阅读说明：本技术 降低ldl-胆固醇的细胞提取物和食品补充剂 (Cellular extracts and food supplements for lowering LDL-cholesterol ) 是由 鲁迪·瓦提兹 菲利斯·马斯特罗里奥 罗伯特斯·克里斯蒂安·约瑟夫斯·萨特斯 于 2018-06-14 设计创作，主要内容包括：本发明涉及降低低密度脂蛋白(LDL)-胆固醇的制剂,具体涉及用作用于降低血浆LDL-胆固醇水平的药物的细菌细胞提取物,其中在将所述细胞与所述混合物混合时,在8℃至37℃下提取10分钟至48小时获得所述提取物,以及其中用10:1至1:10体积比的具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物提取所述降低ldl-胆固醇的细胞提取物和食品补充剂降低ldl-胆固醇的细胞提取物和食品补充剂深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)细胞。更具体地,本发明涉及通过用具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物提取深红红螺菌细胞而可获得的深红红螺菌的石油醚提取物。本发明还涉及本发明的深红红螺菌的石油醚提取物,其用于降低个体血浆中的LDL-胆固醇的方法中。本发明还涉及药物制剂、含有所述制剂的食品补充剂、含有所述食品补充剂的食品以及它们的制备方法。(The present invention relates to a formulation for reducing Low Density Lipoprotein (LDL) -cholesterol, in particular to a bacterial cell extract for use as a medicament for reducing plasma LDL-cholesterol levels, wherein said extract is obtained by extraction at 8 ℃ to 37 ℃ for 10 minutes to 48 hours when mixing said cells with said mixture, and wherein said LDL-cholesterol reducing cell extract and food supplement Rhodospirillum rubrum (Rhodospirillum rubrum) cells are extracted with a mixture of petroleum ether having a boiling point of 60 ℃ to 80 ℃ and sodium chloride containing methanol in a volume ratio of 10:1 to 1: 10. More specifically, the present invention relates to a petroleum ether extract of rhodospirillum rubrum obtainable by extracting cells of rhodospirillum rubrum with a mixture of petroleum ether having a boiling point of 60 ℃ to 80 ℃ and methanol comprising sodium chloride. The invention also relates to a petroleum ether extract of rhodospirillum rubrum of the invention for use in a method of reducing LDL-cholesterol in the plasma of an individual. The invention also relates to pharmaceutical formulations, food supplements containing said formulations, food products containing said food supplements and methods for their preparation.)

具体实施方式

红螺菌属是红螺菌科中的一个属，所述红螺菌科是红螺菌目和α-变形菌纲的紫色非硫细菌的一个科。除了其他特征以外，红螺菌科的特征在于是光营养的，既可以有氧生长又可以厌氧生长，使用光作为能源。为此目的，细菌含有叶绿素b。在红螺菌属内，区分出若干物种，例如深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、世纪红螺菌(Rhodospirillumcentenum)、度光红螺菌(Rhodospirillum photometricum)、米红螺菌(Rhodospirillumoryzae)、需硫红螺菌(Rhodospirillum sulfurexigens)、需盐红螺菌(Rhodospirillumsalexigens)、盐场红螺菌(Rhodospirillum salinarum)、好盐红螺菌(Rhodospirillumsodomense)和纤细红螺菌(Rhodospirillum tenue)。

深红红螺菌可见于天然水中、泥浆中和污水处理车间中等。细菌用在污水纯化中，用于动物食品的生物质生产(例如作为家禽和鱼的饲料)以及作为肥料。由于高的维生素和氨基酸含量，光氧菌的生物质被认为是用于动物饲料的优良的原材料。

将深红红螺菌用作动物饲料已经实施了一段时间。已经发现，深红红螺菌细胞可以通过降低血浆和/或血清(血液)中的胆固醇水平，对心脑血管疾病的预防做出重要贡献。

降低胆固醇的性能在本文中被定义为当施用于个体(例如动物个体，如人个体)的身体时，组合物例如细胞提取物、药物组合物、制剂、食品补充剂或食品降低所述个体的血液中的胆固醇水平或LDL-胆固醇水平的能力。用于测量血液中胆固醇水平的方法是技术人员已知的。

本发明的第一方面涉及通过用具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物提取深红红螺菌细胞而获得的深红红螺菌的石油醚提取物。

本发明的其它方面涉及通过用具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物提取深红红螺菌细胞而可获得的深红红螺菌的石油醚提取物，其中在将所述细胞与所述混合物混合时，在8℃至37℃下提取10分钟至48小时获得所述提取物，以及其中用以10:1至1:10体积比的具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物提取所述深红红螺菌细胞。

在整个说明书中，术语“具有60℃至80℃的沸点的石油醚”具有其常规的科学含义并且在此是指由脂肪烃组成并且在60℃至80℃沸腾的石油组分。

红螺菌的制剂在本文被定义为已经以某种方式加工的一定量的红螺菌的细胞物质。根据本发明，红螺菌的制剂是具有降低胆固醇性能的石油醚提取物，例如根据本发明，通过用具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物提取深红红螺菌细胞而获得的深红红螺菌的石油醚提取物。

根据本发明的制剂由从来自红螺菌属的一个菌种中得到的石油醚提取物组成，或者根据本发明的制剂由从不同的红螺菌的混合物中得到的石油醚提取物组成，所述红螺菌选自例如，深红红螺菌、世纪红螺菌、度光红螺菌、米红螺菌、需硫红螺菌、需盐红螺菌、盐场红螺菌、好盐红螺菌和纤细红螺菌。

