用于治疗疾病和病症的降钙素模拟物
阅读说明：本技术 用于治疗疾病和病症的降钙素模拟物 (Calcitonin mimetics for the treatment of diseases and disorders ) 是由 K·亨利克森 M·卡尔斯达尔 K·安德烈森 于 2018-03-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及人源化降钙素模拟物及其在治疗糖尿病(I型和/或II型)、过量体重、过量食物消耗、代谢综合征、类风湿性关节炎、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝、酒精性脂肪肝病、骨质疏松症或骨关节炎、血糖水平调节不良、对葡萄糖耐量试验反应调节不良或食物摄入调节不良中的用途。(The present invention relates to humanized calcitonin mimetics and their use in the treatment of diabetes (type I and/or type II), excess body weight, excess food consumption, metabolic syndrome, rheumatoid arthritis, non-alcoholic steatohepatitis (NASH), non-alcoholic fatty liver disease, osteoporosis or osteoarthritis, dysregulation of blood glucose levels, dysregulation of response to a glucose tolerance test, or dysregulation of food intake.)
技术领域
本发明涉及降钙素模拟物，并且延伸至它们在治疗各种疾病和病症中的用途，包括但不限于糖尿病(I型和II型)，体重过重，食物过量消耗和代谢综合征，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，酒精性和非酒精性脂肪性肝病，血糖水平的调节，对葡萄糖耐量试验的反应的调节，食物摄入的调节，骨质疏松症的治疗和骨关节炎的治疗。
背景技术
全世界约有2.5亿糖尿病患者，预计这一数字在未来20年内会增加一倍。该群体超过90％的患者患有2型糖尿病(T2DM)。据估计，目前只有50-60％的患有T2DM或处于明显T2DM之前的阶段的人被诊断出来。
T2DM是一种异质性疾病，其特征在于碳水化合物和脂肪代谢异常。T2DM的原因是多因素的，包括影响组织(如肌肉、肝脏、胰腺和脂肪组织)中β细胞功能和胰岛素敏感性的遗传因素和环境因素。结果，观察到胰岛素分泌受损，并且伴随着β细胞功能和慢性胰岛素抵抗的进行性下降。内分泌胰腺不能补偿外周胰岛素抵抗导致高血糖和临床糖尿病的发作。目前，组织对胰岛素介导的葡萄糖摄取的抗性被认为是T2DM的主要病理生理决定因素。
最佳T2DM干预的成功标准是降低血糖水平，其可以是血糖水平的慢性降低和食物摄入后耐受高葡萄糖水平的能力增加，由较低的峰值葡萄糖水平和较快的清除所描述。这两种情况对β细胞胰岛素输出和功能的应变较小。
I型糖尿病的特征在于丧失响应于食物摄入而产生胰岛素的能力，因此不能将血糖调节至正常生理水平。
骨骼的物理结构可能受到各种因素的影响，包括疾病和损伤。最常见的骨病之一是骨质疏松症，其特征在于骨量低和骨组织结构恶化，导致骨脆性和对骨折的易感性增加，特别是对于髋部、脊柱和腕部的骨折。当存在不平衡时骨质疏松症发生，使得骨吸收速率超过骨形成速率。施用有效量的抗再吸收剂如降钙素已显示可防止骨的再吸收。
炎症性或退行性疾病，包括关节疾病，例如骨关节炎(OA)、类风湿性关节炎(RA)或幼年型类风湿性关节炎(JRA)，包括由自身免疫反应引起的炎症，例如，狼疮，强直性脊柱炎(AS)或多发性硬化症(MS)，由于疼痛和关节破坏可导致大量的活动性丧失。覆盖并缓冲关节内的骨的软骨可能随着时间的推移而退化，因此不期望地允许两个骨的直接接触，这会限制一个骨相对于另一个骨的运动和/或在关节运动期间导致另一个骨对一个骨的损伤。软骨正下方的软骨下骨也可能退化。施用有效量的抗再吸收剂如降钙素可以防止骨的再吸收。
降钙素在很多种类中都是高度保守的。全长天然降钙素长度为32个氨基酸。天然降钙素的实例序列如下：
鲑鱼CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP(SEQ ID NO：1)
鳗鱼CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTP(SEQ ID NO：2)
鸡CASLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTDVGAGTP(SEQ ID NO：3)
小鼠CGNLSTCMLGTYTQDLNKFHTFPQTSIGVEAP(SEQ ID NO：4)
大鼠CGNLSTCMLGTYTQDLNKFHTFPQTSIGVGAP(SEQ ID NO：5)
马CSNLSTCVLGTYTQDLNKFHTFPQTAIGVGAP(SEQ ID NO：6)
