阅读说明：本技术 一种基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂及其应用 (Acid indicator based on lycium ruthenicum anthocyanin extract and application thereof ) 是由 鄢明辉 游春苹 刘振民 桂敏 扶晓菲 赵磊 于 2019-11-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂及其应用,其制备方法为：(1)取黑果枸杞干果25-35g,经粉碎过筛后加入蒸馏水,室温下低速振荡提取2.5-3.5h,取出提取液,再次加入蒸馏水,在45-55℃低速振荡提取0.5-1.5h,取出提取液,将两次提取液合并后浓缩至1.3-1.4g/mL,即得花青素粗提液；(2)超滤、杀菌；(3)在杀菌后的花青素粗提液中加入无菌蒸馏水,洗去强极性组分后,洗脱,收集洗脱液,浓缩、干燥,得花青素提取物粉末,即为所述酸指示剂。本发明提供的酸指示剂能够在不同pH条件下呈现不同颜色,对酸较为敏感,肉眼可辨识度高,能表征出现有酸碱指示剂不能检测的微弱产酸。(The invention discloses an acid indicator based on an anthocyanin extract of lycium ruthenicum and application thereof, wherein the preparation method comprises the following steps: (1) taking 25-35g of lycium ruthenicum dry fruits, crushing and sieving the lycium ruthenicum dry fruits, adding distilled water, performing low-speed oscillation extraction at room temperature for 2.5-3.5h, taking out an extracting solution, adding distilled water again, performing low-speed oscillation extraction at 45-55 ℃ for 0.5-1.5h, taking out the extracting solution, combining the two extracting solutions, and concentrating to 1.3-1.4g/mL to obtain a crude anthocyanin extracting solution; (2) performing ultrafiltration and sterilization; (3) and adding sterile distilled water into the sterilized anthocyanin crude extract, washing away strong polar components, eluting, collecting eluent, concentrating and drying to obtain anthocyanin extract powder, namely the acid indicator. The acid indicator provided by the invention can present different colors under different pH conditions, is sensitive to acid, has high visual identification degree, and can represent weak acid production which cannot be detected by the existing acid-base indicator.)

一种基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂及其应用

技术领域

本发明涉及酸碱指示剂，具体涉及一种基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂及其应用。

背景技术

传统发酵食品具有对人体有健康益处的微生物，是现代食品工业重要的发酵剂来源。从传统食品等来源分离筛选具有优良发酵性能的菌种是现代乳品发酵剂研究的重要方向。现代食品及工业发酵中常用的菌种，如乳酸菌、醋酸菌、丙酸杆菌、丁酸梭菌等，都具有产酸的特性，利用产酸特性对其进行筛选及生长特性研究是现在食品发酵剂研究中的常用技术手段。传统的使用方法是在培养基中加入碳酸钙对微生物产酸进行指示，该方法面临的主要问题是对酸的敏感性不够高，且直观上区分困难，也不属于食品上安全可用的酸指示剂。江苏耐雀生物工程技术有限公司及北京化工大学等开发了新型的、来源天然安全的酸碱指示剂，例如专利号为ZL201310280878.0及ZL201610343407.3的发明专利，虽然实现了对酸的检测指示，但其对酸的敏感性均有待提升。

发明内容

针对现状，为解决现有技术中的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种能够在不同pH条件下呈现不同颜色的酸指示剂，其基于水溶性花青素提取物制备而成，该提取物来自黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murray)，特别地，该提取物对酸较为敏感，当pH值降至4.5以下，就会出现明显的红色。相比传统的基于碳酸钙的酸指示剂，该提取物天然安全、对酸更为敏感且肉眼可辨识度高，能表征出现有酸碱指示剂不能检测的微弱产酸。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂，其制备方法包括如下步骤：

(1)花青素粗提液的制备：取黑果枸杞干果25-35g，经粉碎过筛后，加入蒸馏水，室温下低速振荡提取2.5-3.5h，取出提取液，再次加入蒸馏水，保温在45-55℃低速振荡提取0.5-1.5h，取出提取液，将两次所得提取液合并后在50-60℃下浓缩至浓度1.3-1.4g/mL，即得花青素粗提液；

(2)杀菌：将花青素粗提液经滤膜超滤后进行杀菌；

(3)纯化：在杀菌后的花青素粗提液中加入无菌蒸馏水，上样至大孔树脂，洗去强极性组分后，以体积浓度为60-80％的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩、冷冻干燥，得花青素提取物粉末，即为基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂。