褐螺菌属(Phaeospirillum)是红螺菌科的另一个成员，该属包括微黄褐螺菌(Phaeospirillum fulvum)、Phaeospirillum chandramohanii、米褐螺菌(Phaeospirillumoryzae)、Phaeospirillum tilakii和莫氏褐螺菌(Phaeospirillum molischianum)。因此，可替代地，根据本发明的制剂由从来自褐螺菌属的一个菌种中得到的石油醚提取物组成，或者根据本发明的制剂由从不同的褐螺菌的混合物中得到的石油醚提取物组成，所述褐螺菌选自例如，微黄褐螺菌、Phaeospirillum chandramohanii、米褐螺菌、Phaeospirillumtilakii和莫氏褐螺菌。

当然，根据本发明的其他可替代的制剂由来自褐螺菌属的至少一个菌种和来自红螺菌属的至少一个菌种得到的石油醚提取物组成。

优选地，红螺菌和/或褐螺菌的制剂包括深红红螺菌和/或莫氏褐螺菌的石油醚提取物，更优选地菌种深红红螺菌菌株ATCC 11170(菌株DSM 467)或菌株ATCC 25903和/或莫氏褐螺菌菌株DSM 120(ATCC，美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)；DSMZ，德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismenund Zellkulturen))的石油醚提取物。

根据本发明的红螺菌和/或褐螺菌的制剂可以含有20-100％(w/w)，优选40-100％(w/w)，甚至更优选60-100％(w/w)，以及最佳地80-100％(w/w)的来自红螺菌和/或褐螺菌的细胞物质，所述细胞物质是根据本发明的细胞的石油醚提取物。此外，根据选择的制剂的制备方法，制剂可以含有其他组分。例如，制剂可以还含有水，或者在冻干制剂的情况下，可以还含有例如甘油或蔗糖或二者。

在优选的实施方案中，包含根据本发明的石油醚提取物的红螺菌和/或褐螺菌的冻干制剂与填充材料(例如微晶纤维素(MCC)或甘露糖醇)、与粘合剂(例如羟丙基纤维素(HPC))、和/或润滑剂(例如硬脂酸)、和/或其他赋形剂混合，并且制成干粉或以不同的方法制备应用。

本发明的深红红螺菌的石油醚提取物优选是以下石油醚提取物，其是在将所述细胞与具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物混合时，在15℃至25℃，优选在约18℃至24℃，更优选在约室温下提取1小时至3小时，优选约2小时获得的。

优选的是根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物，其中在将所述细胞与所述混合物混合时，通过在10℃至30℃，优选12℃至27℃，更优选15℃至25℃的温度下，提取20分钟至24小时，优选30分钟至16小时，更优选45分钟至8小时，最优选1小时至3小时获得提取物。

在本发明的实施方案中，在将所述细胞与具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物混合时，在室温下提取约2小时获得的本发明的深红红螺菌的石油醚提取物，

如在本文中所用，术语“室温”具有其常规含义，并且在此是指20℃至22℃的温度。

本发明的深红红螺菌的石油醚提取物优选是在用具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物孵育深红红螺菌细胞后，在18℃至24℃，优选在约20℃至22℃，更优选在室温下，将混合物离心约10分钟至60分钟，优选约20分钟。

优选的是根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物，其中用具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇(以8:1至1:8，优选5:1至1:5，更优选2:1至1:2的体积比，最优选以1:1体积比的具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇)的混合物提取所述深红红螺菌细胞。

因此，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物优选通过用约1:1体积比，优选1:1体积比的具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物提取所述深红红螺菌细胞。

特别优选的是本发明的深红红螺菌的石油醚提取物，其中在将所述细胞与所述混合物混合时，在15℃至25℃的温度下提取1小时至3小时获得所述提取物，以及其中用以1:1体积比的具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含氯化钠的甲醇的混合物提取所述深红红螺菌细胞。

本发明的深红红螺菌的石油醚提取物优选通过用具有60℃至80℃的沸点的石油醚和包含约0.02重量％至0.04重量％的氯化钠，优选包含约0.03重量％的氯化钠的甲醇的混合物提取所述深红红螺菌细胞获得的。

本发明的深红红螺菌的石油醚提取物优选包含一种或多种类胡萝卜素和/或一种或多种醌。优选地，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物包含一种或多种类胡萝卜素和一种或多种醌。

本发明的深红红螺菌的石油醚提取物优选包含一种或多种类胡萝卜素和/或一种或多种醌，所述类胡萝卜素选自类胡萝卜素紫菌红醇、1-羟基-螺菌黄素、3,4-双脱氢紫菌红素乙、氯黄质、细菌脱镁叶绿素a(bacteriopheophytin a)、紫菌红素乙、螺菌黄素、3,4-二氢螺菌黄素和细菌脱镁叶绿素a的叶绿基衍生物，所述醌选自以下醌：泛醇-10、泛醌-9、泛醌-10和深红醌-10。

本发明的深红红螺菌的石油醚提取物优选包含紫菌红醇、1-羟基-螺菌黄素、3,4-双脱氢紫菌红素乙、氯黄质、细菌脱镁叶绿素a、紫菌红素乙、螺菌黄素、3,4-二氢螺菌黄素和细菌脱镁叶绿素a的叶绿基衍生物、泛醇-10、泛醌-9、泛醌-10和深红醌-10。

不希望受到理论的束缚，Parson&Rudney在The Journal of BiologicalChemistry(第240卷,第4期,1965年4月)中报道了在深红红螺菌中从对羟基苯甲酸和n-羟基苯甲醛生物合成泛醌和深红醌。由这些作者呈现的数据表明生长的深红红螺菌将泛醌分解代谢成衍生物深红醌。

