阅读说明：本技术 一种甲胎蛋白免疫层析试纸条及其制备方法和应用 (Alpha fetoprotein immunochromatographic test strip and preparation method and application thereof ) 是由 冯涛 陈国动 周慧 张楠 朱红甜 于 2019-11-28 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种甲胎蛋白免疫层析试纸条及其制备方法和应用,所述甲胎蛋白免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫和背衬板,所述结合垫上结合有复合荧光微球探针,所述复合荧光微球探针为甲胎蛋白单克隆抗体与碳纳米管以及水溶性量子点形成的微球探针,所述硝酸纤维素膜上检测线和质控线,其中检测线上含有甲胎蛋白抗体,所述质控线上含有羊抗鼠IgG。本发明的甲胎蛋白免疫层析试纸条制备方法简单、易操作,所述甲胎蛋白免疫层析试纸条用于甲胎蛋白检测荧光强度显著增强,检测准确,灵敏度明显增强,最低检测限为0.02ng/mL。(The invention provides an alpha fetoprotein immunochromatographic test strip and a preparation method and application thereof, the alpha fetoprotein immunochromatographic test strip comprises a sample pad, a combination pad, a nitrocellulose membrane, a water absorption pad and a backing plate, wherein a composite fluorescent microsphere probe is combined on the combination pad, the composite fluorescent microsphere probe is a microsphere probe formed by an alpha fetoprotein monoclonal antibody, a carbon nano tube and water-soluble quantum dots, a detection line and a quality control line are arranged on the nitrocellulose membrane, the detection line contains an alpha fetoprotein antibody, and the quality control line contains goat anti-mouse IgG. The alpha fetoprotein immunochromatographic test strip is simple in preparation method and easy to operate, the fluorescence intensity of the alpha fetoprotein detection is obviously enhanced, the detection is accurate, the sensitivity is obviously enhanced, and the minimum detection limit is 0.02 ng/mL.)

一种甲胎蛋白免疫层析试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，涉及一种甲胎蛋白免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

背景技术

原发性肝癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，其在全球的发病率呈上升趋势，对于原发性肝癌的准确诊断对于肝癌的治疗具有重要意义。

甲胎蛋白是诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标，目前，对甲胎蛋白的检测主要采用免疫测定法，CN103558396A公开了一种甲胎蛋白的定量检测方法，该方法由以下步骤组成：(1)将甲胎蛋白抗体与醛化糖化酶溶液混合制备酶标抗体；将甲胎蛋白抗体负载到纳米金磁微粒上；(2)甲胎蛋白抗原样品和一系列不同浓度的甲胎蛋白抗原标准品加入到负载抗体的纳米金磁微粒的免疫反应界面中进行温育，然后用血糖仪测得葡萄糖浓度，从而得到甲胎蛋白浓度与葡萄糖浓度对应关系的线性方程，最后将甲胎蛋白抗原样品的葡萄糖浓度值代入线性方程中换算出甲胎蛋白抗原样品的甲胎蛋白浓度。

CN108709914A公开了一种快速检测甲胎蛋白的方法，所述方法首先在纸基材料上涂覆单臂碳纳米管甲胎蛋白抗体分散液，利用甲胎蛋白与其抗体特异性结合的特点，根据抗体和抗原结合前后纸基传感器的电阻变化，则定纸基碳纳米管传感器的电阻，通过记录一定时间内传感器电阻的变化，来对目标抗原含量进行测定实现对甲胎蛋白的检测。

这些检测方法虽然能够实现甲胎蛋白的检测，但是其操作复杂，时间成本也比较大，因此，在本领域中，期望能够开发一种简单且能够快速检测甲胎蛋白的方法。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种甲胎蛋白免疫层析试纸条及其制备方法和应用。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种甲胎蛋白免疫层析试纸条，所述甲胎蛋白免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫和背衬板，所述结合垫上结合有复合荧光微球探针，所述复合荧光微球探针为甲胎蛋白单克隆抗体与碳纳米管以及水溶性量子点形成的微球探针，所述硝酸纤维素膜上检测线和质控线，其中检测线上含有甲胎蛋白抗体，所述质控线上含有羊抗鼠IgG。

在本发明中，以甲胎蛋白单克隆抗体与碳纳米管以及水溶性量子点形成的微球探针开发出的甲胎蛋白免疫层析试纸条，以碳纳米管为核心，偶联有水溶性量子点以及甲胎蛋白单克隆抗体，碳纳米管表面结合大量的水溶性量子点，使得荧光强度显著增强，这样的试纸条其检测甲胎蛋白的灵敏度明显增强。

