧光强度比值(I_B/I_A)₁＝a₁，a₁＜a₀。因此在实际使用过程中，基于内过滤效应的比率探针的实际荧光强度比值为a₁，而在用于检测待测液氰离子时，氰离子能够对具有氰反应活性的吸光能量受体进行刻蚀，而发光碳点具有氰反应惰性，不与氰离子发生反应，所以在导致其吸光能力下降同时保持发光碳点的荧光发射能力，使得a₁逐渐趋向a₀，荧光强度比值的变化可通过仪器进行快速检测，实现高效的定性分析，并且该过程中待测液氰离子浓度与荧光强度比值之间存在一定的公式关联性，通过绘制标准曲线能够导出相应的关联公式，进而能够实现快速且准确的定量检测。

作为优选，

所述比率探针由两种发光碳点和一种吸光能量受体组成；

所述发光碳点分别为A₁发光碳点和A₂发光碳点，其中A₁发光碳点为柠檬酸碳点、A₂发光碳点为对苯二胺碳点；

所述吸光能量受体为B₁吸光能量受体，B₁吸光能量受体为银纳米颗粒。

柠檬酸碳点和对苯二胺碳点形成的两个不同的荧光发射峰，再配合纳米银颗粒作为吸光能量受体，纳米银颗粒主要吸收柠檬酸碳点所发射的光，其荧光吸收峰大面积与柠檬酸碳点的荧光发射峰重叠、与对苯二胺碳点的荧光发射峰不重合，能够产生良好的内过滤效果。

作为优选，

所述柠檬酸碳点作为蓝色荧光碳点发射蓝色荧光，形成蓝色荧光发射峰，蓝色荧光发射峰的峰顶波长为425～435nm；

所述对苯二胺碳点作为红色荧光碳点发射红色荧光，形成红色荧光发射峰，红色荧光发射峰的峰顶波长583～602nm；

所述银纳米颗粒形成荧光吸收峰，荧光吸收峰的峰顶波长为385～420nm；

所述蓝色荧光初始强度与红色荧光的初始荧光强度比值为(31～40)：1。

上述蓝色荧光初始强度与红色荧光的初始荧光强度比值为前述(I_B/I_A)₀＝a₀。柠檬酸碳点的荧光发射峰与荧光吸收峰的大面积重叠，银纳米颗粒能够对柠檬酸碳点所发射的荧光产生显著吸收的效果，致使产生的实际荧光强度比值(I_B/I_A)₁＝a₁相较于初始荧光强度比值(I_B/I_A)₀＝a₀存在显著的差异，越大、越显著的差异，则在后续定性检测过程中能够产生越高的检测灵敏度以及定量检测时的检测精度。同时，a₁与a₀的差异值还同样取决于初始基数值a₀的大小，因此控制a₀在上述(31～40)：1的范围内，确保其基数值所对应的探针荧光颜色为蓝色，同时使得a₁与a₀的差异值较大，且a₁所对应的探针荧光颜色为红色，确保比率探针的检测精度和可视化检测。作为优选，蓝色荧光发射峰的峰顶波长为429～433nm，红色荧光发射峰的峰顶波长584～590nm，初始荧光强度比值a₀为(35～38)：1，其最优为：蓝色荧光发射峰的峰顶波长431nm，红色荧光发射峰的峰顶波长584nm，初始荧光强度比值a₀为38：1。

一种基于内过滤效应的比率探针的构建方法，

所述构建方法包括以下步骤：

将n种发光碳点加入至水中分散均匀形成分散液，再加入m种吸光能量受体至分散液中混合均匀，所得溶液即基于内过滤效应的比率探针。

所述构建方法简洁高效，其通过简单地分散若干种发光碳点配制为分散液，形成比率荧光团后再加入若干种吸光能量受体作为猝灭剂，即可配制得到基于内过滤效应的比率探针，且配制所得的比率探针为液态制剂，其在使用时更容易均匀分散在待测液中。

作为优选，

所述发光碳点加入两种，其分别为柠檬酸碳点和对苯二胺碳点；

所述吸光能量受体加入一种，其为银纳米颗粒；

其中：以柠檬酸碳点质量为基础，对苯二胺碳点的加入量为13～24mg/mg，水的用量为0.5～1.5L/mg，银纳米颗粒的用量为35～59.2mg/mg。

柠檬酸碳点和对苯二胺碳点均为常见、常规的碳点材料，其具有容易获得、容易制备等优点。通过控制两种发光碳点的用量，可方便地控制初始荧光强度比值，再通过控制银纳米颗粒的加入量，可对实际荧光强度比值进行有效调控。

