阅读说明：本技术 一种长链非编码rna及其干扰rna在治疗动脉粥样硬化中的应用 (Long-chain non-coding RNA and application of interference RNA thereof in treatment of atherosclerosis ) 是由 于波 田进伟 孙长斌 袭祥文 顾霞 刘新新 于 2019-10-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种长链非编码RNA及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的应用。本发明通过对动脉粥样硬化小鼠模型的主动脉组织进行高通量测序,发现了一种长链非编码RNA(lncRNA)分子在正常与晚期动脉粥样硬化小鼠主动脉组织中表达显著差异,同时该lncRNA分子在动脉粥样硬化组织中的高表达,将该lncRNA分子命名为lncRNA-AFIAR。实验证明lncRNA-AFIAR具有增强巨噬细胞增殖、抑制巨噬细胞凋亡等功能,参与了促进动脉粥样硬化的进展这一过程。通过对lncRNA-AFIAR进行抑制可以达到抑制巨噬细胞增殖、减少斑块形成进而达到抑制AS的进展的目的。因此,本发明的提出为诊疗动脉粥样硬化提供了新的分子标记和干预靶点,也为动脉粥样硬化的治疗提供了新的技术手段。(The invention discloses a long-chain non-coding RNA and application of an interference RNA thereof in treating atherosclerosis. According to the invention, through high-throughput sequencing on the aorta tissue of an atherosclerosis mouse model, a significant difference of the expression of a long-chain non-coding RNA (lncRNA) molecule in the aorta tissue of a normal atherosclerosis mouse and a late atherosclerosis mouse is found, and the lncRNA molecule is highly expressed in the atherosclerosis tissue and is named lncRNA-AFIAR. Experiments prove that the lncRNA-AFIAR has the functions of enhancing macrophage proliferation, inhibiting macrophage apoptosis and the like, and participates in the process of promoting the development of atherosclerosis. The purpose of inhibiting macrophage proliferation and reducing plaque formation and further inhibiting AS progression can be achieved by inhibiting lncRNA-AFIAR. Therefore, the invention provides a new molecular marker and an intervention target point for diagnosing and treating atherosclerosis, and also provides a new technical means for treating atherosclerosis.)

一种长链非编码RNA及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的 应用

技术领域

本发明涉及一种长链非编码RNA及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的应用。本发明属于生物医药技术领域。

背景技术

2018年1月，国家心血管病中心发布了《中国心血管病报告2017》。其指出，2017年，我国冠状动脉粥样硬化性心脏病患者达1100万，总体上看，中国心血管病患病率及死亡率仍处于上升阶段，且今后10年心血管病患病人数仍将快速增长。而冠心病作为心血管疾病的高发病症，是全球死亡率最高的疾病之一，根据世界卫生组织2011年的报告，中国的冠心病死亡人数已列世界第二。

动脉粥样硬化被认为是一种慢性炎症反应，在其反应过程中，巨噬细胞逐渐地聚集在扩张的动脉壁上，部分在病灶内，吞噬脂质，产生多种炎症介质，加重疾病。巨噬细胞的积聚实际上并不依赖于单核细胞的补充，而是依赖于局部巨噬细胞的增殖。因此巨噬细胞的增殖与凋亡与动脉粥样硬化的发生发展密不可分。