犬-1CSNLSTCVLGTYSKDLNNFHTFSGIGFGAETP(SEQ ID NO：7)
犬-2CSNLSTCVLGTYTQDLNKFHTFPQTAIGVGAP(SEQ ID NO：8)
猪CSNLSTCVLSAYWRNLNNFHRFSGMGFGPETP(SEQ ID NO：9)
人CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP(SEQ ID NO：10)
WO2013/067357和WO2015/071229中公开了具有修饰的氨基酸序列的天然降钙素的合成变体，其旨在提供改善的性质。
一直需要开发具有进一步改善的性质的降钙素类似物，或者至少提供改善天然存在的降钙素的性质的替代人工序列，特别是在胰淀素和降钙素受体激动作用方面，同时消除CGRP-受体激动作用，从而确保最佳的体内功效与安全比。
然而，肽驱动的治疗剂的问题是响应于给定治疗的宿主暴露而产生抗药物抗体(ADA)(Wu B等人AAPS J.2016年11月；18(6)：1335-1350；Schellekens H，Clin Ther.2002年11月；24(11)：1720-40)。当使用衍生自其他生物的肽疗法(例如鲑鱼降钙素作为各种骨相关疾病的治疗剂)(Grauer等，Exp clin Endo Diabetes，1995)和作为治疗T2DM的exanatide(Fineman MS等人，Diabetes Obes Metab.2012年6月；14(6)：546-54)时，ADA的出现更为常见，它会干扰给定治疗的功效。
硬骨鱼/禽类降钙素与内源性配体人降钙素(hCT)具有大约50％的序列同源性，因此增加与hCT的序列同源性以试图通过模拟内源性靶标同时保留铁蛋白/鸟类降钙素组的独特配体特性来减弱ADA产生将是有利的。
发明概述
本发明现在提供降钙素模拟物，其与人降钙素高度相似(按％同一性)，但令人惊讶地还显示出有用的治疗性质，例如改善的食欲抑制。如本文所示，这种有效的‘人源化’降钙素模拟物的开发远非微不足道的事情。表1(下文)提供了由申请人开发和测试的降钙素模拟物的氨基酸序列。发现人源化某些残基(即用人降钙素中发现的等同残基替换某些残基)导致功效的改善，而替换其他残基显着降低了功效。
虽然大多数测试的肽在4小时内产生一定程度的食欲抑制，但表1中突出显示了那些肽(KBP-047[SEQ ID NO：12]，-053[SEQ ID NO：18]，-058[SEQ ID NO：[20]，-062[SEQ IDNO：24]，以及-063[SEQ ID NO：25])产生了更大的食物摄入减少，并且是唯一显示在24小时内产生持续作用的肽。
因此，在第一方面，本发明涉及作为降钙素模拟物的肽，其中所述肽是：
CGNLSTCX1LGRLX2QDX3X4KX5X6TFPX7TDVGANAP(SEQ ID NO：26)
其中，
X1＝M或V
X2＝T或S
X3＝F或L
X4＝N或H，
X5＝F或L
X6＝Q或H
X7＝Q或K
优选地，X2是T，X3是L，X4是N，X5是F，X6是H，和/或X7是K。
优选地，X4是N，X5是F，X6是H。
优选地，肽与人降钙素的同一性为至少65％，更优选至少70％，最优选至少75％。
优选地，肽选自以下之一：
KBP-047CGNLSTCMLGRLSQDLNKFHTFPKTDVGANAP(SEQ ID NO：12)，
KBP-053CGNLSTCMLGRLTQDLHKLQTFPKTDVGANAP(SEQ ID NO：18)，
KBP-058CGNLSTCMLGRLTQDFHKLHTFPKTDVGANAP(SEQ ID NO：20)，
KBP-062：CGNLSTCMLGRLTQDLNKFHTFPKTDVGANAP(SEQ ID NO：24)，或
KBP-063：CGNLSTCMLGRLSQDLNKFHTFPQTDVGANAP(SEQ ID NO：25)。
本发明的肽可以在其N-末端被酰化或以其他方式被修饰以降低第一氨基酸的正电荷，并且独立地可以在其C-末端酰胺化。
可以将肽配制成作为药物给药，并且可以配制用于肠内或肠胃外给药。优选的制剂是可注射的，优选用于皮下注射，然而肽可以与用于口服给药的载体一起配制，并且任选地其中载体增加肽的口服生物利用度。合适的载体包括含有5-CNAC、SNAD或SNAC的载体。
任选地，将肽配制在用于口服给药的药物组合物中，药物组合物包含包衣的柠檬酸颗粒，并且其中包衣的柠檬酸颗粒增加肽的口服生物利用度。
本发明包括用作药剂的本发明的肽。该肽可用于治疗糖尿病(I型和/或II型)，体重过重，食物过量消耗，代谢综合征，类风湿性关节炎，非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，非酒精性脂肪肝病，酒精性脂肪肝病，骨质疏松症，或骨关节炎，血糖水平调节不良，对葡萄糖耐量试验反应调节不良，或食物摄入调节不良。特别地，肽可用于降低不希望的高空腹血糖水平或降低不期望的高HbAlc或降低对葡萄糖耐量试验的不期望的高响应。
