阅读说明：本技术 一种基于单量子点测量共聚焦显微镜探测效率的方法 (Method for measuring confocal microscope detection efficiency based on single quantum dots ) 是由 张国峰 李斌 陈瑞云 秦成兵 胡建勇 肖连团 贾锁堂 于 2019-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明属于共聚焦显微镜成像技术领域,一种基于单量子点测量共聚焦显微镜探测效率的方法,使用matlab软件对得到的原始数据即单量子点的每一个荧光光子的到达时间进行后处理,得到荧光强度轨迹图和荧光强度-寿命分布图；从荧光强度轨迹图提取“亮态”光子构建时间分辨荧光光谱和二阶关联函数,并由此计算出每脉冲平均光子数；由荧光强度-寿命分布图拟合得出“亮态”单激子量子产率；结合每脉冲平均光子数,“亮态”单激子量子产率和激光器的重复频率计算出共聚焦显微镜的探测效率。(The invention belongs to the technical field of confocal microscope imaging, and discloses a method for measuring the detection efficiency of a confocal microscope based on single quantum dots, which comprises the steps of carrying out post-processing on the obtained raw data, namely the arrival time of each fluorescence photon of the single quantum dot by using matlab software to obtain a fluorescence intensity trace graph and a fluorescence intensity-service life distribution graph; extracting 'bright state' photons from the fluorescence intensity trace graph to construct a time-resolved fluorescence spectrum and a second-order correlation function, and calculating the average photon number per pulse; fitting the fluorescence intensity-life distribution diagram to obtain the 'bright state' singlet exciton quantum yield; the detection efficiency of the confocal microscope is calculated by combining the average photon number per pulse, the 'bright state' singlet exciton quantum yield and the repetition frequency of the laser.)

一种基于单量子点测量共聚焦显微镜探测效率的方法

技术领域

本发明属于共聚焦显微镜成像技术领域，利用单量子点在激光激发下产生的单、双激子发射荧光光子，然后根据共聚焦显微镜探测到的每个光子的到达时间进行后处理计算出探测效率的方法。

背景技术

共聚焦显微镜是一种利用逐点扫描照明并伴随空间针孔滤波消除样品焦点平面外散射光的光学成像显微镜。尽管该技术相比传统成像方法，能够极大地提高了Z轴的成像分辨率。在日常使用过程中，经常需要对共聚焦显微镜的探测效率进行评估。而目前的评估方法都十分复杂，急需我们提供一种简单易行的测量方法。

胶体量子点是一种将激子受限于三维空间中的半导体纳米粒子，具有吸收谱线宽、发射谱线窄以及量子产率高等优点，在荧光成像、新型的光电器件和量子信息等诸多方面具有广阔的应用前景。单量子点在激光激发下有一定概率产生单激子和双激子。单激子会发射单光子荧光，双激子有一定概率发射双光子荧光。每一个荧光都会有一定概率被共聚焦显微镜的探测器所探测。该原因使得测量共聚焦显微镜的探测效率成为可能。这里我们将给出一种基于单个量子点探测共聚焦显微镜探测效率的方法。

发明内容

本发明的目的是通过对单个量子点发射的每个荧光的到达时间进行后处理，计算得到共聚焦显微镜探测效率的方法，可用于测量共聚焦显微镜的探测效率。

本发明所采用的技术方案是：1.一种基于单量子点测量共聚焦显微镜探测效率的方法，按照如下的步骤进行

(a)使用matlab软件对得到的原始数据即单量子点的每一个荧光光子的到达时间进行后处理，得到荧光强度轨迹图和荧光强度-寿命分布图；

(b)从荧光强度轨迹图提取“亮态”光子构建时间分辨荧光光谱和二阶关联函数，并由此计算出每脉冲平均光子数；

(c)由荧光强度-寿命分布图拟合得出“亮态”单激子量子产率；(d)结合每脉冲平均光子数，“亮态”单激子量子产率和激光器的重复频率计算出共聚焦显微镜的探测效率；(e)利用共焦扫描显微镜对权利要求1所述样品中的量子点进行荧光成像；

(f)利用时间标记-时间分辨-时间关联的数据采集卡记录单量子点的每一个荧光光子的到达时间。

本发明将任意一种胶体量子点溶解在光谱纯度的溶剂中，旋涂在干净的玻片上制备成样品，保证每平方微米不超过1个量子点。这样制备出来的样品，在探测其中一个量子点的荧光时，其它的量子点就不会对这个量子点造成影响。

使用共聚焦显微镜对样品进行成像，快速识别出单个的量子点。之后对量子点的荧光进行收集。荧光被50/50分束棱镜分开后被两个单光子探测器采集，采集到的光信号被转化为TTL电信号传输给时间标定-时间分辨-时间相关单光子计数器(TTTR-TCSPC)，该计数器对每一个光子的绝对到达时间进行记录。通过后续的程序处理就可以分别得到两个探测器的荧光衰减曲线和二阶关联函数曲线。通过这两条曲线可以计算出单量子点的激发光的每脉冲平均激发光子数。此外，通过程序处理还可以得到量子点的荧光强度-寿命分布图，通过这个分布图可以评估出量子点单激子的量子产率。最终，通过量子点单激子量子产率和每脉冲平均激发光子数可以得到共聚焦显微镜的探测效率。