根据本发明，优选地，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物包含具有至少2100Da的分子量的化合物，其在用例如离子阱纳米ESI-MS高分辨三重飞行时间质谱仪(Bruker)获得的纳米电喷雾电离-质谱(NanoESI-MS)光谱中产生具有752.7和/或769.3的m/z值的峰，m/z值为752.7和/或769.3的所述一个峰或所述两个峰在nanoESI-MS光谱中具有的强度是在nanoESI-MS光谱中m/z值为665.8和883.6的至少一个，优选两个其他峰的强度的至少两倍，优选地是所述强度的约五倍。

根据本发明，优选地，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物包含具有至少2100Da的分子量的化合物，其在用例如离子阱纳米ESI-MS高分辨三重飞行时间质谱仪(Bruker)获得的nanoESI-MS光谱中产生具有752.7和769.3的m/z值的峰，m/z值为752.7和769.3的所述峰在nanoESI-MS光谱中具有的强度是在nanoESI-MS光谱中m/z值为665.8和883.6的其他峰的强度的至少两倍，优选地是所述强度的约五倍。

根据本发明，优选地，用稀释在含1％v/v甲酸的乙腈中的所述石油醚提取物进行本发明的深红红螺菌的石油醚提取物的nanoESI-MS分析和测量。

根据本发明，优选地，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物包含产生一个或多个峰，优选三个峰的化合物，所述峰是在基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-ToF)质谱(MS)光谱中具有500.3、882.5和898.5的m/z值的峰，m/z值分别为500.3、882.5和898.5的所述一个或多个峰在MALDI-ToF MS质谱中的强度比为约1:1:2，优选约1:1:3，更优选约1:1:4。

根据本发明，优选地，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物包含产生至少三个峰的化合物，所述峰在MALDI-ToF MS光谱中分别具有500.3、882.5和898.5的m/z值，m/z值分别为500.3、882.5和898.5的所述三个峰在MALDI-ToF MS质谱中的强度比为约1:1:2，优选约1:1:3，更优选约1:1:4。

前述MALDI-ToF MS质谱例如用配备有Nd:YAG激光器的Qtof Premier质谱仪(Waters)获得，在355nm处以50Hz的输出频率操作，其中飞行时间质量分析以约10.000的分辨率以反射模式进行。然后，优选使用(DCTB)反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙-2-烯亚基]丙二腈基质分析本发明的石油醚提取物。

根据本发明，优选地，用溶解在四氢呋喃中的所述石油醚提取物进行本发明的深红红螺菌的石油醚提取物的前述MALDI-ToF MS分析和测量。

根据本发明，优选地，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物包含产生至少两个峰的化合物，所述至少两个峰在用例如三重飞行时间质谱仪(ABSCIEX)获得的nanoESI-MS光谱中分别具有651.6和647.6的m/z值，m/z值分别为651.6和647.6的所述两个峰在nanoESI-MS光谱中的强度比为约1:1，优选约5:4，更优选约2:1。

根据本发明，优选地，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物包含产生至少两个峰的化合物，所述至少两个峰在用例如三重飞行时间质谱仪(ABSCIEX)可获得的nanoESI-MS光谱中分别具有881.5和927.5的m/z值，m/z值分别为881.5和927.5的所述两个峰在nanoESI-MS光谱中的强度比为约1:1，优选约3:2，更优选约2:1。

根据本发明，优选地，用溶解在由99％v/v乙腈和1％v/v甲酸组成的溶液中的所述石油醚提取物，使用ABSCIEX设备，进行本发明的深红红螺菌的石油醚提取物的前述nanoESI-MS分析和测量。

本发明的其他方面涉及根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物，其用于作为药物的用途。

本发明的方面涉及根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物，其用于降低个体血浆中的LDL-胆固醇的用途中。

本发明的方面涉及根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物，其用于降低个体血浆中的LDL-胆固醇的方法的用途中。类似地，本发明的方面涉及根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物在制备用于治疗个体血浆中的高LDL-胆固醇的药物中的用途。此外，本发明的方面涉及根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物在制备用于降低个体血浆中的LDL-胆固醇的药物中的用途。

本发明的方面涉及根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物，其用于治疗心血管疾病、动脉粥样硬化、血脂异常、动脉硬化、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、高脂血症、至少70mg/dL的LDL血浆水平、至少200mg/dL的总胆固醇水平、至少14mg/dL的Lp(a)水平、炎症、炎性疾病、缺血、感染中的任一种的用途中。

在本发明的实施方案中，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物在治疗心血管疾病、动脉粥样硬化、血脂异常、动脉硬化、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、高脂血症、至少70mg/dL的LDL血浆水平、至少200mg/dL的总胆固醇水平、至少14mg/dL的Lp(a)水平、炎症、炎性疾病、缺血、感染中的任一种中的用途是用于降低罹患任何上述疾病或健康问题，或者具有增加的患任何上述疾病或健康问题风险的个体血浆中的LDL-胆固醇。

上述红螺菌的制剂和/或褐螺菌的制剂是用作降低血浆胆固醇水平，优选地人血浆中胆固醇水平的药物或药物制剂的用途的非常适合的石油醚提取物。

优选地，根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物是用于作为根据本发明的药物的用途，其中所述用途是降低个体血浆中的LDL-胆固醇。

在本发明的实施方案中，深红红螺菌的石油醚提取物用于降低个体血浆中的LDL-胆固醇，其中所述个体罹患以下疾病中的任何一种或多种，或者具有增加的患以下疾病中的任何一种或多种的风险：心血管疾病、动脉粥样硬化、血脂异常、动脉硬化、高胆固醇血症、家族性高胆固醇血症、高脂血症、至少70mg/dL的LDL血浆水平、至少200mg/dL的总胆固醇水平、至少14mg/dL的Lp(a)水平、炎症、炎性疾病、缺血、感染。