在一些实施方案中，修饰上文讨论的降钙素模拟物的N-末端侧以降低第一氨基酸的正电荷。例如，乙酰基、丙酰基或琥珀酰基可以在半胱氨酸-1上被取代。减少正电荷的替代方法包括但不限于基于聚乙二醇的PEG化，或在N-末端添加另一种氨基酸如谷氨酸或天冬氨酸。或者，可以将其他氨基酸添加到上文讨论的肽的N-末端，包括但不限于赖氨酸、甘氨酸、甲酰甘氨酸、亮氨酸、丙氨酸，乙酰丙氨酸和二丙氨酰。如本领域技术人员所理解的，具有多个半胱氨酸残基的肽通常在两个这样的半胱氨酸残基之间形成二硫桥。本文所述的所有此类肽定义为任选地包括一个或多个这样的二硫桥，特别是在Cys1-Cys7位置。模仿这一点，位置1和7的半胱氨酸可以共同被α-氨基辛二酸键取代。
虽然本公开的降钙素模拟物可以以游离酸形式存在，但优选C-末端氨基酸被酰胺化。申请人预期这种酰胺化可能有助于肽的有效性和/或生物利用度。制备本公开的降钙素模拟物的酰胺化形式的优选技术是在肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶存在下根据已知的技术使前体(具有甘氨酸代替所需酰胺化产物的C-末端氨基)反应，其中在例如US4708934和EP0308067和EP0382403中描述的反应中前体转化为酰胺化产物。
酰胺化产物的生产也可以使用以下文献中中提出的方法和酰胺化酶来完成：Consalvo等人，US7445911；Miller等，US2006/0292672；Ray等人，2002，ProteinExpression and Purification，26：249-259；以及Mehta，2004，Biopharm.International，7月，第44-46页。
优选的酰胺化肽的制备可以通过以下过程来进行：例如，通过在大肠杆菌中产生甘氨酸延长的前体作为具有谷胱甘肽-S-转移酶的可溶性融合蛋白，或者通过根据US6103495中描述的技术直接表达前体。这种甘氨酸延长的前体具有与所需的酰胺化产物相同的分子结构，除了在C-末端(其中产物终止--X--NH2，而前体终止--X-gly，X为产物的C-末端氨基酸残基)。上述出版物中描述的α-酰胺化酶催化前体向产物的转化。该酶优选重组产生，例如，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，如Biotechnology and Biopharm中的上面引用的文章所述。
除了在“前体”上不包括C-末端甘氨酸之外，本发明的游离酸形式的肽活性剂可以以相似的方式产生，该前体是最终的肽产物，并且不需要酰胺化步骤。
除非另有说明，否则本公开的降钙素模拟物的优选剂量对于治疗和预防目的是相同的。所需剂量将在下文中更详细地讨论，并且根据给药方式而不同。
除非另有说明或从上下文显而易见，否则本文中的剂量是指不受药物赋形剂、稀释剂、载体或其他成分影响或折扣的活性化合物(即降钙素模拟物)的重量，但理想地包括这些其他成分。制药工业中通常用于递送肽活性剂的任何剂型(胶囊、片剂、注射剂等)适用于本文，术语“赋形剂”、“稀释剂”或“载体”包括通常包括的这样的非活性成分，以及工业中这种剂型的活性成分。以下更详细地讨论优选的口服剂型，但不应将其视为施用本公开的活性剂的专有方式。
本公开的降钙素模拟物可以施用于患者以治疗许多疾病或病症。如本文所用，术语“患者”是指属于动物界的任何生物。在一个实施方案中，术语“患者”是指脊椎动物，更优选地是哺乳动物，包括人。
因此，本公开内容包括肽在治疗以下疾病或病症的方法中的用途：I型糖尿病、II型糖尿病或代谢综合征，肥胖症或抑制食欲，或用于减轻胰岛素抵抗，或用于减少不期望的高空腹血糖水平，或用于降低不希望的高峰血清葡萄糖水平，或用于降低不希望的高峰血清胰岛素水平，或用于降低对葡萄糖耐量试验的不期望的大反应，或用于治疗骨质疏松症，或用于治疗骨关节炎，或用于治疗非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，或用于治疗酒精性脂肪性肝病。
鉴于诸如性别、年龄和身高等多种因素，有许多领域认可的体重正常范围测量。本文所述的需要治疗或预防方案的患者包括体重超过公认规范的患者或由于遗传、环境因素或其他公认的风险因素而具有比一般人群变得超重或肥胖的风险更高的患者。根据本公开，预期降钙素模拟物可用于治疗糖尿病，其中体重控制是治疗的一个方面。
在一个实施方案中，该方法包括对有此需要以治疗所述病症的患者进行本文所述任何一种药学上有效量的肽的肠内给药。
在一个实施方案中，该方法包括对有此需要以治疗所述病症的患者进行本文所述任何一种药学上有效量的肽的肠胃外给药。对于肠胃外给药(包括腹膜内，皮下，静脉内，皮内或肌内注射)，可以使用例如本发明的肽在芝麻油或花生油或丙二醇水溶液中的溶液。如果需要，水溶液应适当缓冲(优选pH大于8)，并首先使液体稀释剂等渗。这些水溶液适用于静脉注射目的。油性溶液适用于关节内、肌肉内和皮下注射目的。在无菌条件下制备所有这些溶液可通过本领域技术人员熟知的标准制药技术容易地完成。对于肠胃外应用，合适制剂的实例包括溶液，优选油性或水性溶液以及悬浮液、乳液或植入物，包括栓剂。肽可以以多种或单剂量形式配制成无菌形式，例如分散在流体载体中，例如通常与注射剂一起使用的无菌生理盐水或5％盐水葡萄糖溶液。
所述方法可包括确定患者是否患有所述病症的预备步骤，和/或确定所述治疗在何种程度上有效减轻所述患者的病症的后续步骤，例如，在每种情况下，进行口服葡萄糖耐量试验或静息血糖水平。
为了改善对患者体重的控制，产生体重减轻或避免体重增加，活性化合物优选每日一次或多次给药，例如每天至少两次，例如每天2-4次。活性化合物的制剂可含有适合于这种给药方案的单位剂量。可以施用活性化合物以控制正在接受糖尿病或代谢综合征治疗的患者的体重。