优选地，所述碳纳米管为多壁碳纳米管或者单壁碳纳米管。

优选地，所述水溶性量子点为羧基包覆的CdTe量子点或羧基包覆的CdTe/ZnSe核壳量子点。

在本发明中，所述羧基包覆的CdTe量子点或羧基包覆的CdTe/ZnSe核壳量子点可以通过现有技术制备得到。

优选地，所述复合荧光微球探针的制备方法为：将氨基化碳纳米管与甲胎蛋白单克隆抗体在缩合剂的作用下37℃孵育，离心，将离心后的沉淀物复溶，加入缩合剂及羧基化水溶性量子点，37℃孵育，离心，得到所述复合荧光微球探针。

优选地，所述氨基化碳纳米管与甲胎蛋白单克隆抗体在缩合剂的作用下37℃孵育时，所用的缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述将氨基化碳纳米管与甲胎蛋白单克隆抗体在缩合剂的作用下37℃孵育的时间为30min-2h，例如30min、35min、45min、1h、1.2h、1.5h、1.8h或2h。

优选地，所述加入缩合剂及羧基化水溶性量子点时，所用的缩合剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、N-羟基硫代琥珀酰亚胺中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述加入缩合剂及羧基化水溶性量子点，37℃孵育的时间为30min-2h，例如30min、35min、45min、1h、1.2h、1.5h、1.8h或2h。

另一方面，本发明提供了一种如上所述的甲胎蛋白免疫层析试纸条的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

将复合荧光微球探针喷涂在结合垫上得到喷涂有复合荧光微球探针的结合垫，而后将甲胎蛋白抗体和羊抗鼠IgG分别划线至硝酸纤维素膜上得到检测线和质控线，将样品垫、喷涂有复合荧光微球探针的结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫组装在背板上，得到所述甲胎蛋白免疫层析试纸条。

优选地，所述划线利用划膜仪进行。

在本发明中，所述甲胎蛋白免疫层析试纸条的制备方法简单，高效，易于操作。

另一方面，本发明提供了一种如上所述的甲胎蛋白免疫层析试纸条在制备甲胎蛋白检测装置中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所述的甲胎蛋白免疫层析试纸条以甲胎蛋白单克隆抗体与碳纳米管以及水溶性量子点形成的微球探针开发出的甲胎蛋白免疫层析试纸条，以碳纳米管为核心，偶联有水溶性量子点以及甲胎蛋白单克隆抗体，碳纳米管表面结合大量的水溶性量子点，使得荧光强度显著增强，检测准确，其检测甲胎蛋白的灵敏度明显增强，最低检测限为0.02ng/mL。

附图说明

图1为本发明所述甲胎蛋白免疫层析试纸条的结构示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

在本实施例中，提供一种甲胎蛋白免疫层析试纸条，所述甲胎蛋白免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫和背衬板，所述结合垫上结合有复合荧光微球探针，所述复合荧光微球探针为甲胎蛋白单克隆抗体与多壁碳纳米管以及水溶性量子点羧基包覆的CdTe量子点形成的微球探针，所述硝酸纤维素膜上检测线和质控线，其中检测线上含有甲胎蛋白抗体，所述质控线上含有羊抗鼠IgG。其结构示意图如图1所示。

其中，所述羧基包覆的CdTe量子点的制备方法为：在氮气饱和的244mL浓度为2×10^-2mol/LCdCl₂·2.5H₂O溶液(114.2mg)中加入104.4μL巯基丙酸，用1mol/LNaOH调溶液的pH在9.2左右。注入新鲜制备的NaHTe，剧烈搅拌下用N₂脱氧20min，然后迅速加入上述新制备的碲氢化钠溶液注入反应体系，100℃下氮气保护回流2h，得到羧基包覆的CdTe量子点。

所述复合荧光微球探针的制备方法为：将0.02g氨基化碳纳米管用PBS(pH＝7.4)溶液分散，用0.1mL EDC与0.15mL NHS活化10min，而后加入100mL甲胎蛋白单克隆抗体，37℃孵育1h，离心除去未结合的抗体以及其他杂质，将离心后的沉淀物用PBS(pH＝7.4)溶液复溶，用0.1mL EDC与0.15mL NHS活化10min，加入5mL羧基包覆的CdTe量子点，37℃孵育1h，离心去除游离的量子点和杂质，将沉淀物用含有BSA、蔗糖、PEG20000、吐温-80、叠氮钠等物质的PBS(pH＝8.0)复溶，4℃冰箱保存备用。

将复合荧光微球探针喷涂在结合垫上得到喷涂有复合荧光微球探针的结合垫，而后将甲胎蛋白抗体和羊抗鼠IgG利用划膜仪分别划线至硝酸纤维素膜上得到检测线和质控线，将样品垫、喷涂有复合荧光微球探针的结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫组装在背板上，得到所述甲胎蛋白免疫层析试纸条。