长链非编码RNA(long non coding RNA，lncRNA)，是一类转录本大于200nt(nucleotide)，并且不能翻译成蛋白质的功能性RNA分子，大部分lncRNA是由RNA聚合酶Ⅱ催化转录而来，在组织和细胞中表现出较强的特异性。近年来关于lncRNA的研究进展迅猛，但是绝大部分的lncRNA的功能仍然是不清楚的。本发明借助在动脉粥样硬化动脉组织全转录组高通量测序中筛选出一种表达量高、差异性大的lncRNA分子，命名为lncRNA-AFIAR，并通过对其功能的检测，进一步发现了lncRNA-AFIAR与动脉粥样硬化疾病的关系，有助于我们更好的理解其发病机制，从RNA水平为动脉粥样硬化提供新的诊疗靶点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种在动脉粥样硬化组织相对于正常动脉组织中表达量显著升高的lncRNA及其干扰RNA，以及上述lncRNA在作为新靶点治疗动脉粥样硬化中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明通过对小鼠动脉粥样硬化模型中的动脉组织进行全转录组高通量测序，筛选到一种长链非编码RNA，命名为lncRNA-AFIAR，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，该lncRNA-AFIAR在动脉粥样硬化组织对比非动脉粥样硬化组织中的表达量明显增高。设计有关lncRNA-AFIAR荧光定量PCR扩增的引物序列以及沉默lncRNA-AFIAR(siRNA)序列。荧光定量PCR实验进一步证明了高通量测序结果，提取小鼠动脉粥样硬化组织提取RNA，反转录合成cDNA，使用设计的lncRNA-AFIAR PCR引物进行PCR扩增，首次获得扩增后产物。构建lncRNA-AFIAR沉默小鼠巨噬细胞RAW264.7，研究lncRNA-AFIAR在RAW264.7细胞的增殖、凋亡等功能中的作用，从而探求lncRNA-AFIAR在动脉粥样硬化中的作用机制。通过lncRNA-AFIAR对巨噬细胞的调控功能，我们发现lncRNA-AFIAR在动脉粥样硬化整个发生发展过程中发挥着重要的作用，LncRNA-AFIAR siRNA通过抑制巨噬细胞增殖、减少斑块形成来抑制AS的进展。

在上述研究的基础上，本发明提出了一种长链非编码RNA，命名为lncRNA-AFIAR，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

用于检测所述的长链非编码RNA的试剂也在本发明的保护范围之内。优选的，所述的试剂为引物，更优选的，所述的引物序列如SEQ ID NO.2以及SEQ ID NO.3所示。

用于抑制所述的长链非编码RNA的试剂也在本发明的保护范围之内。优选的，所述的试剂为干扰RNA(siRNA)，更优选的，所述的干扰RNA(siRNA)的序列如SEQ ID NO.4以及SEQ ID NO.5所示。

进一步的，本发明还提出了所述的长链非编码RNA作为靶点在制备诊断或治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

更进一步的，本发明还提出了用于检测所述的长链非编码RNA的试剂在制备诊断动脉粥样硬化药物中的应用。

更进一步的，本发明还提出了用于抑制所述的长链非编码RNA的试剂在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明通过实验证明lncRNA-AFIAR对巨噬细胞的调控功能，并且发现lncRNA-AFIAR在动脉粥样硬化整个发生发展过程中发挥着重要的作用。通过在临床中通过对该靶点的筛查，可以实现对早期动脉粥样硬化及时药物干预，延缓甚至逆转病。在晚期的动脉粥样筛查中，可了解患者病变发展情况，及时干预避免临床时间发生。因此，本发明的提出为诊疗动脉粥样硬化提供了新的分子标记和干预靶点，也为动脉粥样硬化的治疗提供了新的技术手段。

附图说明

图1为动脉粥样硬化小鼠模型建立病理染色；

A-D为ApoE小鼠主动脉动脉粥样硬化模型主动脉整体油红O染色；A、B：早期AS模型；C、D：晚期AS模型；

E-F为小鼠动脉粥样硬化模型主动脉根部冰冻切片油红O染色；E：早期AS模型；F：晚期AS模型；

图2为晚期小鼠主动脉组织(ADV)与正常小鼠主动脉组织(NOR)通过高通量测序发现的差异表达的lncRNA分布情况；

图3为动脉粥样硬化晚期小鼠主动脉组织(ADV)与正常小鼠主动脉组织(NOR)通过高通量测序lncRNA-AFIAR的表达示意图；

图4为Real-time PCR检测lncRNA-AFIAR在动脉粥样硬化晚期小鼠主动脉组织(ADV)与正常小鼠主动脉组织(NOR)的表达示意图；

图5为EDU染色检测转染无关序列si-NC及lncRNA-AFIAR的沉默序列si-AFIAR 48小时后RAW264.7细胞的增殖情况；lncRNA-AFIAR沉默后，RAW264.7细胞增殖明显受到抑制；

