一种乙肝相关肝细胞癌的预后检测试剂盒
阅读说明：本技术 一种乙肝相关肝细胞癌的预后检测试剂盒 (Hepatitis B-related hepatocellular carcinoma prognosis detection kit ) 是由 彭涛 王向坤 朱广志 廖锡文 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学和临床诊断技术领域,公开了一种乙肝相关肝细胞癌的预后检测试剂盒及其在临床医学中的应用。本发明检测试剂盒中包含载脂蛋白A4、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4的检测试剂。具体而言,包含与所述各亚型载脂蛋白相关的免疫吸附剂、酶结合物、酶反应底物和标准品。本发明试剂盒可用于血清、血浆、尿液、胸腹水、灌洗液、脑脊液、组织匀浆等样本的检测。本发明试剂盒由于采用了多种载脂蛋白联合效应分析的策略,使得其对肝细胞癌的预后预测能力得到了显著增强,经验证,本发明试剂盒在预测肝细胞癌的总生存时间和无瘤生存方面灵敏准确、特异性强,另外,本发明试剂盒还具有操作简便、样本易获得、检测耗时短等优点。(The invention belongs to the technical field of biomedicine and clinical diagnosis, and discloses a prognostic detection kit for hepatitis B-related hepatocellular carcinoma and application thereof in clinical medicine. The detection kit comprises detection reagents of apolipoprotein A4, apolipoprotein C3 and apolipoprotein C4. Specifically, the immunopotentiator comprises immunoadsorbent, enzyme conjugate, enzyme reaction substrate and standard substance related to each subtype apolipoprotein. The kit can be used for detecting samples such as serum, plasma, urine, hydrothorax, ascites, lavage fluid, cerebrospinal fluid, tissue homogenate and the like. The kit adopts a strategy of analysis of the combined effect of a plurality of apolipoproteins, so that the prognosis prediction capability of the kit on the hepatocellular carcinoma is obviously enhanced.)
技术领域
本发明属于生物医学和临床诊断技术领域，尤其涉及一种乙肝相关肝细胞癌的预后检测试剂盒及其在临床医学中的应用。
背景技术
肝癌被列为全球第六大最常见癌症(Alejandro Forner,Llovet,&Bruix,2012)，列所致死亡人数最多的癌症第三位。其中，肝细胞癌(HCC)约占原发性肝癌的75-80％。HCC发生的危险因素包括：慢性乙型或丙型肝炎病毒(HBV,HCV)感染、2型糖尿病、重度饮酒、黄曲霉毒素污染、肥胖、非酒精性脂肪肝和吸烟。如今，HCC患者的治疗主要依赖于手术切除、局部区域和全身治疗等。尽管HCC有多种替代治疗方法，但其5年生存率仍然相当低，仅不足10％，因此，对其进行及时的早期诊断和准确的预后评估显得尤为重要。
载脂蛋白是一种能够结合和运输血脂到机体各组织进行代谢及利用的功能性蛋白质，根据其不同的表型分类，载脂蛋白(APO)家族由APOA、APOB、APOC、APOD、APOE、APOF、APOH、APOL、APOM和APOO亚家族成员组成。其中，载脂蛋白A和载脂蛋白C亚家族分别由载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A4和载脂蛋白A5以及载脂蛋白C1、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4组成。研究发现，载脂蛋白家族成员具有多种生物活性且与多种疾病的发生发展具有关联，如载脂蛋白A1/载脂蛋白B血清比率的变化有可能反映出动脉粥样硬化和抗动脉粥样硬化之间的动态平衡，该比率被称为脑血管和心血管疾病发病风险的良好预测因子(Min,Lu,Yong,&Gang,2011)；载脂蛋白C3与甘油三酯水平密切相关(Luo,Su,Yi,Yang,&Peng,2018)；载脂蛋白A1-75G/A和-83C/T基因型与乳腺癌易感性和***转移相关(Hamrita,2011)等。