黑枸杞中矮牵牛素及其衍生物(主要成分是矮牵牛花色苷)占总花青素及其衍生物的95％，矮牵牛花色苷相比于其他种类的花青素对酸更为敏感，更易表征出微弱产酸；黑枸杞干果经水浸泡后即呈酸性或弱酸性，在加水浸泡及提取过程中，黑枸杞中的大量原花青素会分解成单体花青素，经历两次提取，能够有效提高花青素提取效率，并且本发明在第二次提取时适当地提高了温度，试验证明，进一步提高了提取效率。

不同种类的枸杞中虽然都含有花青素，但是花青素的类别不同，且不同类别的比例也不同，试验证明，其他常见种类的枸杞提取物对酸的响应范围及敏感性均不及黑果枸杞提取物。

在上述基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂中，优选地，步骤(1) 中的黑果枸杞干果产自青藏高原，优选青海。

在上述基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂中，优选地，步骤(1) 中粉碎时粉碎机转速为900-1100r/min，进一步优选1000r/min，筛网目数为10-30目，进一步优选20目。

在上述基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂中，优选地，步骤(1) 中低速振荡的转速为40-60rpm，进一步优选50rpm。

在上述基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂中，优选地，步骤(1) 中的浓缩采用真空减压浓缩。

在上述基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂中，优选地，步骤(2) 中的滤膜孔径为0.22μm。

在上述基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂中，优选地，步骤(2) 中臭氧杀菌的条件为：臭氧量为3-5mg/m³，杀菌时间为20-40min；进一步优选地，臭氧杀菌的条件为：臭氧量为4mg/m³，杀菌时间为30min。

在上述基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂中，优选地，步骤(3) 中，在杀菌后的粗提液中加入无菌蒸馏水至10mL，上样至AB-8大孔树脂，以2倍柱体积的去离子水洗去强极性组分后，以乙醇水溶液洗脱，洗脱条件为：pH 2.0，流速2.0mL/min。

优选地，所述基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂的使用方法为：

将花青素提取物粉末溶解于水溶液中，使花青素提取物浓度为0.015- 0.05％(w/v)，所得酸指示剂在不同pH条件下的颜色变化为：当pH<5.0时呈现红色，当5.0<pH<7.0时呈现紫色，当pH>7.0时呈现蓝色，然后迅速变为黄色。

花青素提取物浓度为0.015-0.05％(w/v)时，不同pH条件下的颜色变化在感官上比较明显及悦目，在该浓度范围之外时，不同pH仍然能够呈现相应的颜色，但是感官上不及上述浓度时的状态。

本发明的目的之二是提供一种上述酸指示剂在产酸菌种筛选中的的应用。

优选地，所述产酸菌种为乳酸菌、醋酸菌、丙酸杆菌、丁酸菌中的一种或多种。

需要说明的是，如果没有特殊说明，本发明所采用的各种试剂、原料均、设备均能够通过市场购买而得。

从传统食品等来源分离筛选发酵菌种是目前食品领域的一个重要研究方向，现有技术中的文献及发明专利从特定生理功能(如耐酸性、降胆固醇、抗氧化性等益生特性)的角度对细菌进行筛选，偏重生理功能，但对于生长及发酵特性，尤其是在特定的食品介质中的发酵及产酸的特性关注不够，这可能为这些菌种后期的产业化应用带来限制。

本发明与现有技术相比，其有益效果是：

(1)本发明提供的酸指示剂能够简便、快速、直观地筛选出具有产酸特性的细菌，包括常规指示剂不能检测的微弱产酸，如现代食品及工业发酵中常用的发酵菌种，包括乳酸菌、醋酸菌、丙酸杆菌、丁酸菌等，能够大大地提高上述发酵菌种的筛选效率，从而推动新型食品发酵剂的开发；

(2)本发明中的花青素提取物采用纯净水浸提，其制备工艺简单，使用方便、直观，该提取物来自黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murray)，在不同pH值条件下会呈现不同的颜色，该提取物对酸较为敏感，当pH<4.5 时，就会出现明显的红色；相比传统的基于碳酸钙的酸指示剂，该提取物天然安全、对酸更为敏感且肉眼可辨识度高；相比江苏耐雀生物工程技术有限公司及北京化工大学等开发的酸碱指示剂，该提取物对酸更为敏感，能表征出上述指示剂不能检测的微弱产酸。