作为优选，

所述银纳米颗粒由以下方法制备：

将硝酸银加入至水中，加热至沸腾后加入柠檬酸钠和硼氢化钠进行还原反应，即得到银纳米颗粒。

常规的银纳米颗粒的荧光吸收峰的半高峰宽度较大，导致其容易与两个荧光发射峰均产生重叠，以上述红色荧光发射峰和蓝色荧光发射峰举例，理论上需要控制纳米银颗粒的荧光吸收峰尽量与蓝色荧光吸收峰重叠并尽量不与红色荧光吸收峰重叠，因此可控制初始荧光强度比值和实际荧光强度比值产生更大的差异值，提高定量检测的精度和可视化能力，因此常规的银纳米颗粒在使用过程中存在一定的缺陷。而通过上述双还原剂制备的方式，将硝酸银加入至剧烈搅拌或剧烈振荡的水中，加热至沸腾后加入柠檬酸钠和硼氢化钠双还原剂进行还原反应，所制得的银纳米颗粒具有荧光吸收峰的半高峰宽度小、最大吸收值对应波长在385～420波长范围内等特点，其能够始终确保荧光吸收峰与柠檬酸碳点的蓝色荧光发射峰重叠面积大，又能够控制荧光吸收峰与对苯二胺碳点的红色荧光发射峰不重叠，产生良好的内过滤效果，对于实现比率检测和提高检测精度非常有益。

一种基于内过滤效应的比率探针的应用，

所述基于内过滤效应的比率探针用于氰离子检测；

所述检测包括定性检测和定量检测。

基于内过滤效应的比率探针在用于氰离子检测时具有高灵敏度、高准确性、高抗毒能力等优点，能够快速进行高灵敏度的定性检测和高精度的定量检测。

作为优选，

所述基于内过滤效应的比率探针对氰离子进行定性检测时包括以下步骤：

对基于内过滤效应的比率探针作为空白试样进行荧光光谱检测得到荧光强度比值，随后将基于内过滤效应的比率探针、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液和待测液以一定比例混合均匀形成混合液，随后混合液取样进行荧光光谱检测并与空白试样的荧光强度比值进行比对，存在显著区别则待测液中含有氰离子，完成定性检测。

检测方法简单快速，并且通过比较荧光强度比值的差异即可快速进行定性检测。

作为优选，

所述基于内过滤效应的比率探针对氰离子进行定量检测时包括以下步骤：

1)选用相同基于内过滤效应的比率探针，分别配制不同浓度的氰离子标准溶液作为标准待测液，分别将基于内过滤效应的比率探针、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液和各个标准待测液以一定比例混合均匀形成标准混合液，随后标准混合液取样进行荧光光谱检测，分别记录所得结果并绘制氰离子浓度与荧光强度比值的标准曲线；

2)选用与步骤1)相同的基于内过滤效应的比率探针，将基于内过滤效应的比率探针、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液和待测液以一定比例混合均匀形成混合液，随后混合液取样进行荧光光谱检测，所得荧光强度比值代入至步骤1)所得标准曲线中，即可得知待测液中氰离子浓度，完成定量检测。

通过绘制标准曲线的方式首先建立氰离子浓度与荧光强度比值的关联式，再通过测定待测液的荧光强度比值并带入关联式，即可快速获得氰离子浓度，并且该方式能够确保检测结果具有较高的精确性。

本发明的有益效果是：

1)本发明比率探针通过多化学信号检测的方式提高整体的检测精度和检测灵敏度；

2)通过猝灭剂和荧光团的配合可避免低抗毒成分的引入，实现高抗毒配合，提高整体比率探针的抗毒性，能够大幅度降低杂质离子对比率探针的干扰，使得比率探针能够在绝大对数条件下适用，具有广泛的普适性、更高的稳定性以及使用方便性；

3)采用低毒甚至无毒的发光碳点降低整体比率探针的毒性，实现低毒甚至无毒的检测；

4)通过荧光团和猝灭剂的组合实现内过滤效果，控制初始荧光强度比值和实际荧光强度比值之间的差异，能够扩大比率探针的检测范围；

5)整体比率探针构建方法简洁高效，能够实现快速构建比率探针的目的；

6)可实现对氰离子的高灵敏度定性检测和高精度的定量检测。

附图说明

图1为本发明基于内过滤效应的比率探针的构建及检测机理示意图；

图2为本发明实施例1两种碳点的荧光光谱图及银纳米颗粒的紫外图；

图3为本发明实施例1所构建比率探针对氰离子响应的荧光光谱图；

图4为氰离子浓度与荧光强度比值标准曲线图；

图5为本发明实施例1所构建比率探针对不同阴离子的荧光比值响应图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和说明书附图对本发明作出进一步清楚详细的描述说明。本领域普通技术人员在基于这些说明的情况下将能够实现本发明。此外，下述说明中涉及到的本发明的实施例通常仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。因此，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