图6为Hochest33342染色检测转染无关序列si-NC及lncRNA-AFIAR的沉默序列si-AFIAR 48小时后RAW264.7细胞的凋亡情况；lncRNA-AFIAR沉默后，RAW264.7细胞的凋亡率明显升高；

图7为Apoe-/-小鼠高脂16周，AAV2/9-NC组与AAV2/9-sh-AFIAR组主动脉根部油红O病理染色，通过油红O染色小鼠主动脉根部斑块染色，发现AAV2/9-sh-AFIAR组相较于AAV2/9-NC组小鼠动脉粥样硬化斑块(红色)明显减少、变小。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1：不同阶段动脉粥样硬化小鼠模型建立后的病理染色

1.材料

1.1动物

本发明的Apoe小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物随机分组，分别于12周龄(8周龄时开始高脂喂养4周，EAR组)及24周龄(8周龄时开始高脂喂养16周，ADV组)取材主动脉。实验动物的使用得到了哈尔滨医科大学伦理委员会的批准。

1.2试剂

高脂饲料(猪油10％、奶粉4％、胆固醇2％、胆酸钠0.5％)购自于南京森堡生物制品公司，改良油红O染色液购自北京索莱宝有限公司。

2.方法

2.1取材

分别在高脂4周及16周时，在体式显微镜下，分别取材小鼠心脏及小鼠主动脉。

2.2小鼠主动脉油红O染色

从甲醛溶液中去除标本，用流水洗15分钟，剥去外膜，再用蒸馏水浸洗；取储备液60ml加入蒸馏水至100ml,混均放置10分钟后染色，染色时间内2-4小时；用70％乙醇浸泡标本斑块呈红色，底色成白色位置，最后用蒸馏水浸泡，侵于甲醛溶液中保存。

2.3小鼠主动脉根部病理油红O染色

选择冰冻切片10微米，室温平衡5分钟，dd水反复冲洗5次；擦干片子，滴加60％异丙醇30-40秒，弃除液体；滴加油红O置于孵膜中35分钟，观察，看着色名明显后置于水中；滴加苏木染色3分钟，流水终止染色，镜下观察，并反蓝。

3.结果

病理显微镜下观察并拍照。结果如图1所示，说明模型建立成功。

实施例2：LncRNA-AFIAR在不同阶段动脉粥样硬化小鼠动脉组织中的表达

1.材料

1.1组织

本发明的Apoe^-/-小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物随机分组，分别于8周龄(NOR组)及24周龄(8周龄时开始高脂喂养16周，ADV组)取材主动脉。实验动物的使用得到了哈尔滨医科大学伦理委员会的批准。

1.2试剂

TRIzol Reagent购自美国Invitrogen公司。逆转录试剂盒(04897030001)购自德国Roche公司。荧光实时(Real-time)定量PCR(polymerase chain reaction)所用的SYBRGreen Master(ROX)试剂盒购自德国Roche公司。Real-Time PCR特异性引物由睿博兴科生物技术有限公司设计合成。lncRNA高通量测序由北京诺禾致源生物信息科技有限公司代理完成。