口服肠内制剂用于通过吞咽以便随后在胃下方的肠中释放而摄取，并因此通过门静脉递送至肝脏，而不是将制剂保持在口腔中以允许通过舌下或口腔路线转移至血流。
用于本公开的合适剂型包括片剂、迷你片剂、胶囊、颗粒、丸剂、粉末、泡腾固体和可咀嚼的固体制剂。这些制剂可包括明胶，优选水解明胶或低分子量明胶。这样的制剂可以通过冷冻干燥包含降钙素模拟物和水解明胶或低分子量明胶的均匀水溶液并进一步将所得固体材料加工成所述口服药物制剂中获得，并且其中明胶可具有1000至15000道尔顿的平均分子量。此类制剂可包括保护性载体化合物，例如5-CNAC或本文公开的其他化合物。
虽然优选口服制剂如片剂和胶囊，但用于本发明的组合物可以采用糖浆、酏剂等以及栓剂等形式。口服递送通常是选择的递送途径，因为它方便，相对容易且通常无痛，导致相对于其他递送方式更大的患者依从性。然而，生物学、化学和物理障碍，例如胃肠道中的变化的pH，强大的消化酶和活性剂不可渗透的胃肠膜，使得降钙素类肽对哺乳动物的口服递送成为问题，例如，降钙素的口服递送是由哺乳动物甲状腺滤泡旁细胞和鸟类和鱼类的超支气管腺分泌的长链多肽激素，最初证明是困难的，至少部分原因是降钙素在胃肠道中的稳定性不足以及降钙素不能容易地通过肠壁输送到血流中。
然而，合适的口服制剂如下所述。
患者的治疗
在一个实施方案中，以足够的剂量施用本公开的降钙素模拟物以维持患者的模拟物的血清水平每毫升5皮克至500毫微克，优选每毫升50皮克至250毫微克，例如每毫升1至100毫微克。血清水平可通过本领域已知的放射免疫测定技术测量。主治医师可以监测患者的反应，然后可以稍微改变剂量以考虑个体患者的代谢和反应。通过将本公开的所有组分作为单个药丸或胶囊给药，可以最好地实现近同时释放。然而，本公开还包括，例如，将所需量的降钙素模拟物分成两种或更多种片剂或胶囊，可以一起施用，使得它们一起提供所需量的所有成分。如本文所用，“药物组合物”包括但不限于适合于对患者的特定施用的完整剂量，无论是否在给定施用中推荐一种或多种片剂或胶囊(或其他剂型)。
可以使用Unigene
在一个实施方案中，本公开的降钙素模拟物优选以美国专利公开号2009/0317462中已知的方式配制用于口服递送。
在一个实施方案中，本发明的降钙素模拟物可以通过与合适的载体化合物混合而配制用于肠内给药，尤其是口服给药。合适的载体化合物包括美国专利No.5,773,647和美国专利No.5866536中描述的那些，其中，5-CNAC(N-(5-氯水杨酰基)-8-氨基辛酸，通常作为其二钠盐)特别有效。其他优选的载体或递送剂是SNAD(10-(2-羟基苯甲酰氨基)癸酸的钠盐)和SNAC(N-(8-[2-羟基苯甲酰基]氨基)辛酸的钠盐)。在一个实施方案中，本公开的药物组合物包含递送有效量的载体，例如5-CNAC，即足以递送化合物以达到所需效果的量。通常，载体如5-CNAC的存在量为总组合物重量的2.5％至99.4％，更优选总组合物重量的25％至50％。
此外，WO 00/059863公开了式I的二钠盐
其中，
R1，R2，R3和R4独立地为氢，-OH，-NR6R7，卤素，C1-C4烷基或C1-C4烷氧基；
R5为取代或未取代的C2-C16亚烷基，取代或未取代的C2-C16亚烯基，取代或未取代的C1-C12烷基(亚芳基)，或取代或未取代的芳基(C1-C12亚烷基)；R6和R7独立地为氢，氧或C1-C4烷基；其水合物和溶剂化物特别有效地用于口服递送活性剂，例如降钙素，例如鲑鱼降钙素，这些可用于本公开内容。
使用任选微粉化的5-CNAC的优选肠溶制剂通常可如WO2005/014031中所述。
可以使用Bone Medical Limited的Capsitonin产品中使用的方法配制化合物用于口服给药。这些可包括Axcess制剂中包含的方法。更特别地，活性成分可以包封在肠溶胶囊中，该肠溶胶囊能够承受穿过胃的过程。这可以含有活性化合物和亲水性芳香醇吸收增强剂，例如WO02/028436中所述。以已知的方式，肠溶包衣可以以pH敏感的方式变得可渗透，例如pH值为3到7。WO2004/091584还描述了使用芳族醇吸收增强剂的合适的配制方法。
可以使用Oramed产品中所见的方法配制化合物，其可以包括具有ω-3脂肪酸的制剂，如WO2007/029238中所见或如US5,102,666中所述。
通常，可以使用这些载体或递送剂的药学上可接受的盐(尤其是单或二钠盐)、溶剂化物(例如醇溶剂化物)和水合物。