当本发明的深红红螺菌的石油醚提取物用于降低个体血浆中的LDL-胆固醇的用途中时，本发明的深红红螺菌的石油醚提取物优选降低血浆中LDL-胆固醇的水平，而总胆固醇的水平基本上不变和/或而HDL-胆固醇的水平基本上不变。

令人惊讶地，本申请的发明人发现，用作降低血浆胆固醇水平的药物或药物制剂的用途的本发明的深红红螺菌的石油醚提取物将血浆中的LDL-胆固醇降低至少40％，例如约46％，而同时总胆固醇的水平和HDL-胆固醇的水平基本上不变。

根据本发明，优选地，用作降低血浆胆固醇水平的药物或药物制剂的用途的本发明的深红红螺菌的石油醚提取物将血浆中LDL-胆固醇降低至少20％，优选约40％至80％，更优选约50％，而同时总胆固醇的水平和HDL-胆固醇的水平基本上不变。

优选口服施用根据本发明用于降低个体血浆中的LDL-胆固醇用途的根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物。

包含根据本发明的红螺菌和/或褐螺菌的石油醚提取物的制剂的各种实施方案是同样可行的。例如，本发明的制剂可以提供为本发明的流体制剂，所述流体制剂含有悬浮、分散或乳化在水溶液中的固体组分，提供了根据本发明的组合物。此类本发明的组合物可以直接用作包含根据本发明的红螺菌和/或褐螺菌的石油醚提取物的制剂，或者可以被加工成可替代实施方案中的食品补充剂。

本发明的方面涉及具有降低LDL-胆固醇性能的食品补充剂，其包含根据本发明的深红红螺菌的石油醚提取物。

在本发明中，食品补充剂被定义为以下配制剂，其除了正常饮食之外还可以被食用，并且包含正常饮食中不存在的或以低量或不足量存在的组分，而这些组分的充足或增加的食用是需要的。优选地，根据本发明的食品补充剂被构成为使得其适合于人类食用。因此，如本发明中定义的食品补充剂应该优选具有使补充剂适合于人类食用的质地、味道和气味。

在本发明的实施方案中，具有降低胆固醇性能的食品补充剂包含红螺菌和/或褐螺菌的制剂，所述制剂包含根据本发明的红螺菌和/或褐螺菌的石油醚提取物。

根据本发明的食品补充剂优选含有0.1％至99.9％(w/w)的包含红螺菌的石油醚提取物的红螺菌的制剂。根据本发明，优选地，食品补充剂含有10％至90％(w/w)，甚至更优选30％至75％(w/w)的红螺菌和/或褐螺菌的制剂。

根据本发明，为了使包含含有红螺菌和/或褐螺菌的石油醚提取物的红螺菌和/或褐螺菌的制剂的食品补充剂适合于食用，优选添加改善例如质地、味道或气味的组分。

因此，根据本发明的食品补充剂优选包含(另外的)蛋白质源、碳水化合物源和脂肪源，以及维生素、矿物质、电解质、微量元素和其他适合的组分，使得食品补充剂本身适合用作营养食品。

适合用于营养配制剂中的每种蛋白质以及它们的混合物优选用于根据本发明的食品补充剂中作为蛋白质源。这类蛋白质涵盖例如动物蛋白(例如乳清蛋白、乳清蛋白浓缩物、乳清粉、卵蛋白、卵白蛋白、酪蛋白或乳白蛋白)和植物蛋白(例如大豆蛋白、大豆粉或来自豆奶的蛋白质)。对于选择待使用的蛋白质源，蛋白质的生物学价值可以构成重要标准。例如，酪蛋白酸盐，包括酪蛋白酸钙，还有乳清、乳白蛋白、卵白蛋白和总卵蛋白是具有非常高的生物学价值的蛋白质，因为它们含有大比例的必需氨基酸。

例如，在根据本发明的食品补充剂中待使用的适合的碳水化合物优选简单的短链碳水化合物，例如单糖和二糖，但也可以是多糖，或两者的组合。根据本发明，优选根据其适合的感官性质选择碳水化合物。根据本发明，优选地，复合碳水化合物适合用作食品纤维。

在一些实施方案中，根据本发明的食品补充剂优选含有简单碳水化合物和复合碳水化合物的组合。在一些实施方案中，根据本发明的食品补充剂优选含有选自所有食用油和食用脂肪的脂肪。

依照卫生管理机构的规定，维生素和矿物质优选添加至根据本发明的制剂中，并且优选涵盖由以上机构认可的所有微生物和矿物质，例如维生素A、B1、B2、B12、C、D、B和K，以及叶酸、烟酸、泛酸和生物素。诸如铁、锌、碘、钙、镁、铬和硒作为矿物质优选添加至根据本发明的制剂中。

电解质(例如钠离子、钾离子和氯离子)和微量元素以及其他添加剂也优选形成根据本发明的食品补充剂的一部分。此类组分(如果存在)优选以推荐浓度使用。另外，根据本发明的食品补充剂优选含有改善其质地、色彩和风味的组分、芳香物质、香料、填充剂、乳化剂、稳定化合物、防腐剂、抗氧化剂、纤维和其他补充剂，例如氨基酸、胆碱、卵磷脂和脂肪酸等。此类组分的选择取决于配制剂、设计和偏好。添加的此类组分的量是技术人员已知的，而待添加的量的选择优选通过考虑儿童和成人推荐的每日量(RDA)来指导。