2.方法

2.1小鼠主动脉组织的lncRNA高通量测序技术

6个NOR组组织样本，6个ADV组组织样本，委托北京诺禾致源生物信息科技有限公司完成lncRNA高通量测序及后续分析相关工作。

2.2 LncRNA的Real-Time PCR检测

2.2.1总RNA提取

分别以8周龄(NOR组)及8个24周龄(8周龄时开始高脂喂养16周，ADV组)Apoe^-/-小鼠主动脉组织样本为对象，加入1毫升TRIzol Reagent。后用研磨器充分研磨，置于室温(15-30℃)是核蛋白复合物完全分离。3分钟后各加入0.2毫升氯仿，盖紧盖子，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟，于4℃条件下以12000r/min离心15分钟，后将上层无色水相转移(约0.5ml)至另一个1.5ml离心管中(注意不要吸到中间层)。每管加入0.5毫升异丙醇，室温静置5分钟，于4℃条件下以12000r/min离心10min，弃上清液。每管用1ml 75％乙醇洗涤RNA沉淀，充分抽吸是RNA与乙醇充分接触，于4℃条件下以12000r/min离心6min，弃上清液。每管用1ml 100％乙醇洗涤RNA沉淀，充分抽吸，于4℃条件下以12000r/min离心5min，弃上清液。空气干燥10分钟后，用无RNA酶的DEPC水溶解RNA，用移液器反复抽吸使RNA充分溶解。使用紫外分光光度计测定RNA浓度，RNA分装后可置于-80℃冰箱保存。

2.2.2引物设计

根据lncRNA-AFIAR的转录本序列，通过NCBI网站的引物设计工具(Primer BLAST)在线设计引物，上游引物：5-ATCAGGAGCAAGATGGGGGT-3(SEQ ID NO.2所示)，下游引物：5-TTCTGATCGCACAAGGCACT-3(SEQ ID NO.3所示)。

2.2.3逆转录反应

以提取的总RNA(1μg)为模板，加入下列反应体系，具体为Transcriptor ReverseTranscriptase(20U/μl)0.5μl，Transcriptor RT Reaction Buffer(5×)4μl，ProtectorRNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，Deoxynuc-leo-tide Mix 1μl，Random Hexamer Primer(600μM)1μl，以无RNA酶的DEPC水将反应体积补足为20μl。将上述反应液置于普通PCR仪中，经过25℃10min，55℃30min，85℃5min，4℃5min，即获得cDNA。该cDNA可用于lncRNA的Real-Time PCR检测。

按照德国Roche公司SYBR Green Master(ROX)试剂盒的说明书，将lncRNA-AFIAR特异性引物用无RNA酶的DEPC水溶解后，引物浓度调整为10μM。建立如下反应体系：SYBRGreen Master(ROX)10μl，无RNA酶的DEPC水7μl，PCR Forword Primer(10μM)0.5μl，PCRReverse Primer(10μM)0.5μl，稀释后的cDNA 2μl。以95℃10min预变性，按95℃15s变形、62℃20s退火过程循环40次，获得CT值。获得的CT值输入PCR计算器计算lncRNA-AFIAR相对表达含量。

3.结果

3.1 LncRNA高通量测序结果

通过高通量测序技术，获得8周龄(即NOR组)及24周龄(8周龄时开始高脂喂养16周，即ADV组)Apoe^-/-小鼠主动脉组织中差异表达的LncRNA(图2)，其中lncRNA-AFIAR(对应的DNA序列为SEQ ID NO.1所示)在ADV组的表达明显高于NOR组(图3)。

3.2 LncRNA高通量测序结果验证

为了验证lncRNA高通量测序结果，本发明对NOR及ADV两组样本进行lncRNA-AFIAR的Real-Time PCR检测，证实lncRNA-AFIAR在ADV组的表达明显高于NOR组(图4)，提示lncRNA-AFIAR可能在动脉粥样硬化进展过程中发挥调控作用，具有延缓动脉粥样硬化进展的治疗潜能。

实施例3：构建RAW264.7细胞lncRNA-AFIAR的沉默模型

1.材料

1.1细胞与siRNA

本发明所用的RAW264.7细胞购自中国科学院上海细胞库，细胞培养应用含有10％灭活胎牛血清(美国Science Cell公司)、青霉素(100U/mL)、链霉素(100μg/mL)的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。

设计有关沉默lncRNA-AFIAR(siRNA)序列，正义链(Sence):GCAGAUAACUCGUUAGCAAUU(SEQ ID NO.4所示)，反义链(Antisense):UUGCUAACGAGUUAUCUGCUU(SEQ ID NO.5所示)。小干扰RNA(siRNA)的设计和合成由苏州吉玛基因股份有限公司完成。