如无特殊说明，本发明实施例所用原料均为市售或本领域技术人员可获得的原料；如无特殊说明，本发明实施例所用方法均为本领域技术人员所掌握的方法。

实施例1

制备柠檬酸碳点：

将1.0g柠檬酸和5mL乙二胺加入至25mL去离子水中，转移溶液至高压反应釜，在200℃条件下反应5h，随后透析24h去除柠檬酸和乙二胺等小分子物质后冷冻干燥得到柠檬酸碳点固体备用。经检测其作为发射蓝色荧光的蓝色荧光碳点，其蓝色荧光发射峰的峰顶波长为431nm。

制备对苯二胺碳点：

将0.3g对苯二胺溶于30mL乙醇中，高压反应釜内180℃反应12h，得到深红色溶液粗产物，通过柱层析的方式分离提纯产物，其间利用二氯甲烷和甲醇体积比为10：1的混合液作为洗脱溶剂，分离得到具有红色荧光的产物，对其进行旋蒸即获得对苯二胺碳点。经检测其作为发射红色荧光的红色荧光碳点，其红色荧光发射峰的峰顶波长为584nm。

银纳米颗粒的制备：

将8.5mg硝酸银加入至剧烈搅拌的50mL去离子水中，溶液加热至沸腾后加入1mL浓度为1wt％的柠檬酸钠溶液和0.3mL浓度为3mmol/L的硼氢化钠溶液，反应1h后冷却至室温，所得溶液用0.22μm滤膜过滤去除大颗粒杂质，得到银纳米颗粒溶液。

基于内过滤效应的比率探针的构建：

将0.04mg柠檬酸碳点和0.6mg对苯二胺碳点分散在20mL去离子水中，再加入1mL浓度为1.6mg/mL的银纳米颗粒水分散液，超声5min，即获得基于内过滤效应的比率探针。

本实施例所制得的基于内过滤效应的比率探针初始荧光强度比值a₀＝(I₄₃₁/I₅₈₄)＝38：1，经过银纳米颗粒吸收蓝色荧光后，实际荧光强度比值a₁＝(I₄₃₁/I₅₈₄)＝30：1。

实施例2

本实施例采用实施例1所制得的柠檬酸碳点和对苯二胺碳点。

银纳米颗粒的制备：

将8.5mg硝酸银加入至剧烈搅拌的50mL去离子水中，溶液加热至沸腾后加入0.8mL浓度为1wt％的柠檬酸钠溶液和0.35mL浓度为3mmol/L的硼氢化钠溶液，反应1h后冷却至室温，所得溶液用0.22μm滤膜过滤去除大颗粒杂质，得到银纳米颗粒溶液。

基于内过滤效应的比率探针的构建：

将0.04mg柠檬酸碳点和0.6mg对苯二胺碳点分散在20mL去离子水中，再加入1mL浓度为1.6mg/mL的银纳米颗粒水分散液，超声5min，即获得基于内过滤效应的比率探针。

本实施例所制得的基于内过滤效应的比率探针初始荧光强度比值a₀＝(I₄₃₁/I₅₈₄)＝38：1，经过银纳米颗粒吸收蓝色荧光后，实际荧光强度比值a₁＝(I₄₃₁/I₅₈₄)＝31：1。

实施例3

本实施例采用实施例1所制得的柠檬酸碳点和对苯二胺碳点。

银纳米颗粒的制备：

将8.5mg硝酸银加入至剧烈搅拌的50mL去离子水中，溶液加热至沸腾后加入1.0mL浓度为1wt％的柠檬酸钠溶液和0.3mL浓度为3mmol/L的硼氢化钠溶液，反应1h后冷却至室温，所得溶液用0.22μm滤膜过滤去除大颗粒杂质，得到银纳米颗粒溶液。

基于内过滤效应的比率探针的构建：

将0.027mg柠檬酸碳点和0.6mg对苯二胺碳点分散在20mL去离子水中，再加入1mL浓度为1.6mg/mL的银纳米颗粒水分散液，超声5min，即获得基于内过滤效应的比率探针。

本实施例所制得的基于内过滤效应的比率探针初始荧光强度比值a₀＝(I₄₃₁/I₅₈₄)＝32：1，经过银纳米颗粒吸收蓝色荧光后，实际荧光强度比值a₁＝(I₄₃₁/I₅₈₄)＝26：1。

对比例1

对比例1具体构建比率探针步骤与实施例1相同，所不同的是银纳米颗粒，本对比例银纳米颗粒的制备条件如下：将8.5mg硝酸银加入至剧烈搅拌的50mL去离子水中，溶液加热至沸腾后加入1.5mL浓度为1wt％的柠檬酸钠溶液，反应1h后冷却至室温，所得溶液用0.22μm滤膜过滤去除大颗粒杂质，最后干燥得到银纳米颗粒。将本对比例所构建的比率探针标记为对比探针A。