优选添加乳化剂以稳定本发明的最终产物。根据本发明，可接受的乳化剂的实例是卵磷脂(例如来源于大豆或鸡蛋)和/或甘油单酯和甘油二酯。根据本发明，优选使用例如角豆胶、瓜尔胶或角叉菜胶作为稳定剂。

优选添加防腐剂以增加本发明的产物的保质期。

优选地，在本发明的制剂中使用防腐剂，例如山梨酸钠、山梨酸钾、苯甲酸钾、苯甲酸钠或EDTA二钠钙。

根据本发明，除了以上提及的碳水化合物以外，天然或合成的甜味剂(例如糖类、环己胺磺酸盐(cyclamates)、天冬甜素、乙酰氨基磺酸钾和/或山梨糖醇)优选添加至食品补充剂中。

待食用的本发明的食品补充剂的量在大小上是变化的，并且不一定限制于建议剂量中提及的剂量。术语“食品补充剂”不意味着受限于指定重量，或受限于食品补充剂的指定剂量。

根据本发明，根据本发明的食品补充剂的组合物原则上采用适合于人类或动物食用的任何形式。

在本发明的优选实施方案中，食品补充剂是适合于悬浮、分散或乳化在水溶液(例如咖啡、茶、肉汤和果汁)中的干粉。为此，根据本发明，优选地在分配器中提供干粉。

在本发明的可替代的优选实施方案中，食品补充剂以干粉起始配制成片剂。为此，优选地，根据本发明的食品补充剂的组合物适当地提供有填充剂(例如微晶纤维素(MCC)和甘露糖醇)、粘合剂(例如羟丙基-纤维素(HPC))、润滑剂(例如硬脂酸)和其他赋形剂。

根据本发明的食品补充剂在一个实施方案中优选地提供为流体，其中固体组分已经被悬浮、分散或乳化。本发明的此类组合物优选直接混合进食品中，或优选地例如挤出和制成颗粒或其他形式。

在本发明的可替代的实施方案中，食品补充剂优选地配制成固体形式，例如棒、饼干或卷。

本发明的食品补充剂优选地配制用于口服食用，优选地与可接受的载体(例如胶囊、片剂、水溶性粉末)或对于施用可接受的其他形式组合。根据本发明，可替代地，优选将本发明的食品补充剂加工成食品。

本发明的一个方面涉及包含根据本发明的食品补充剂的食品。

本发明的其他方面涉及生产根据本发明的制剂、食品补充剂或食品的方法。

本发明的又一个方面涉及用于生产本发明的深红红螺菌的石油醚提取物的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)提供深红红螺菌细胞，并且提供1:1体积比的具有60℃至80℃的沸点的石油醚和含有约0.03重量％的氯化钠的甲醇的双相混合物；

(b)在18℃至24℃，优选在约20℃至22℃，更优选在室温下，将步骤a)的细胞与步骤a)的混合物混合约1小时至3小时，优选约2小时；以及

(c)将深红红螺菌的石油醚提取物与含有约0.03重量％的氯化钠的甲醇中分离，从而提供深红红螺菌的石油醚提取物。

用于生产根据本发明的制剂的方法优选包括培养一种或多种红螺菌和/或褐螺菌的细胞，以在所述培养物中收获所述细胞，以及将所述培养物的细胞加工成制剂所必需的步骤。

此类方法的细节尤其描述在以下提及的实施例中。技术人员应理解，可以使用各种替代方法。

在培养红螺菌和/或褐螺菌的细胞期间，应用厌氧和光营养条件。优选使用各种有机营养素作为碳源。红螺菌和/或褐螺菌的细胞的非常适合的培养基和生长条件是例如“Segers和Verstraete培养基”(Segers和Verstraete,1983)，使用乳酸(约2.7克/L)作为碳源，pH为约6.8-6.9，以及在25℃-37℃的温度下，优选地，在来自例如条形照明(光强300μM量子.m^-2.s^-1)的恒定光强和厌氧条件下，适合所涉及的微生物的特定要求。适合培养红螺菌和/或培养褐螺菌的其他培养基是例如“改良的红螺菌科培养基”(DSMZ培养基#27，DMSZGmbH，Braunschweig，Germany)或Cens培养基(DSMZ培养基#748)。基于细胞的湿重，细胞适合培养至0.01mg/mL至50mg/mL，优选1mg/mL至5mg/mL的密度。

在30℃下，使细胞在1升烧瓶中同样进行厌氧生长，所述烧瓶含有包含在自来水中的3.1ml/L 60％DL-乳酸盐溶液、3g/L细菌蛋白胨和3g/L酵母提取物的培养基，所述培养基的pH是6.8，以及使用3盏40W的钨灯以50μM量子.m^-2.s^-1的平均光辐射强度照射。生长3天后，在660nm处的光密度总计为3.5(1.2g/kg干重)。

一旦细胞达到适合的细胞密度，就使用从生长培养基中分离、或通过例如离心或过滤收获，将它们加工成根据本发明的制剂。

在进一步加工后，将浓缩的细胞团用作根据本发明的制剂。

加工红螺菌和/或褐螺菌的细胞物质以获得包含本发明的红螺菌和/或褐螺菌的石油醚提取物的可用制剂的其他步骤包括例如洗涤步骤，并且还包括通过提取和任选地冻干进一步加工细胞。