1.2试剂

小干扰RNA(siRNA)转染所用X-tremeGENE siRNA Transfection Reagent购自德国Roche公司；DMEM培养基购自Hyclone公司，青霉素、链霉素购自上海碧云天生物技术有限公司。其他试剂同实施例1。

2.方法

2.1 LncRNA-AFIAR在RAW264.7细胞中的表达

将RAW264.7细胞以2×10⁵/孔接种于6孔板，用含有10％血清的DMEM培养基培养。当细胞汇合度达到70％-80％时去除培养基，用X-tremeGENE siRNA TransfectionReagent与siRNA混合物转染RAW264.7细胞，6小时后吸弃培养基，加入新鲜的完全培养基。48小时后，通过实施例1中所述方法以Real-time PCR检测lncRNA在细胞中的表达情况。

3.结果

提取的RAW264.7细胞总RNA，通过Real-time PCR分析lncRNA-AFIAR的表达情况。si-AFIAR转染组相对于si-NC转染组，lncRNA-AFIAR的表达量显著降低，说明lncRNA-AFIAR的细胞沉默模型造模成功，从而为进一步研究lncRNA-AFIAR在RAW264.7细胞的功能中发挥的作用奠定了基础。

实施例4：LncRNA-AFIAR对RAW264.7细胞增殖及凋亡的调控作用

1.细胞

实验所用的细胞及培养方法同实施例3。

1.2试剂

实验所用siRNA同实施例3。EDU染色试剂盒购自广州锐博生物科技有限公司，Hochest33342染色试剂购自生工生物工程(上海)股份有限公司。4％多聚甲醛、0.5％Triton X-100渗透剂、2mg/mL甘氨酸溶液等试剂为本实验室自行配置。

2.方法

2.1 EDU实验

取对数期生长的细胞，接种24孔板，做实验时细胞密度在5％以下，用细胞培养基按1:1000比例稀释EDU溶液(试剂A)，纸杯50μM的EDU培养基。每孔加入300μL上述EDU培养基，孵育2小时，弃培养基，PBS洗细胞两次，每次5分钟。每孔加入150μL细胞固定液，室温孵育30分钟，弃固定液。后每孔加入150μL 2mg/mL甘氨酸，脱色摇床孵育5分钟后，弃甘氨酸溶液。后每孔加入200μL PBS，脱色摇床清洗5分钟，弃PBS。后每孔加入100μL渗透剂，脱色摇床孵育10分钟，PBS洗1次5分钟。按要求配置Appolo染色液，每孔加入100μL染液，避光，室温，摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。加入100μL渗透剂，脱色摇床清洗3次，每次10分钟，弃渗透剂。用去离子水按1:100比例稀释试剂F，制备1×Hochest33342反应液，避光保存。每孔加入100μL1×Hochest33342反应液，避光，室温脱色摇床孵育30分钟后，弃染色反应液。每孔加入100μL的PBS清洗2次。调试仪器，使曝光时间为30ms左右，尽量不要超过1s,拍照保存。

2.2 Hochest33342

取对数期生长的细胞，接种24孔板，做实验时细胞密度在5％以下，4％多聚甲醛固定30分钟，PBS洗两遍，加300μL Hochest33342染色液覆盖住样品，室温放置5分钟，吸除Hochest染色液，用PBS洗2次，每次5分钟。可直接在荧光显微镜下观察(蓝光)。细胞凋亡时，凋亡细胞的细胞核呈致密深染，或呈碎块状致密浓染。

3.结果

3.1 LncRNA-AFIAR对RAW264.7细胞增殖能力的影响

为了验证lncRNA-AFIAR是否影响RAW264.7细胞的增殖能力，本发明通过EDU检测了si-RNA转染细胞48小时后的细胞增殖情况，发现lncRNA-AFIAR沉默组细胞增殖受到明显抑制(图5)，提示lncRNA-AFIAR具有促进RAW264.7细胞增殖的能力。