然而，目前有关于APO家族的研究，主要集中在心血管、脑血管和动脉粥样硬化等方面，针对它们与肿瘤(尤其是乙肝相关肝细胞癌)关系的研究报道极少，我们的研究目的旨在确认载脂蛋白和HCC预后之间的关系，并在此基础上开发一种乙肝相关肝细胞癌的预后检测试剂盒。据我们所知，目前尚未见到基于载脂蛋白的诊断技术应用于乙肝相关肝细胞癌的预后评估的相关报道，也没有类似的检测技术或检测试剂盒正式应用于临床实践中。
发明内容
为了对乙肝相关肝细胞癌(HCC)进行准确的预后评估，并为载脂蛋白探寻新的临床用途，我们通过大量的筛选验证实验，研制获得了一种新的乙肝相关肝细胞癌的预后检测试剂盒。
本发明乙肝相关肝细胞癌的预后检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒中包含载脂蛋白A4、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4的检测试剂。
进一步地，所述检测试剂盒中还可包含载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白C1和载脂蛋白C2的检测试剂。
进一步地，上述检测试剂盒中包含与所述各亚型载脂蛋白相关的免疫吸附剂、酶结合物、酶反应底物和标准品。
进一步地，上述免疫吸附剂为固相的抗原或抗体，所述酶结合物为酶标记的抗原或抗体，所述酶反应底物为与所述酶结合物中的酶发生特异性结合反应的反应底物。
优选地，上述检测试剂盒中还可包含下述组分中的至少一种：封闭液、中性磷酸缓冲液、洗涤液、稀释液、显色剂、终止液、硫代硫酸钠饱和溶液、质控血清。
优选地，上述检测试剂盒的检测对象为血清、血浆、尿液、胸腹水、灌洗液、脑脊液、细胞培养上清或组织匀浆样本。
此外，本发明还涉及上述检测试剂盒在制备肝细胞癌诊断试剂盒中的用途。
本发明还涉及上述检测试剂盒在制备肝细胞癌预后评估试剂盒中的用途。
综上，本发明试剂盒由于采用了多种载脂蛋白联合效应分析的策略，使得其对肝细胞癌的预后预测能力得到了显著增强，经实验验证，本发明试剂盒在预测肝细胞癌的总生存时间和无瘤生存方面灵敏准确、特异性强，另外，本发明试剂盒还具有操作简便、样本易获得、检测耗时短等优点。
附图说明
图1.载脂蛋白A和载脂蛋白C家族基因的联合总生存和联合无瘤生存时间曲线。总生存相关基因的联合生存分析：载脂蛋白A4+C3(A)，载脂蛋白A4+C4(B)，载脂蛋白C3+C4(C)，载脂蛋白A4+C3+C4(D)；无瘤生存相关基因的联合生存分析：载脂蛋白A4+C4(E)。
图2.总生存风险评分模型及其生存曲线、ROC曲线。A：风险评分模型(风险评分排序、总生存水平、载脂蛋白A4、C3和C4表达量热图)；B：总生存曲线图；C：时间依赖性ROC曲线。
图3.无瘤生存风险评分模型及其生存曲线、ROC曲线。A：风险评分模型(风险评分排序、无瘤生存水平、载脂蛋白A4和C4表达量热图)；B：无瘤生存曲线图；C：时间依赖性ROC曲线。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
在本发明中，若无特别说明，所有的设备和原料均可从商业途径得到或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：一种乙肝相关肝细胞癌的预后检测试剂盒
本试剂盒包含下述组分：
(1)免疫吸附剂(固相抗体)：纯化的人载脂蛋白A4、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4抗体包被的微孔板；
(2)酶结合物：辣根过氧化物酶(HRP)标记的载脂蛋白A4、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4抗体；
(3)酶反应底物：人三甲氧苄氨嘧啶(TMB)底物；
(4)标准品：载脂蛋白A4、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4标准品；
(5)终止液：十二烷基硫酸钠(SDS)溶液；
(6)显色剂：显色剂A液、显色剂B液；
(7)中性磷酸缓冲液。
实施例2：一种乙肝相关肝细胞癌的预后检测试剂盒
本试剂盒包含下述组分：
(1)免疫吸附剂(固相抗体)：纯化的人载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A4、载脂蛋白C1、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4抗体包被的微孔板；
(2)酶结合物：辣根过氧化物酶(HRP)标记的载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A4、载脂蛋白C1、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4抗体；