附图说明

图1为实现本发明所述方法的实验样品制备示意图；

图2为实现本发明所述方法的实验装置图；

图3为玻片表面上的单量子点的荧光成像；

图4为玻片表面上的单量子点的荧光强度轨迹，通过虚线所示阈值将荧光强度轨迹分为亮态和暗态；

图5为时间分辨荧光光谱，它也通过提取亮态的荧光光子的到达时间构建，使用双指数拟合时间分辨荧光光谱可以分别得到单、双激子的寿命和权重；

图6为二阶关联函数，它通过提取亮态的荧光光子的到达时间构建；

图7为玻片表面上的单量子点的荧光强度-寿命分布图；

图8为流程图，它展示了基于单量子点测量共聚焦显微镜探测效率的步骤。

具体实施方式

一种基于单量子点测量共聚焦显微镜探测效率的方法，包括以下步骤。

(a)将任意一种胶体量子点利用旋涂法制备在干净的玻片上。主要细节为：量子点首先被溶解在光谱纯度的溶剂中，然后将其旋涂在玻片上，保证玻片上每平方微米不超过1个量子点，如图1所示。溶液的浓度，旋涂采用的转速和时间都需要选择恰当来确保样品的制备，我们的方法看后面。这样，当其中一个量子点被激光激发时，旁边的量子点就不会被激发，从而不会对激发区域内的单量子点造成影响。本发明所用的量子点可用多种公知的量子点实现，我们这里采用的是苏州星烁纳米科技有限公司提供的CdSe/ZnS梯度合金量子点，发射波长为618纳米。对于这个产品，我们在制备样品时，将量子点稀释到光谱纯的甲苯溶剂中，浓度约为10^-8～10^-9mol/L，旋涂的转速为2000转/分，旋涂时间为90s，这样制备出的样品就可以保证玻片上每平方微米不超过1个量子点。

(b)将样品放在共聚焦显微镜中进行荧光成像，寻找单个的量子点。本发明所使用的共聚焦显微镜必须具有Hanbury Brown and Twiss(HBT)探测光路，且配备有TTTR-TCSPC仪器。该类型的显微镜可以通过多种公知的仪器实现，本发明具体采用的仪器有：荧光倒置显微镜(OLYMPUS，IX71)，皮秒脉冲激光器(WL-SC-400-15-PP,NKT Photonics)，三维纳米台(Tritor 200/20SG)，单光子探测器(SPCM-AQR-55,PerkinElmer)，TTTR-TCSPC(上海星秒光电科技有限公司,FT1040)，NI 6361数据采集板卡等。软件程序方面有自编的LabVIEW和MATLAB数据采集和分析程序等。图2所示为光路结构示意图。在进行荧光成像时，激发光源为皮秒脉冲激光器，波长设置为532nm，脉冲的重复频率设置为5MHz，激光通过λ/2玻片、λ/4玻片以及扩束器，并通过激发滤光器进行滤波后由二向色镜反射进入显微镜物镜；显微镜物镜前端设有一个用于搭载样品的三维纳米台；倒置荧光显微镜的荧光收集光路上顺次设有陷波滤波器、发射滤波器、共焦针孔，50/50分束棱镜和两个单光子探测器；探测器将探测到的光信号转化为电信号传递给TTTR-TCSPC仪器。量子点的荧光成像通过电驱动三维纳米台实现，图3所示为实验样品的共聚焦荧光成像，图中标尺的尺寸为2μm，成像面积为16μm×16μm，各白色圆圈内为单个量子点的荧光成像，成像的差异性指示着单量子点荧光辐射的异构性。

(c)移动纳米台定位单个量子点，对单量子点荧光进行采集。通过TTTR-TCSPC仪器对每一个荧光光子的到达时间进行记录，同时该仪器也记录了荧光光子和对应的激发脉冲的时间间隔。这些时间信息作为原始数据被保存下来。

(d)使用matlab软件对得到的原始数据进行后处理。1.通过统计每个积分时间内的光子数量，可以得到单个量子点的荧光强度轨迹，如图4所示。通过一条荧光强度阈值将荧光强度最高的区域对应的荧光光子的到达时间数据提取出来，称之为“亮态”光子。2.我们把每一个“亮态”光子的到达时间减去对应的激发光脉冲的发射时间进行相减，得到每一个“亮态”光子的关联时间。对这些关联时间进行统计，可以得到如图5所示的时间分辨荧光光谱。3.将其中一个探测器测量的到的每个荧光光子的到达时间和另一个探测器测量得到的每个荧光光子的到达时间相减，可以分别得到这些光子的关联时间，对这些关联时间进行统计，可以得到如图6所示的二阶关联函数。4.对每个积分时间内的时间分辨荧光光谱进行指数衰减拟合，分别得到他们的寿命。将这些积分时间对应的寿命与荧光强度进行统计，可以得到如图5所示的荧光强度-寿命分布图。

(e)评估量子点的激发条件：每脉冲平均光子数。对图5中的荧光衰减曲线使用双指数函数

拟合，其中τ_X和τ_XX为单、双激子的寿命值，A_X和A_XX为相应的寿命值的振幅，通过对衰减曲线进行积分

可以分别得到单、双激子发射的荧光总强度，其中F为重复频率。图6中的二阶关联函数中心峰的面积g_c和边峰的面积g_s也可以通过积分分别获得。通过以上各值就可以求出每脉冲平均光子数：

(f)计算“亮态”对应的单激子量子产率。通过使用Q_X＝(k_X-k_X,nr)/k_X对荧光强度-寿命分布图中的白线进行拟合，可以得到单激子的量子产率。其中Q_X为单激子量子产率，k_X为单激子总速率，k_X,nr为单激子非辐射速率。

(g)最终计算出共聚焦显微镜的探测效率。通过以上步骤所获得的每脉冲平均光子数和“亮态”对应的单激子量子产率，以及记录下激光器的重复频率，就可以计算出共聚焦显微镜的探测效率η_X＝I/F·Q_X·P_X。其中P_X为激发获得单激子的概率，可通过

计算获得。

图8为单量子点测量共聚焦显微镜探测效率的流程图。