3.2 LncRNA-AFIAR对RAW264.7细胞凋亡水平的影响

为了验证lncRNA-AFIAR是否影响RAW264.7细胞的凋亡水平，本发明通过Hochest33342检测了si-RNA转染细胞48小时后的细胞凋亡水平，发现lncRNA-AFIAR沉默组细胞的凋亡水平明显升高(图6)，提示lncRNA-AFIAR具有抑制RAW264.7细胞凋亡的能力。

实施例5：腺相关病毒AAV2/9-shRNA(AAV2/9-sh-AFIAR)对动脉粥样硬化小鼠斑块进展的作用。

1.材料

1.1腺相关病毒AAV2/9-NC(携带无关序列si-NC的腺相关病毒)、AAV2/9-sh-AFIAR(携带lncRNA-AFIAR的沉默序列的腺相关病毒)

本发明的应用的腺相关病毒AAV(AAV2/9-NC、AAV2/9-sh-AFIAR)的载体构建、病毒包装、收集和纯化，均来源于汉恒生物科技(上海)有限公司。病毒类型及滴度：AAV-GFP，2/9型，滴度1×10¹²vg/ml，注射量：100μl，注射部位：小鼠尾静脉，存放：负80度冰箱。

1.2动物

本发明的Apoe^-/-小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物随机分2组(AAV2/9-NC组、AAV2/9-sh-AFIAR组)，均于8周龄时开始高脂喂养16周，取材主动脉。实验动物的使用得到了哈尔滨医科大学伦理委员会的批准。

2.方法

2.1小鼠尾静脉注射

分别在小鼠8周龄时，给予两组小鼠尾静脉注射腺相关病毒AAV2/9-NC、AAV2/9-sh-AFIAR一次。具体操作：首先将小鼠固定好，尾巴伸直、绷紧；用酒精棉球擦拭尾巴，使尾静脉扩张，紧靠尾骨两侧可见2处红色静脉；用左手食指、中指、无名指和大拇指固定小鼠尾部；右手持1mL胰岛素注射针，针头斜面朝上，倾斜30度进针，缓慢推入药物。

2.1取材

分别在高脂16周时，在体式显微镜下，分别取材小鼠心脏及小鼠主动脉。

2.2鼠主动脉根部病理油红O染色

选择冰冻切片10微米，室温平衡5分钟，dd水反复冲洗5次；擦干片子，滴加60％异丙醇30-40秒，弃除液体；滴加油红O置于孵膜中35分钟，观察，看着色名明显后置于水中；滴加苏木染色3分钟，流水终止染色，镜下观察，并反蓝。

3.结果

腺相关病毒AAV2/9可以感染小鼠动脉粥样硬化斑块，AAV2/9-sh-AFIAR组使斑块内LncRNA-AFIAR表达下调，抑制板块内巨噬细胞的增殖。通过油红O对动脉粥样硬化斑块(红色)的染色，从而相较于AAV2/9-NC组，AAV2/9-sh-AFIAR组小鼠主动脉根部动脉粥样硬化斑块明显减少、变小。病理显微镜下观察并拍照(图7)。