Minnikin,O’Donnell等人描述了用于提取细菌类异戊二烯醌和极性脂的完整的工序(Journal of Microbiological Methods 2(1984)pp.233-241)。这些作者概述了从细菌细胞中依序提取类异戊二烯醌和极性脂的工序。用石油醚(b.p.60-80℃)和甲醇盐水的双相混合物提取得到含有类异戊二烯醌的上层相。作为工序的实例，提取并且分析了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、缺陷假单胞菌(Pseudomonas diminuta)和灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的类异戊二烯醌。

本发明的方面涉及通过本发明的方法可获得的深红红螺菌的石油醚提取物。

根据本发明的食品补充剂可以适当地用以减少肠胆固醇吸收，从而降低血浆中的胆固醇水平。

在本发明的另一个实施方案中，本发明的食品补充剂用于具有降低胆固醇性能的食品中。

制备本发明的降低胆固醇的食品的方法包括生产掺入根据本发明的食品补充剂的食品。此类方法优选包括以下步骤，其中首先以正常方式制备食品，然后将红螺菌和/或褐螺菌的制剂添加至所制备的食品中。此外，可以在食品生产期间将红螺菌和/或褐螺菌的制剂添加至食品中。

根据本发明的具有降低胆固醇性能的食品通常含有0.1％至20％(w/w)，优选1％至10％(w/w)的根据本发明且以上描述的食品补充剂。

本发明最终包括在降低血浆的胆固醇水平，优选地降低LDL-胆固醇的血浆水平，同时使血浆中总胆固醇的水平基本上不变和/或同时使血浆中HDL-胆固醇的水平基本上不变的药物中使用的包含红螺菌和/或褐螺菌的石油醚提取物的红螺菌和/或褐螺菌的制剂。优选地，包含红螺菌和/或褐螺菌的石油醚提取物的本发明的此类制剂包括菌种深红红螺菌和/或菌种莫氏褐螺菌。

通过以下实施例进一步说明本发明，所述实施例不应被解释为以任何方式限制本发明。

实施例

实验工序

将深红红螺菌菌株S1H储存于在10％w/w蔗糖-0.85％w/w盐水溶液中的液氮中。为了使菌株再生长，将细胞从液氮中取出并且在室温解冻30分钟。将细胞在Sistrom琥珀酸盐琼脂板和丰富的Luria Bertani(LB)培养基上划线以生长菌落形成单位。将琼脂板在30℃下于黑暗中和需氧条件下孵育长达4天。

4天后，挑取10个单菌落，转移至具有2mL Sistrom琥珀酸盐液体培养基的10个管中，并且在30℃下于黑暗、需氧和以150rpm回转式振荡中孵育。4天至5天后，细胞生长并且达到OD₆₈₀＝0.5-0.6。为了检查培养物的无外来污染性，将细胞在Sistrom琥珀酸盐琼脂板和丰富的LB培养基琼脂板上划线，并且孵育长达1周以检查非自养污染物。当核准无外来污染性检查时，将2mL培养物转移至15mL的Sistrom琥珀酸盐液体培养基中，并且在30℃下于黑暗、需氧和以150rpm的回转式振荡中孵育。4天至5天后，细胞生长并且达到OD₆₈₀＝0.5-0.6。然后，将15mL培养物转移至100mL Sistrom琥珀酸盐液体培养基中，并且在30℃下于黑暗、需氧和以100rpm回转式振荡中孵育。4天至5天后，细胞生长并且达到OD₆₈₀＝0.5-0.6。一旦在Sistrom琥珀酸盐和LB培养基上检查了无外来污染性，这些细胞就构成了接种物培养物。

细胞培养

培养条件

生物反应器

应用光厌氧条件培养深红红螺菌菌株S1H细胞。通过以5000*g离心10分钟使十个无外来污染的接种物培养物沉淀。弃去上清液，并且将沉淀物合并在具有乙酸盐作为碳源的25mL Melissa液体培养基中(Segers&Verstraete,1983)以构成浓缩的接种物。

通过湿热灭菌，在121℃和1.2巴(bar)下在高压釜中20分钟的水蒸气暴露来对生物反应器进行灭菌。灭菌后封闭生物反应器。在超净工作台(LAF)中无菌连接具有Melissa培养基、1M H₂SO₄和用于流出物的瓶子。

提取方案

在室温下，在2小时期间，使用石油醚(沸点60-80℃)和甲醇盐水的440ml双相混合物(双相混合物：220ml的含有20ml 0.3质量％的NaCl和200ml甲醇+220ml石油醚(沸点60-80℃))混合30g的深红红螺菌菌株S1H细胞的细菌沉淀物。在室温下，在20分钟期间以5000RPM离心后，去除上层相(石油醚相)并且在室温下储存。下层相(甲醇盐水溶液)任选地用另外的220ml石油醚在室温下进行2小时的第二次提取。将第二上层相与第一上层相混合，并且使用旋转蒸发系统干燥。得到的粘稠液体被命名为“级分I.1”、或“fI.1”或图1中的“提取物I.1”。

为了获得深红红螺菌菌株S1H细胞的替代提取物，将260ml的CHCl₃/CH₃OH/NaCl0.3％(9:10:3)溶液添加至以上提及的下层相(甲醇盐水溶液)中，然后在搅拌下在室温孵育4小时。通过过滤去除不溶的细菌物质后，将上清液与145ml的CHCl₃和145ml的0.3％NaCl混合，然后在搅拌中在室温孵育1小时。最后，去除得到的有机相(下层相)，使用旋转蒸发仪干燥并且命名为“级分I.2或“fI.2”或图1中的“提取物I.2”。