对比例2

对比例2具体构建比率探针的方法与实施例1相同，所不同的是：柠檬酸碳点的用量为0.01mg。

将本对比例所构建的比率探针标记为对比探针B，对比探针B的初始荧光强度比值a₀＝(I₄₃₁/I₅₈₄)＝29：1。

测试1：

采用实施例1所制得基于内过滤效应的比率探针对缓冲溶中的氰离子标准溶液做检测：取10支样品管，将200μL浓度为0.11mg/mL的比率荧光探针溶液，700μL pH为8的10mMNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，100μL浓度为0、0.05、0.1、0.5、1、5、10、25、50、100μM的氰离子标准溶液混合作为待测液，反应10分钟后转移到荧光比色皿中进行荧光光谱检测和紫外吸收光谱检测。

其实施例1构建及反应过程如图1所示，首先分散柠檬酸碳点BCDs和对苯二胺碳点RCDs，再加入银纳米颗粒AgNPs，最后反应时加入氰离子CN^-使得银纳米颗粒被反应，柠檬酸碳点荧光强度恢复。

荧光光谱检测及紫外吸收光谱检测如图2所示，比率探针对氰离子响应的荧光光谱图如图3所示。

对对比例1和对比例2进行相同的测试及检测。

检测结果表明：

对比例1中柠檬酸钠还原的银纳米颗粒吸收峰宽且红移，吸收峰与蓝色、红色碳点的发射峰均重叠，使得银纳米颗粒同时吸收了蓝色和红色荧光，降低检测灵敏度，说明银纳米颗粒消光性能十分关键；

对比例2中蓝色和红色碳点初始荧光强度比为I₄₃₁/I₅₈₄＝29:1条件下，加入银纳米颗粒后荧光强度比I₄₃₁/I₅₈₄＝23.7:1。随氰离子加入及浓度增大，银纳米颗粒被刻蚀，蓝色荧光恢复率低，荧光强度比仅增大至I₄₃₁/I₅₈₄＝25:1，颜色变化不可见，说明比率探针中荧光团的初始荧光强度比例至关重要。

实施例4

实际水样中氰离子的检测为评估比率探针的实用性，本实施例对自来水和湖水两种水样进行氰离子含量检测和回收试验。实验所用自来水水样来源实验室水龙头，湖水从西湖断桥处取得，水样在测试前均经过0.22μm滤膜过滤三次，所用比率探针为实施例1所制得的基于内过滤效应的比率探针。将200μL浓度为0.11mg/mL的比率探针，700μL pH＝7.4的10mMNa₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，分别与100μL水样溶液和加标溶液(水样溶液加入氰离子终浓度为1、5、10μM)混合作为待测液，反应10分钟后转移到荧光比色皿中进行荧光光谱检测，检测结果如下表表1所示。

根据图3结果绘制标准曲线如图4所示，并得到荧光强度比值检测值与氰离子浓度的关联式，计算得到氰离子浓度，结合表1可以看出，该方法回收率在可接受范围内，准确性高，检测效果好。

实施例5

比率探针的选择性测试为了进一步探究针对氰离子比率荧光探针的选择性，本实施例在探针溶液中加入一系列的阴离子，包括NO₃ ^─、NO₂ ^─、F^─、Cl^─、Br^─、I^─、IO₄ ^─、SO₄ ^2─、SO₃ ^2─、SCN^─、C₂O₄ ^2─、CO₃ ^2─，并进行荧光光谱检测，所用比率探针为实施例1所得基于内过滤效应的比率探针。取样品管12支，加入200μL浓度为0.11mg/mL的比率探针，700μL pH＝8的10mM Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲液，分别加入100μL终浓度为0.2mM的NO₃ ^─、NO₂ ^─、F^─、Cl^─、Br^─、I^─、IO₄ ^─、SO₄ ^2─、SO₃ ^{2 ─}、SCN^─、C₂O₄ ^2─混合作为待测液，反应10分钟后转移到荧光比色皿中进行荧光光谱检测，检测结果如图5所示。如图5从对应的荧光强度比值可以看出，IO₄ ^─会造成蓝色碳点的荧光猝灭，其他离子对探针影响不大。因此，本发明设计的比率荧光探针能较好检测氰离子。

实施例6

具体步骤与实施例1相同，所不同的是：在构建基于内过滤效应的比率探针过程中，对苯二胺碳点的用量为0.96mg，用以分散两种碳点的去离子水用量为60mL。本实施例所制得比率探针的初始荧光强度比值a₀＝(I₄₃₁/I₅₈₄)＝31：1。

实施例7

具体步骤与实施例1相同，所不同的是：在构建基于内过滤效应的比率探针过程中，对苯二胺碳点的用量为0.52mg，银纳米颗粒水分散液的浓度为1.4mg/mL。本实施例所制得比率探针的初始荧光强度比值a₀＝(I₄₃₁/I₅₈₄)＝40：1。