附图说明

图1为花青素提取物在不同pH条件下的颜色变化图；

图2为花青素提取物分子结构式在不同pH条件下的变化示意图；

图3为在用花青素提取物筛选乳酸菌时乳酸菌在乳平板上生长出现颜色变化的示意图。

具体实施方式

下面将对本发明进行更详细地描述，应该注意的是，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

实施例1黑枸杞花青素提取物的制备

本实施例提供的基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂的制备方法包括如下步骤：

(1)花青素粗提液的制备：取黑果枸杞干果(购自青海诺蓝杞)30g，在1000r/min下经粉碎机粉碎后过20目筛，加入5mL(即0.5倍柱体积)蒸馏水，室温(25℃)下低速(50rpm)振荡提取3h后，取出提取液，再次加入蒸馏水(分两次加入，每次100mL)，保温在50℃低速(50rpm)振荡提取1h，取出提取液，将两次所得提取液合并后在50℃下真空减压浓缩至浓度1.3g/mL，即得花青素粗提液；

(2)杀菌：将花青素粗提液经0.22μm的滤膜超滤后进行臭氧杀菌，杀菌条件为：臭氧量为4mg/m³，杀菌30min；

(3)纯化：在杀菌后的花青素粗提液中加入无菌蒸馏水至10mL，上样至AB-8大孔树脂(5×30cm)，以2倍柱体积的去离子水洗去强极性组分(主要是无机盐等杂质)后，使花青素组分以体积浓度为70％的乙醇水溶液洗脱，洗脱条件为：pH 2.0，流速2.0mL/min，收集洗脱液，并进行真空减压浓缩、冷冻干燥后备用，即花青素提取物粉末，即为基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂。

实施例2

本实施例提供的基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂的制备方法包括如下步骤：

(1)花青素粗提液的制备：取黑果枸杞干果(购自青海诺蓝杞)25g，在1100r/min下经粉碎机粉碎后过10目筛，加入5mL(即0.5倍柱体积)蒸馏水，室温(25℃)下低速(40rpm)振荡提取2.5h后，取出提取液，再次加入蒸馏水(分两次加入，每次100mL)，保温在45℃低速(40rpm) 振荡提取0.5h，取出提取液，将两次所得提取液合并后在60℃下真空减压浓缩至浓度1.4g/mL，即得花青素粗提液；

(2)杀菌：将花青素粗提液经0.22μm的滤膜超滤后进行臭氧杀菌，杀菌条件为：臭氧量为3mg/m³，杀菌40min；

(3)纯化：在杀菌后的花青素粗提液中加入无菌蒸馏水至10mL，上样至AB-8大孔树脂(5×30cm)，以2倍柱体积的去离子水洗去强极性组分(主要是无机盐等杂质)后，使花青素组分以体积浓度为60％的乙醇水溶液洗脱，洗脱条件为：pH 2.0，流速2.0mL/min，收集洗脱液，并进行真空减压浓缩、冷冻干燥后备用，即花青素提取物粉末，即为基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂。

实施例3

本实施例提供的基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂的制备方法包括如下步骤：

(1)花青素粗提液的制备：取黑果枸杞干果(购自青海诺蓝杞)35g，在900r/min下经粉碎机粉碎后过30目筛，加入5mL(即0.5倍柱体积)蒸馏水，室温(25℃)下低速(60rpm)振荡提取3.5h后，取出提取液，再次加入蒸馏水(分两次加入，每次100mL)，保温在55℃低速(60rpm) 振荡提取1.5h，取出提取液，将两次所得提取液合并后在55℃下真空减压浓缩至浓度1.35g/mL，即得花青素粗提液；

(2)杀菌：将花青素粗提液经0.22μm的滤膜超滤后进行臭氧杀菌，杀菌条件为：臭氧量为5mg/m³，杀菌20min；

(3)纯化：在杀菌后的花青素粗提液中加入无菌蒸馏水至10mL，上样至AB-8大孔树脂(5×30cm)，以2倍柱体积的去离子水洗去强极性组分(主要是无机盐等杂质)后，使花青素组分以体积浓度为80％的乙醇水溶液洗脱，洗脱条件为：pH 2.0，流速2.0mL/min，收集洗脱液，并进行真空减压浓缩、冷冻干燥后备用，即花青素提取物粉末，即为基于黑枸杞花青素提取物的酸指示剂。