(3)酶反应底物：人三甲氧苄氨嘧啶(TMB)底物；
(4)标准品：载脂蛋白A1、载脂蛋白A2、载脂蛋白A4、载脂蛋白C1、载脂蛋白C2、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4标准品；
(5)终止液：叠氮钠溶液；
(6)显色剂：显色剂A液、显色剂B液；
(7)中性磷酸缓冲液、硫代硫酸钠饱和溶液。
实施例3：效果验证实验
材料和方法
数据获取
GSE14520的数据集从Gene Expression Omnibus(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc＝GSE14520，2018年9月10日访问)网站下载(Roessler等,2010；Roessler等,2012)。为了避免批量效应，使用具有更多患者的平台GPL3921进行分析。将表达标准化并选择具有HBV感染的患者用于分析。此外，癌症基因组图谱(TCGA)数据是使用基因表达谱交互分析网站(GEPIA,http：//gepia.cancer-pku.cn/index.html，2018年9月15日访问)的验证结果(Tang et al,2017)。
mRNA表达，预后分析，联合效应分析
载脂蛋白A和载脂蛋白C家族成员的mRNA表达和身体分布均来自GEPIA网站。通过Graphpad 7.0版本使用肿瘤数据进行生存曲线绘制。数据表达量在中位值表达截止值的低表达和高表达分类，借助于肿瘤数据进行预后分析。生存分析中多因素分析证明是预后相关的则用于联合分析。
风险评分模型构建
进一步开发了HCC预后预测的风险评分模型和列线图，其中包括总生存时间和无瘤生存时间。风险评分表示为风险评分＝表达水平基因1Xβ1+表达水平基因2Xβ2+…+表达水平基因nXβn。系数(β)来自多变量Cox比例风险回归模型。在对风险评分进行分组时绘制了Kaplan-Meier图。绘制在1-5年生存ROC曲线。将预后相关的临床因素与基因一起纳入列线图，使用总分预测HCC预后。
验证分析
通过从GEPIA网站(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html，2018年9月5日访问)获得的TCGA数据进一步验证了包括总生存时间(OS)和无瘤生存时间(RFS)在内的预后意义。通过从HCCDB网站(http://lifeome.net/database/hccdb/search.html，2019年10月12日访问)获得的数据进一步验证预后相关基因在多个肝癌数据子集中的意义。
结果
人口特征
总体而言，212名患有乙肝病毒感染的肝细胞癌患者纳入分析。包括甲胎蛋白，巴塞罗那分期，肿瘤大小和肝硬化在内的因素与总生存时间相关(分别均为P≤0.05，见表1)。包括性别，肝硬化和巴塞罗那分期在内的因素与无瘤生存时间有关(所有P≤0.05，见表2)。
表1肝细胞癌病人的统计学数据及临床病理特点(总生存)
注：§：1个数据缺失；￡：3个数据缺失。
表2肝细胞癌病人的统计学数据及临床病理特点(无瘤生存)
注：§：1个数据缺失；￡：3个数据缺失。
mRNA表达量，预后和联合效应分析
结果显示，载脂蛋白A4、载脂蛋白C3和载脂蛋白C4与总生存时间连锁，而载脂蛋白A4和载脂蛋白C4与无瘤生存时间有关(所有校正后P≤0.05，见表3-4)。
表3载脂蛋白A和载脂蛋白C家族基因总生存时间的预后分析
注:P值用肿瘤大小、肝硬化、甲胎蛋白和巴塞罗那分期校正。
表4载脂蛋白A和载脂蛋白C家族基因无瘤生存时间的预后分析
注:P值用性别、肝硬化和巴塞罗那分期校正。
然后，对总生存时间和无瘤生存时间进行上述基因的联合效应分析(见表5-6)，结果显示，与单独的任何基因相比，联合效应分析表现出更好的总生存时间或无瘤生存时间预测。
表5预后相关基因的联合总生存分析
注:P值用肿瘤大小、肝硬化、甲胎蛋白和巴塞罗那分期校正。
表6预后相关基因的联合无瘤生存分析
注:P值用性别、肝硬化和巴塞罗那分期校正。
风险评分模型构建
构建针对总生存时间和无瘤生存时间预测开发的风险评分模型(图1、图2)。载脂蛋白A4、C3和C4纳入总生存时间模型，载脂蛋白C3、C4纳入无瘤生存时间模型。两种模型的综合信息包括风险评分排名、生存状态、表达热图、生存曲线图和存活ROC曲线(见表7-8)。ROC曲线揭示了这样一个事实，即模型在1年、2年、3年、4年和5年时表现出有效的预测潜力，而在1年、2年和3年时与无瘤生存时间有关(所有曲线下面积>0.6)。
表7总生存风险评分模型构建
表8无瘤生存风险评分模型构建
多数据库验证分析
使用GEPIA数据进行总生存时间和无瘤生存时间的基因验证分析(图3)。验证表明载脂蛋白C3与总生存时间和无瘤生存时间相关联(Log-rank P＝0.0026，相应地为0.00073)；载脂蛋白C4与总生存时间相关(Log-rank P＝0.046)。
以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。