根据本公开的药物组合物的口服给药可以定期完成，例如，每天或每周一次或多次；间歇地，例如在一天或一周内不定期地；或者循环地，例如定期进行数天或数周，然后进行无需给药的周期。本发明公开的实施方案的药物组合物的剂型可以是任何已知的形式，例如，液体或固体剂型。液体剂型包括溶液乳液、悬浮液、糖浆和酏剂。除活性化合物和载体如5-CNAC外，液体制剂还可包括本领域常用的惰性赋形剂，例如增溶剂，例如乙醇；棉籽、蓖麻油和芝麻油等油类；润湿剂；乳化剂；悬浮剂；甜味剂；调味料；和溶剂，如水。固体剂型包括胶囊，软凝胶胶囊，片剂，囊片，粉末，颗粒或其它固体口服剂型，所有这些都可以通过本领域熟知的方法制备。药物组合物可另外包含通常使用的量的添加剂，包括但不限于pH调节剂，防腐剂，食用香料，掩味剂，香料，保湿剂，增效剂，着色剂，表面活性剂，增塑剂，润滑剂如硬脂酸镁，助流剂，压缩助剂，增溶剂，赋形剂，稀释剂如微晶纤维素，例如由FMC公司提供的Avicel PH 102，或其任何组合。其他添加剂可包括磷酸盐缓冲盐、柠檬酸、二醇和其他分散剂。该组合物还可包括一种或多种酶抑制剂，例如放线菌素或表阿霉素及其衍生物；抑肽酶，Trasylol和Bowman-Birk抑制剂。此外，转运抑制剂，即诸如酮基福林的[rho]-糖蛋白，可以存在于本公开的组合物中。本发明的固体药物组合物可通过常规方法制备，例如，通过将活性化合物、载体如5-CNAC和任何其它成分的混合物混合，捏合，并填充到胶囊中，或者代替填充到胶囊中，然后进行模塑，然后进一步压片或压模，得到片剂。另外，可以通过已知方法形成固体分散体，然后进一步加工以形成片剂或胶囊。优选地，本公开的药物组合物中的成分在整个固体剂型中均质或均匀混合。
可替代地，活性化合物可以配制成与所述载体的缀合物，所述载体可以是US2003/0069170中描述的低聚物，例如
化合物
这些缀合物可以与脂肪酸和胆盐一起给药，如其中所述。
可以使用具有聚乙二醇(PEG)的缀合物，如Mansoor等人所述。
可替代地，可以将活性化合物与亚硝基-N-乙酰基-D，L-青霉胺(SNAP)和Carbopol溶液或牛磺胆酸盐和卡巴泊尔溶液混合以形成粘膜粘附乳液。
活性化合物可以通过加载到如Prego等人所公开的壳聚糖纳米胶囊(任选地如Prego Prego C，Torres D，Fernandez-Megia E，Novoa-Carballal R，
用于口服制剂的其他合适策略包括使用Chiasma公司的WO2005/094785中描述的瞬时渗透性增强剂(TPE)系统。TPE利用固体亲水性颗粒在疏水性介质中的油性悬浮液以保护药物分子免于由于恶劣的胃肠(GI)环境失活并同时作用于GI壁以诱导其货物药物分子的渗透。
还包括使用谷胱甘肽或含有许多硫醇基团的化合物，如US2008/0200563中所述，用于抑制外排泵对粘膜的作用。这些技术的实际例子也在以下文献中进行了描述：Caliceti，P.Salmaso，S.，Walker，G.和Bernkop-Schnürch，A.(2004)‘Development and invivo evaluation of an oral insulin-PEG delivery system(开发和体内评价口服胰岛素-PEG递送系统)’，Eur.J.Pharm.Sci.，22,315-323；Guggi，D.，Krauland，A.H.和Bernkop-Schnürch，A.(2003)‘Systemic peptide delivery via the stomach:in vivoevaluation of an oral dosage form for salmon calcitonin(通过胃递送全身肽：体内评估鲑鱼降钙素的口服剂型)’，J.Control.Rel.92,125-135；以及Bernkop-Schnürch，A.，Pinter，Y.，Guggi，D.，Kahlbacher，H.，
如WO2004/084870中所述，活性化合物可以配制在无缝微球中，其中活性药物成分溶解为配制成小球的乳液、微乳液或悬浮液；并通过传统或新颖的涂层技术进行可变涂覆。结果是“预溶解”形式的胶囊化药物，当口服给药时，提供活性药物的预定的即时或持续释放到特定位置并沿胃肠道以特定速率释放。实质上，药物的预溶解增强了其动力学特征的可预测性，同时增强了渗透性和药物稳定性。
可以使用如US2009/0074824中所述的壳聚糖涂覆的纳米胶囊。用这种技术给药的活性分子在纳米胶囊内受到保护，因为它们对胃液的作用是稳定的。此外，该系统的粘膜粘附性质增强了与肠壁粘附的时间(已经证实这些系统的胃肠道转运存在延迟)，有助于更有效地吸收活性分子。
可以使用由TSR1公司开发的方法。这些包括亲水性增溶技术(HST)，其中明胶(一种带有正电荷和负电荷的天然衍生的胶原蛋白提取物)包覆卵磷脂胶束中包含的活性成分的颗粒并防止它们聚集或结块。这导致疏水性药物颗粒通过极性相互作用改善的润湿性。此外，两亲性卵磷脂降低了溶解流体和颗粒表面之间的表面张力。
活性成分可以与葫芦脲一起配制为赋形剂。
可替代地，可以使用Merrion Pharmaceuticals的GIPET技术来生产含有活性成分和吸收促进剂的肠溶衣片剂，所述吸收促进剂可以是US2007/0238707中描述的中链脂肪酸或中链脂肪酸衍生物或如US7268214中所述的膜转位肽。
可以采用GIRESTM技术，其由可充气袋内的控释剂型组成，置于药物胶囊中用于口服给药。在胶囊溶解后，气体发生系统使胃中的小袋膨胀。在临床试验中，已经证明小袋在胃中保留16-24小时。
可替代地，活性物质可以与保护性改性剂缀合，使其能够承受胃中的酶促降解并促进其吸收。活性物质可以与单分散的短链甲氧基聚乙二醇糖脂衍生物共价缀合，所述衍生物在纯化后结晶并冻干成干燥的活性药物成分。这些方法描述于US5438040和www.biocon.com中。
人们还可以使用肝脏定向囊泡(HDV)进行主动递送。HDV可以由包封活性物质的脂质体(直径≤150nm)组成，其在其脂质双层中还含有肝细胞靶向分子。靶向分子指导包封的活性物质向肝细胞的递送，因此需要相对微量的活性物质才能起作用。这种技术在US2009/0087479中进一步描述，并且在www.diasome.com中进一步描述。