为了说明本发明提供的黑枸杞花青素提取物的作用，申请人进行了如下实验：

实验例1黑枸杞花青素提取物对于酸的相应(颜色变化)

将实施例1中的花青素提取物粉末以0.015％w/v的终浓度溶解于不同pH条件的水溶液中，观察其在不同pH条件的颜色变化，结果如图1 所示，图1表明了本发明中的花青素提取物的颜色随pH条件的规律，其中，粗短线表示正常条件下牛乳的pH范围(6.0-7.0)，带箭头横线表示该花青素提取物对酸的指示pH范围；花青素提取物的分子结构及其不同形态之间的转化如图2所示；由图1-2可知，该花青素提取物在不同的pH 条件下会呈现出不同的颜色，具体地，当pH<5.0时呈现红色，当pH<4.5 时呈现显著的红色，当5.0<pH<7.0时呈现紫色，当pH>7.0时呈现蓝色，但不稳定，很快氧化变为黄色，该实验说明，该花青素提取物对酸较为敏感，有望用于微弱产酸的微生物的分离筛选。

由图2可知，花青素提取物在pH<5.0的水溶液中的分子结构式为：

花青素提取物在5.0<pH<7.0的水溶液中的分子结构式为：

花青素提取物在pH>7.0的水溶液中的分子结构式为：

将实施例2及实施例3中制得的酸指示剂粉末溶解于水溶液中，使花青素提取物浓度为0.015-0.05％(w/v)，例如0.015％(w/v)、0.01％(w/v)、 0.02％(w/v)、0.03％(w/v)、0.04％(w/v)、0.05％(w/v)，在不同pH条件下的颜色变化也较为明显及悦目，便于本领域技术人员肉眼分辨，且显色规律同上，不再赘述。

实验例2黑枸杞花青素提取物对于乳酸的响应

以乳酸及乳酸菌、实施例1中的花青素提取物粉末为例，说明该提取物在产酸微生物的分离筛选中的应用潜力。在做平板筛选时，乳酸菌会将乳酸分泌到菌落周围，从而降低菌落局部区域的pH值。当pH值降至酸指示剂响应范围内时即会出现颜色变化。

不同浓度的乳酸对应的pH值如表1所示，结合该花青素提取物对酸度的相应特点分析，应用该花青素提取物可以以显著的颜色变化检测出低至0.0001mol/L的乳酸，此时乳酸对应的pH值<4.0，花青素提取物呈现明亮的红色。

表1.不同浓度乳酸对应的pH值

实验例3乳品发酵所需的乳酸菌的筛选

以江南地区的特色泡菜为例，从中筛选能在乳中生长并且产酸的乳酸菌，以期应用于乳品发酵，具体筛选过程如下：

(1)所用的生长指示型筛选平板的制备：称取脱脂乳粉10g，加入蒸馏水100mL，充分溶解后，在100℃、15min灭菌；称取琼脂粉1.5g，加入蒸馏水100mL，充分混匀后，在100℃、15min灭菌；灭菌后冷却至 60℃，取灭菌脱脂乳液10mL加入琼脂粉溶液，轻轻摇晃混匀，再加入终浓度为0.025％-0.05％的花青素提取物(用移液枪缓慢加入，边加入边轻轻摇晃)，充分混匀后倒至平板，平板经自然凝固、冷却后备用。

(2)取江南特色泡菜的泡菜汁1mL，以无菌蒸馏水进行稀释100倍后均匀涂布于步骤(1)的乳平板上，置于厌氧培养箱(35℃)中培养过夜，期间注意乳平板颜色的变化情况。

(3)经培养24h后，乳平板上有一个菌落出现颜色变化，如图3所示，推测该菌落为能在乳中生长的乳酸菌。

上述实验表明，本发明中获得的花青素提取物可以作为指示剂用于乳酸菌的分离筛选，该指示剂有望给乳品发酵菌种的筛选带来便利，推动新型发酵乳制品的研发。

本发明获得的花青素提取物还可用于醋酸菌、丙酸杆菌、丁酸菌等产酸菌种的筛选，满足花青素提取物浓度为0.015-0.05％(w/v)即可。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明实质内容上所作的任何修改、等同替换和简单改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。