实施例2

在本实施例中，提供一种甲胎蛋白免疫层析试纸条，所述甲胎蛋白免疫层析试纸条包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫和背衬板，所述结合垫上结合有复合荧光微球探针，所述复合荧光微球探针为甲胎蛋白单克隆抗体与多壁碳纳米管以及水溶性量子点羧基包覆的CdTe/ZnSe核壳量子点形成的微球探针，所述硝酸纤维素膜上检测线和质控线，其中检测线上含有甲胎蛋白抗体，所述质控线上含有羊抗鼠IgG。其结构示意图如图1所示。

其中，所述羧基包覆的CdTe/ZnSe核壳量子点的制备方法为：在高温有机相中合成油溶性CdTe/CdSe核壳型量子点，然后用MPA进行配体交换，将油溶性量子点转移至水相。得到羧基包覆的水溶性CdTe/CdSe量子点。

所述复合荧光微球探针的制备方法为：将0.02g氨基化碳纳米管用PBS(pH＝7.4)溶液分散，用0.1mL EDC与0.2mL NHS活化10min，而后加入100mL甲胎蛋白单克隆抗体，37℃孵育1h，离心除去未结合的抗体以及其他杂质，将离心后的沉淀物用PBS(pH＝7.4)溶液复溶，用0.1mL EDC与0.2mL NHS活化10min，加入5mL羧基包覆的CdTe/ZnSe核壳量子点，37℃孵育1h，离心去除游离的量子点和杂质，将沉淀物用含有BSA、蔗糖、PEG20000、吐温-80、叠氮钠等物质的PBS(pH＝8.0)复溶，4℃冰箱保存备用。

将复合荧光微球探针喷涂在结合垫上得到喷涂有复合荧光微球探针的结合垫，而后将甲胎蛋白抗体和羊抗鼠IgG利用划膜仪分别划线至硝酸纤维素膜上得到检测线和质控线，将样品垫、喷涂有复合荧光微球探针的结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫组装在背板上，得到所述甲胎蛋白免疫层析试纸条。

实施例3

在本实施例中利用实施例1和实施例2的甲胎蛋白免疫层析试纸条进行半定量和定量检测。

半定量检测：将待检测的样品滴加至样品垫上，待测样品会再吸水垫的作用下，沿着结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫的方向进行层析扩展，检测线出现红色线条为阳性，否则为阴性，如果质控线不显红色，则检测无效。

配置一系列甲胎蛋白标准溶液：0ng/mL、0.001ng/mL、0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.05ng/mL、0.1ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL，然后分别滴加到实施例1和实施例2的甲胎蛋白免疫层析试纸条的样品垫上进行检测，每个浓度下平均进行试验5次，观察显色情况，其显色结果如下表1所示。

表1

根据表1的结果初步判定，本发明的甲胎蛋白免疫层析试纸条的最低检测限为0.02ng/mL。

本实施例可以实现甲胎蛋白的定量检测，其检测方法为：

定量检测：配置一系列甲胎蛋白标准溶液：0ng/ml、0.005ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.03ng/mL、0.04ng/mL、0.08ng/mL、0.5ng/mL、0.8ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL，然后分别滴加到实施例1和实施例2的甲胎蛋白免疫层析试纸条的样品垫上，15分钟后于反射式紫外暗箱中用奥林巴斯相机拍照，然后将照片导入电脑中，用photoshop软件处理为灰度，然后用Scion Image软件将条带转换为峰值信号，分别将各峰面积对应浓度做标准曲线，得到峰面积与浓度对应公式，将检测样品同样处理，可得到峰面积，根据公式可以得知样品中甲胎蛋白含量。

根据这样的检测方法，配置已知浓度的甲胎蛋白样品溶液，其中1号待检测样品中甲胎蛋白样品的浓度为0.02ng/mL，2号待检测样品中甲胎蛋白样品的浓度为0.05ng/mL，3号待检测样品中甲胎蛋白样品的浓度为0.5ng/mL，4号待检测样品中甲胎蛋白样品的浓度为12ng/mL，5号待检测样品中甲胎蛋白样品的浓度为50ng/mL，将待检测样品分别滴加到实施例1和实施例2的甲胎蛋白免疫层析试纸条的样品垫上，15分钟后于反射式紫外暗箱中用奥林巴斯相机拍照，然后将照片导入电脑中，用photoshop软件处理为灰度，然后用ScionImage软件将条带转换为峰值信号，将给信号值代入标准曲线中，得到甲胎蛋白含量，结果如表2所示。

表2

通过表2可以看出，本发明所述的甲胎蛋白免疫层析试纸条能够很好地进行定量检测，其检测准确度高。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的甲胎蛋白免疫层析试纸条及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。