所述活性物质可以掺入组合物中，所述组合物另外含有包含醇和共溶剂的基本上非水性的亲水性介质，与中链部分甘油酯组合，任选地与US2002/0115592中关于胰岛素所描述的长链PEG物质的混合。
可替代地，可以使用以下文献中所述的肠道贴剂：Shen Z，Mitragotri S，PharmRes.2002年4月；19(4)：391-5‘Intestinal patches for oral drug delivery(用于口服给药的肠道贴剂)’。
如美国专利No.7189414中所述，活性物质可以掺入由与疏水聚合物共混的水凝胶形成的易蚀基质中。
待治疗的成年人的合适口服剂量水平可以为0.05至5mg，优选约0.1至2.5mg。
患者的剂量治疗频率可以是每天1至6次，例如每天2至4次。理想的是，治疗将维持至少6周的延长期，优选至少6个月的延长期，优选至少一年的延长期，并且任选地终生的延长期。
可以使用根据本公开的组合物和单独施用一种或多种其他治疗剂来进行相关病症的组合治疗。或者，根据本公开的组合物可以掺入一种或多种其他治疗剂用于联合给药。
根据本公开的组合疗法包括如所述的活性化合物与胰岛素、GLP-2、GLP-1、GIP或胰淀素的组合，或通常与其他抗糖尿病的组合。因此，包括共同制剂的联合治疗可以用胰岛素敏化剂制备，包括双胍，如二甲双胍，丁福明和苯乙双胍，TZD's(PPAR)如巴拉格列酮，吡格列酮，利格列酮，罗格列酮和曲格列酮，双重PPAR激动剂如阿格列扎，莫格他唑和替格列扎，或促分泌剂，包括磺酰脲类如卡泊胺，氯丙酰胺，格列齐特，甲苯磺酰胺，拉磺脲，格列吡嗪，格列本脲，格列本脲，格列喹酮，格列吡嗪和格列美脲，格列奈脲/格列奈类(K+)，如那格列奈，瑞格列奈和米格列奈，GLP-1类似物，如艾塞那肽，利拉鲁肽和阿利昔肽，DPP-4抑制剂，如阿格列汀，利格列汀，沙格列汀，西他列汀和维达列汀，胰岛素类似物或特殊制剂，如(快速作用)赖脯胰岛素，门冬胰岛素，谷赖胰岛素，(长效)胰岛素甘精胰岛素，地特胰岛素)，可吸入胰岛素-Exubra和NPH胰岛素，以及其他包括α-葡萄糖苷酶抑制剂如阿卡波糖，米格列醇和伏格列波糖，胰淀素类似物如普兰林肽，SGLT2抑制剂如达格列净，瑞格列净和舍格列净以及杂项包括苯氟雷司和托瑞司他。
进一步的组合包括与瘦素共同施用或共同配制。瘦素抵抗是2型糖尿病中公认的成分；然而，到目前为止，瘦素的注射未能在这种情况下改善。相反，有证据支持胰淀素并且因此支持具有类胰淀素能力的分子，如鲑鱼降钙素模拟物，能够改善瘦素敏感性。胰淀素/瘦素组合显示出对体重和食物摄入以及胰岛素抗性的协同作用[Kusakabe T等]。
具体实施方式
图1：KBP-046-KBP-054(图1A)和KBP-058-KBP-063(图1B)的β-抑制蛋白募集剂量反应与降钙素受体活化的函数关系。剂量范围为1μM至15pM，数据显示为载体折叠。在DiscoveRx的U20S CALCR Pathhunter细胞中进行筛选。
图2：KBP-046-KBP-054(图2A)和KBP-058-KBP-063(图2B)的β-抑制蛋白募集剂量反应与胰淀素受体活化的函数关系。剂量范围为1μM至15pM，数据显示为载体折叠。在DiscoveRx的CHO-K1 CALCR RAMP3 Pathhunter细胞中进行筛选。
图3：KBP-046-KBP-054(图3A)和KBP-058-KBP-063(图3B)和人降钙素的长期β-抑制蛋白募集与与降钙素受体活化的函数关系。在t＝0时单剂量为100nM，在初始治疗后3、6、24、48和72小时后，评估β-抑制蛋白募集以研究每种配体的延长电位。数据显示为载体折叠。在DiscoveRx的U20S CALCR Pathhunter细胞中进行筛选。
图4：KBP-046-KBP-054(图4A)和KBP-058-KBP-063(图4B)对SD大鼠的食物摄入的持续减弱。在单次s.c剂量的2.5μg/kg KBP后，以0-4h和4-24h的间隔监测食物摄入以评估单个KBP的延长作用。将各个大鼠单笼，每组n＝4。
发明详述
实施例
在以下实施例中描述了目前公开的实施方案，所述实施方案是为了帮助理解本公开而提出的，并且不应该被解释为以任何方式限制在随后的权利要求中限定的本公开的范围。提出以下实施例以向本领域普通技术人员提供如何制备和使用所述实施方案的完整公开和描述，并且不旨在限制本公开的范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保关于所使用的数字(例如量、温度等)的准确性，但是应该考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，份数是重量份，分子量是重均分子量，温度是摄氏度，压力是大气压或接近大气压。
在以下实施例中，使用以下材料和方法。
购买以下表达降钙素、胰淀素和CGRP受体的细胞系，并根据制造商的说明进行培养。
1.降钙素受体(CTR)：来自DiscoveRx的U20S-CALCR(目录号：93-0566C3)。
2.胰淀素受体(AMY-R)：来自DiscoveRx的CHO-K1 CALCR+RAMP3(目录号：93-0268C2)。