序列表

<110> 哈尔滨医科大学

<120> 一种长链非编码RNA及其干扰RNA在治疗动脉粥样硬化中的应用

<130> KLPI190070

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 2279

<212> DNA

<213> AFIAR

<400> 1

actctcccgc tggctactgc tcatcaggag caagatgggg gtggggactg tccaatgatt 60

cctctgtgtg atagatgacc aagtggctgc agtcgtgggg gtctacacag cagtgcaaga 120

ttgtttgtag ctgatttgat caaactctgg cttcctgaac tggaatgaaa tgcagataac 180

tcgttagcaa acttttgtgg gaaaaaagtg ccttgtgcga tcagaacaaa gccgttttat 240

aatcagattt accaagctga gaagagggag tttcagcaaa tggaagcttc agctttctgt 300

caccaggaaa cactgcgtta tccagaatcg gaattgttaa agcatactga ctacaactgg 360

agacaaaaat ggaacctaag aaaataaaat cacttgggaa ggatgtgaat tcatatatct 420

tttctcttaa agttgttttg aaaagtaagt acttgccatt cctaattgtt tttgttttgc 480

tttttttttt tgtaatctga tactgaaagc gttgatttgt gcataaagta tatatagtta 540

ctgccatctg ggagtttgca ttttaagtga catggcatgg gtaagaacag acataaaaca 600

tatacacacc attatataga caactagact agatctagcc tgacaacaaa tggagcttga 660

tattcataga tcttacctga gtggatgtta tttcatgata tctgaaccct tgtccaaact 720

ctatatcatc tggcctgact agctagtgat gtattcctgt taacctttat attcttgttt 780

agcaagagtc ccatctgcat aaaagagtta cttcttttgt cattttggtt tggttcagct 840

gggagggata gcatcattgc ttcaggctga aatggactaa tctgtttcac ttgtgggtaa 900

ggagaaacga atactttgag aacagtgtgg cgtgggggag aaaggacaca attgctgcct 960

ttcatccttc cctgccctgg ctcaggatcc cagtgtggaa atggggatgc ttaggactta 1020

atgagcacat ttatttcctt ggatgagttg catagggaac caaaaggaag atgaagaaat 1080

ggacatgtag gaagtaggga agtcctaggg gagtgaagaa cccgttgctt tcaagcccag 1140

gtgtcagccc tttattctcc ctggtggctg ggacatgctg ccccacccct gcttccatcc 1200

tatgaatcaa gtgactgctt agaactgagc accactttgc tgagtaactg aggagagtga 1260

ggaattcaag aatggccttt taaggcacca ttttgtatga atcatcctgc gtacatctct 1320

ctactgaatc tacttctaga aatagagagc taccttcttg tcttgaagac aacagcacac 1380

attgtctgta agcattgtgt tgtgctcact ccttcctccg aggcctaatc tcctgtcctt 1440

ggtccttctt gtatgttccc tgaaatttcc ctctcctgcc atgtaaatcc agacaacttt 1500

ctgcctgcat tctatttctg cctttgaatt gagtctcttc gaaacaattg tgtggtggct 1560

gggcactgca aaatgagtca gttcctacag tttggttaca agttctcaaa aagtatttca 1620

gaatgtggat gtggtcagca gagtcatttt ccaggcatct aaaaggaaac ccacatcaac 1680

tgtaacaatt gagctctgac cggatggtgc catacaacag aaccaaggcc tattttctct 1740

tagagcaatg cctagagcca tacacgaatt tatctgctcc tagcacatct tcaatggaaa 1800

gtcttgttct tgtttgcagg tcacatttta tttgccacca tttgaaaaac aatgtgacac 1860

aggttttaac cttatttact tttggatgtt ggtctgaatt tgaaaaatta ttaattattt 1920

ttataaacta gaatcagtga gactagagta tgattagtag atgacttgaa gtatgactta 1980

tggatgaaaa gtgggtaatt tttctgagga ataaccaagg ggcactttta gatatcatgt 2040

agtacatagg attacctcat ttcctaatta tgttctggat ctttcagcgt tggtcatata 2100

aataattaaa ttcttttcaa gctttgaaga tgtttcaagc tcatcaacaa cagaatattt 2160

tagcttagca tgggctttag aaaaatcttt tgtggctatt tacttacttg tgtaccataa 2220

gttctgtaaa atctgattga gctggtcttc aaccattcat gaaagctgat gacattttc 2279

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 2

atcaggagca agatgggggt 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 3

ttctgatcgc acaaggcact 20

<210> 4

<211> 21

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 4

gcagauaacu cguuagcaau u 21

<210> 5

<211> 21

<212> RNA

<213> artificial sequence

<400> 5

uugcuaacga guuaucugcu u 21