如下获得第三提取物，“提取物III”、或“级分III”或“fIII”。从30g的细菌沉淀物中分离红螺菌菌株S1H的膜，用5mM磷酸盐缓冲液(pH7.0)洗涤。通过超声处理(3次持续30秒，100振幅，在4℃下)，1个冷冻-解冻循环和2个弗式压碎器(French Press)循环(Thermo，高压细胞，1500psi)来破碎洗涤的细菌沉淀物。将细菌匀浆以5,000rpm离心5分钟以去除细胞碎片，并且将来自这第一离心步骤的上清液在第二离心步骤中以15,000rpm离心30分钟以沉淀膜。提取物III是第二离心步骤后的上清液。

用于质谱分析的物质和方法

MALDI-ToF

使用配备有Nd:YAG激光器的QToF Premier质谱仪，以50Hz的输出频率在355nm处操作来记录基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-ToF)质谱。飞行时间质量分析以约10.000的分辨率以反射模式进行。使用(DCTB)反式-2-[3-(4-叔丁基苯基)-2-甲基丙-2-烯亚基]丙二腈分析fI.1和fI.2的样品。将该基质制备成在CHCl₃中的40mg/mL溶液。将基质溶液(1mg/mL)应用至不锈钢靶上并且风干。将样品溶解在THF中，并且将该溶液的1微升等分试样应用至已经带有基质晶体的靶区域上并且风干。为了记录单级MS光谱，将四极杆(仅rf模式)设置为通过200Th至2500Th的离子，并且将所有离子传输到飞行时间分析仪的推进器区域，在那以1s积分时间对离子进行质量分析。

Q-tOF(5600ABSCIEX)–nanoESI-MS

将fI.1和fI.2的样品在含0.1％甲酸的乙腈中稀释，在室温下以13.000RPM离心5分钟，并且将上清液直接注入使用nano-esi源的质谱仪(流速：89微升/小时)中。采集参数为：离子源气体1:4；气帘气15；离子喷雾电压浮动2.300、加热器温度150℃；极性：正；ToF质量范围：100-2.000。

离子阱(HCT Ultra Brucker)–nanoESI-MS

将fI.1和fI.2的样品在含0.1％甲酸的乙腈中稀释，在室温下以13.000RPM离心5分钟，并且将上清液直接注入使用nano-esi源的质谱仪(流速：89微升/小时)中。采集参数为：毛细管1.900伏；干燥气体：6l/分钟；干燥温度：250℃；极性：正；扫描模式：标准-增强的；扫描范围：100-2.000；智能靶20.000；最大累积时间：200ms。

结果

fI.1和fI.2的MALDI-ToF分析显示fI.1和fI.2包含许多化合物。在图2中，显示出级分I.1和级分I.2的Maldi Tof分析的结果。在基质的存在下干燥10μl的每种级分。

使用Maldi-ToF数据，在fI.1中观察到类胡萝卜素和醌(括号内表示的分子离子为M+H+值)：紫菌红醇(585.5)、1-羟基-螺菌黄素(583.5)、3,4-双脱氢紫菌红素乙(587.5)、氯黄质(557.5)、细菌脱镁叶绿素a(BPha；883.5)、视紫红质(555.4)、螺菌黄素(597.4)、3,4-二氢螺菌黄素(599.5)、细菌脱镁叶绿素a的叶绿基衍生物(BPha(叶绿基)；889.5)、泛醇-10(865.7)、泛醌-9(795.6)、泛醌-10(848.7)和深红醌-10(863.7)。当应用nano-ESI Q-ToF分析时，fI.1提取物中鉴定出相同的类胡萝卜素和醌。

其中，用fI.1提取物进行的Maldi-ToF数据分析显示出以下m/z值处的峰(括号内是近似相对强度)：500.3(1)；882.5(1)；898.5(4)。

其中，用fI.2提取物进行的Maldi-ToF数据分析显示出以下m/z值处的峰(括号内是近似相对强度)：500.3(0)；882.5(3)；898.5(1)。

使用Q-tOF(5600ABSCIEX)–nanoESI-Ms对fI.1提取物的分析证实了fI.1中存在以上列出的类胡萝卜素和醌的存在。用三重tof质谱仪(ABSCIEX)，使用99％乙腈、1％HCOOC作为有机溶剂，获得级分I.1和级分I.2的NanoESI MS光谱。

其中，在fI.1的Q-tOF(5600ABSCIEX)–nanoESI-MS光谱中，在以下m/z值处显示出峰(括号内是近似相对强度)：647.6(2.5)；651.6(3.3)；881.5(2)；927.5(1)。

其中，在fI.2的Q-tOF(5600ABSCIEX)–nanoESI-MS光谱中，在以下m/z值处显示出峰(括号内是近似相对强度)：647.6(2-3)；651.6(16)；881.5(5)；927.5(1)。

其中，在fI.1的离子阱(HCT Ultra Brucker)–nanoESI-MS光谱中，在以下m/z值处显示出具有相对高强度的峰：652.3；686.4；690.6；752.7；769.3；881.9；897.8；913.8；927.7。用离子阱质谱仪(Bruker)，使用含1％HCOOC的乙腈，获得级分I.1和级分I.2的nanoESI MS光谱。

深红红螺菌的石油醚提取物fI.1包含具有至少2100Da的分子量的化合物，从而在用离子阱nanoESI-MS高分辨三重飞行时间质谱仪(Bruker)可获得的nanoESI-MS光谱中产生具有752.7和769.3的m/z值的峰，m/z值为752.7和769.3的所述峰在nanoESI-MS光谱中具有的强度是在nanoESI-MS光谱中m/z值为665.8和883.6的两个其他峰的强度的约五倍。

其中，在fI.2的离子阱(HCT Ultra Brucker)–nanoESI-MS光谱中，在以下m/z值处显示出具有相对高强度的峰：665.8；883.6；899.8；915.6。