在独立的生物测定中，CTR和AMY-R细胞在指定的时间点处理，表1中鉴定的KBP剂量增加(1000,250,62.5,15.6,3.9,1.0,0.24,0.06,0.02nM和载体)。
实施例1：β-抑制蛋白测定
PathHunterβ-抑制蛋白GPCR测定是全细胞功能测定，其通过检测β-抑制蛋白与活化的GPCR的相互作用直接测量配体激活GPCR的能力。由于β-抑制蛋白募集不依赖于G蛋白信号传导，因此这些测定提供了强大且通用的筛选和分析平台，可用于几乎任何Gi-，Gs或Gq偶联受体。
在该系统中，GPCR与小酶片段ProLinkTM框内融合，并在稳定表达β-抑制蛋白融合蛋白和β-gal的较大N末端缺失突变体(称为酶受体或EA)的细胞中共表达。GPCR的活化刺激β-抑制蛋白与ProLink标记的GPCR的结合，并迫使两个酶片段互补，导致活性β-gal酶的形成。这种相互作用导致酶活性的增加，其可以使用化学发光
该测定在白色384孔板(Greiner Bio-One，784080)中进行。在实验前一天，将细胞以每孔2500个细胞接种在10μL细胞类型特异性培养基中。为了量化GPCR介导的β-抑制蛋白募集，使用PathhunterTM检测试剂盒(93-0001，DiscoverX)，并根据制造商的说明进行测定。此外，来自PathhunterTMβ-抑制蛋白募集测定的数据被标准化为内标，以改善顶级KBP表现者和非表现者之间的区别。
结果见图1、图2和图3。如图1所示，肽的活性非常相似；然而，随着时间的增加，KBP-047，KBP-053(图3A)和KBP-058，062和063(图3B)显示出优异的活化和维持CTR激活的能力，如图3所示，其中各配体在一个给定浓度下并作为时间的函数绘制。这里显然KBP-047，KBP-053，KBP-058，KBP-062和KBP-063在延长的降钙素受体活化方面优于其他肽。这是使用来自DiscoveRx(目录号：93-0566C3)细胞系的降钙素受体(CTR)：U20S-CALCR进行的，与经典的3小时输出不同，β-抑制蛋白累积在24、48和72小时内进行，然后进行分析。
这类分子的另一个重要特征是激活胰淀素受体的能力。如图2A和2B所示，KBP完全能够激活该受体，KBP-047，KBP-053，KBP-058，KBP-062和KBP-063被证明是有效的胰淀素激动剂。在图的子集中，β-抑制蛋白测定法用于评估延长的受体活化。
实施例2：健康Sprague Dawley大鼠中KBP-047到KBP-063对食物摄取的比较作用。
在个体测试前四天将大鼠单笼。将它们按重量随机分成7组(载体(0.9％NaCl)，KBP(剂量：2.5μg/kg)。它们禁食过夜，然后在早晨使用单剂量的肽或载体进行皮下给药来进行处理。以下列间隔(0-4小时和4-24小时)监测食物摄入。
如图4A所示，KBP-047和KBP-053均在4小时间隔内导致食物摄入减少，效果维持在24小时，KBP-047减少幅度最大，紧随其后的是KBP-053。
如图4B所示，KBP-058，KBP-062和KBP-063均在4小时间隔内导致食物摄入减少，并且效果维持在24小时，KBP-062减少幅度最大，其次是KBP-058和KBP-063按此顺序排列。表2中列出了作为hCT同源性函数的食物摄入概览。
总体而言，KBP-062具有与筛选中相应的最佳性能结合的高hCT同源性的最佳组合。
在本说明书中，除非另有明确说明，否则在运算符意义上使用词语“或”，当满足所述条件中的任何一个或两个时返回真值，而不是在要求只满足其中一个条件的运算符“异或”意义上使用。“包含”一词在“包括”而不是用于表示“由......组成”的意义上使用。以上公开的所有先前教导在此引入作为参考。
序列表
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<120>用于治疗疾病和病症的降钙素模拟物
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<160> 26
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> 鲑鱼（Salmonidae）
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<223> 鲑鱼降钙素（salmon calcitonin）
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<213> 鳗鱼（Anguilliformes）
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<223> 鳗鱼降钙素（eel calcitonin）
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<213> 鸡（Gallus）
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<223> 鸡降钙素（chicken calcitonin）
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<213> 小鼠（Murinae）
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<223> 小鼠降钙素（mouse calcitonin）
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<213> 大鼠（Rattus）
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<223> 大鼠降钙素（Rat calcitonin）
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<213> 马（Equidae）
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<223> 马降钙素（Horse calcitonin）
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<213> 犬（Canidae）
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<223> 犬-1降钙素（canine-1 calcitonin）
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<213> 犬（Canidae）
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<223> 犬-2降钙素（canine-2 calcitonin）
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<213> 猪（Suidae）
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<223> 猪降钙素（Porcine calcitonin）
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<213> 智人（Homo sapiens）
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<223> 人降钙素（Human calcitonin）
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> KBP-061
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<223> KBP-063
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Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Met Leu Gly Arg Leu Ser Gln Asp Leu
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Asn Lys Phe His Thr Phe Pro Gln Thr Asp Val Gly Ala Asn Ala Pro
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<210> 26
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
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<221>
<222>
<223> 通用肽（Generic peptide）
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<221> SITE
<222> 8
<223> X为M或V
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<221> SITE
<222> 13
<223> X为T或S
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<221> SITE
<222> 16
<223> X为F或L
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<221> SITE
<222> 17
<223> X为N或H
<220>
<221> SITE
<222> 19
<223> X为F或L
<220>
<221> SITE
<222> 20
<223> X为Q或H
<220>
<221> SITE
<222> 24
<223> Q或K
<400> 26
Cys Gly Asn Leu Ser Thr Cys Xaa Leu Gly Arg Leu Xaa Gln Asp Xaa
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Xaa Lys Xaa Xaa Thr Phe Pro Xaa Thr Asp Val Gly Ala Asn Ala Pro
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