深红红螺菌的石油醚提取物fI.2包含在用离子阱nanoESI-MS高分辨三重飞行时间质谱仪(Bruker)可获得的nanoESI-MS光谱中产生具有665.8和883.6的m/z值的峰的化合物，m/z值为665.8和883.6的所述峰在nanoESI-MS光谱中具有的强度是在nanoESI-MS光谱中m/z值为752.7和769.3的两个其他峰的强度的至少五倍。

小鼠测试-fI.1、fI.2和fIII对血浆胆固醇水平的影响

在40只C57BL/6雄性小鼠适应环境2周后，在SCK·CEN animalarium(BE)进行用于测试包含fI.1或fI.2或fIII的饮食对血浆胆固醇水平的影响的小鼠测试。在食品和小鼠的初始称量后，将它们放置在单独的通风笼中。每天检查食品食用，并且每2天称重水凝胶。基于先前进行的初步适口性测试，将细菌提取物重悬在葵花油中，并且将5％常规糖添加至食物(自助饮食)中以确保高适口性。

第一周，第一组小鼠接受自助饮食+葵花油任意替代深红红螺菌提取物fI.1或fI.2或fIII，而第二组小鼠接受自助饮食+对照饮食任意替代深红红螺菌提取物fI.1或fI.2或fIII。

第二周，对照组继续相同的饮食，而三个实验组接受自助饮食+在葵花油中10％的fI.1提取物或fI.2提取物或fIII提取物。因此，一组小鼠进食包含深红红螺菌的fI.1石油醚提取物的饲料，第二组小鼠进食包含深红红螺菌的fI.2提取物的饲料，第三组小鼠进食包含深红红螺菌的fIII提取物的饲料，第四组小鼠(对照组)进食没有任何深红红螺菌的提取物的饲料。

以下详述喂食对照饲料或包含fI.1或fI.2或fIII的饲料对血浆中胆固醇水平的影响。

小鼠测试的末期

测试2周后，称重小鼠，并且在解剖前使用腹膜内戊巴比妥注射使小鼠安乐死。将全血移至EDTA管中，离心以获得血浆，并且放置在4℃用于进一步分析。

小鼠体重

在第1周和第2周后，各组之间没有检测到差异。

血液分析

总胆固醇、HDL和LDL级分

图1显示胆固醇分析、HDL分析和LDL分析的结果。

提取物I.1(其为级分I.1，fI.1)对血浆LDL-胆固醇级分具有显著影响，因为与对照组(p<0.001)相比，其使血浆LDL-胆固醇降低了40％以上，即约46％，而总胆固醇保持基本上不变。参见图1。此外，在实验阶段后，在喂食fI.1级分的小鼠组中HDL-胆固醇水平也保持基本上不变。与对照组中的4.46μg/μl相比，fI.1组小鼠的血浆中的总胆固醇是4.39μg/μl；对于fI.1组，HDL-胆固醇是2.93μg/μl，对于对照组，其是2.72μg/μl；以及对于fI.1组，LDL-胆固醇是0.36μg/μl(p<0.001)，对于对照组，其是0.67μg/μl。

然而，当考虑总胆固醇、HDL-胆固醇和LDL-胆固醇水平时，提取物I.2(其为级分I.1、fI.2)对胆固醇水平中的任一种都没有显著影响。参见图1。与对照组的4.46μg/μl相比，fI.2组小鼠的血浆中的总胆固醇是4.45μg/μl；对于fI.2组，HDL-胆固醇是3.00μg/μl，对于对照组，其是2.72μg/μl；以及对于fI.2组，LDL-胆固醇是0.60μg/μl(p<0.001)，对于对照组，其是0.67μg/μl。

类似于提取物I.1，当考虑总胆固醇、HDL-胆固醇和LDL-胆固醇水平时，提取物III(其为级分III、fIII)也对胆固醇水平没有显著影响。换言之，与对照组相比，fIII组小鼠的血浆中的总胆固醇保持在4.46μg/μl不变；对于fIII组，HDL-胆固醇是2.93μg/μl，对于对照组，其是2.72μg/μl；以及对于fIII组，LDL-胆固醇是0.60μg/μl，对于对照组，其是0.67μg/μl。

从使用深红红螺菌S1H提取物fI.1、fI.2和fIII的该小鼠测试中显而易见的是，当口服施用提取物时，石油醚提取物fI.1对很大程度降低LDL-胆固醇水平，而同时保持HDL-胆固醇水平基本上不变具有有益作用。使用深红红螺菌S1H提取物fI.2或提取物fIII的小鼠测试显示，当口服施用提取物时，这些提取物中的化合物不会显著影响总胆固醇、HDL-胆固醇和LDL-胆固醇水平。

参考文献

D.E.Minnikin,A.G.O’Donnell,M.Goodfellow,G.Alderson,M.Athalye,A.Schaaland J.H.Parlett,“An integrated procedure for the extraction of bacterialisoprenoid quinones and polar lipids”,Journal of Microbiological Methods 2(1984)pp.233-241(Elsevier).

Segers,L.and Verstraete,W.,1983,Conversion of organic acids to H₂ byRhodospirillaceae grown with glutamate or dinitrogen as nitrogensource.Biotechnol.Bioeng.1983；25:2843-2853.

William W.Parson and Harry Rudney,“The Biosynthesis of Ubiquinone andRhodoquinone from p-Hydroxybenzoate and n-Hydroxybenzaldehyde inRhodospirillum rubrum”,The Journal of Biological Chemistry,Vol.240,No.4,April1965,pp.1855-1863.