阅读说明：本技术 一种利用抗体芯片检测食管癌组织的方法 (Method for detecting esophageal cancer tissue by using antibody chip ) 是由 韩俊永 薛士杰 陈金烟 王坤 金静君 于 2019-11-11 设计创作，主要内容包括：本专利针对食管癌组织芯片的免疫组织化学常用技术进行改良,使的改良后芯片免疫组织化学技术更加节省抗体、背景更加清晰和显色效果更佳。(This patent improves to the immunohistochemistry common technique of esophagus cancer tissue chip, and the improvement back chip immunohistochemistry technique that makes saves the antibody more, the background is clearer and the color development effect is better.)

一种利用抗体芯片检测食管癌组织的方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种利用抗体芯片检测食管癌组织的方法。

背景技术

我国是食管癌发生人数最多的国家，其中太行山脉地区为我国食管癌高发地区。据中国恶性肿瘤评估结果显示，我国食管癌的平均每天新发病例和平均每天死亡病例在恶性肿瘤中排行前四位，多年的大量研究表明食管癌受遗传因素和环境因素的影响。

食管癌患者的预后与其发现日期密切相关，但临床上首次被确诊为食管癌的患者中，95％以上为中晚期。研究表明：早期食管癌的五年生存率大约为90％，而中晚期患者的5年生存率约为10％。因此，筛选食管癌高危人群以及建立食管癌风险预警是降低食管癌患者死亡率的关键所在。

目前，利用抗体芯片检测食管癌是食管癌组织检测的常用方法之一，但现有的抗体芯片检测试剂盒存在组织粘附不牢固、容易脱片、背景不清晰、显色效果不好以及抗体使用量大的缺陷，基于此，本发明通过改进，提供一种更佳的食管癌抗体芯片检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用抗体芯片检测食管癌组织的方法，与现有技术相比，组织粘附更加牢固，不容易脱片；脱蜡更加彻底，利于后面的抗原修复和呈现清晰背景；更加节约一抗的使用量，并且显色效果更加。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种利用抗体芯片检测食管癌组织的方法，包括以下步骤：

（1）将组织芯片放入烘箱中，温度调至65度，烘蜡12小时；

（2）配制试剂：配制10×PBS缓冲液、柠檬酸修复液、EDTA修复液；

（3）片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡；

脱蜡过程：二甲苯三缸，每缸时间分别为4分钟、3分钟和3分钟；无水乙醇一缸，时间为3分钟；95v/v%酒精两缸，每次2分钟；80v/v%酒精1缸，2分钟；

（4）从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，每次 1分钟；冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电磁炉上开始加热；

（5）抗原修复：柠檬酸高压修复：柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待持续出气后开始计时，1分钟40秒时间到后终止加热，置于室温中，冷却1小时后打开盖子；EDTA热修复：EDTA修复液加热沸腾后放入片子，计时10分钟，置于室温中，冷却1小时后打开盖子；

（6）配制内源性过氧化物酶阻断剂；

（7）用3ml免疫组化笔(福州迈新)将组织圈定在最小范围内，然后在圈内滴加阻断剂，时间10分钟；

（8）取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟；

（9）冰箱中取出一抗，放入离心机里7200rpm/min离心30秒；

（10）取出一抗，按照稀释度用DAKO抗体稀释液稀释；

（11）滴加一抗；

（12）甩去多余液体，将芯片置于湿盒内，在圈内滴加一抗，室温孵育3小时；

（13）将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟；

（14）滴加DAKO公司的EnVision™+/HRP兔工作液或EnVision™+/HRP鼠工作液，滴至能完全覆盖组织，孵育30分钟；

（15）时间到后用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟；

（16）从冰箱里取出DAB试剂盒，按1mlDAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；（来自DAKO液体DAB+底物系统）

（17）在片子上滴加稀释后的DAB，滴至能完全覆盖组织，显色5分钟，到时后自来水冲洗5分钟；

（18）在片子上滴加哈氏苏木素（SIGMA）至能完全覆盖组织40秒，时间到后在0.25%的盐酸酒精中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟；

（19）将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片；

脱水过程：75%酒精1缸，5分钟；85%酒精1缸，5分钟；95%酒精1缸，5分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟；二甲苯两缸，每缸15分钟。

步骤（2）所述10×PBS缓冲液的配方为：80g NaCl、2g KCl、15.35g Na₂HPO₄、2gKH₂PO₄，用纯水定容至1000毫升，pH=7.2；

所述柠檬酸修复液的配制方法为：82mL 0.1mol/L的柠檬酸钠溶液+18mL 0.1mol/L的柠檬酸溶液+900毫升的纯水置于高压锅中；

所述EDTA修复液的配制方法为：将pH=9.0的50*EDTA抗原修复液（福州迈新生物技术开发有限公司）用纯水稀释50倍。

步骤（6）所述内源性过氧化物酶阻断剂的配制方法为：38.4ml无水甲醇+12ml30v/v%的H₂O₂+9.6ml纯水。

所述PBS缓冲液的配制方法为，将步骤（2）中10×PBS缓冲液至1×PBS缓冲液，再在1×PBS缓冲液中加入占总体积0.05%的吐温试剂。

步骤（18）所述0.25%的盐酸酒精的配制方法为：400mL 70v/v%酒精+1ml浓盐酸。

本发明的优点在于：

（1）组织粘附更加牢固，不容易脱片；

（2）脱蜡更加彻底，利于后面的抗原修复和呈现清晰背景；

（3）更加节约一抗的使用量；

（4）显色效果更加。

附图说明

图1为实施例1和对比例1显色效果及背景清晰度对比图。

具体实施方式

实施例1 一抗来源兔和鼠，所用食管癌组织芯片由上海芯超生物科技有限公司提供，产品编号：HEso-Squ060CD-01。

1．将组织芯片放入烘箱中，温度调至65度，烘蜡12小时。

2．配制试剂。

2.1 10×PBS缓冲液（配方：80g NaCl、2g KCl、15.35g Na₂HPO₄、2g KH₂PO₄，用纯水定容至1000毫升，pH=7.2）：将10×PBS缓冲液稀释至1×PBS缓冲液，再在1×PBS缓冲液中加入占总体积0.05%的吐温试剂；

2.2 抗原修复液(pH=5.96)

柠檬酸修复液：82毫升0.1mol/L的柠檬酸钠溶液+18毫升0.1mol/L的柠檬酸溶液+900毫升的纯水置于高压锅中；

EDTA修复液：PH=9.0的50*EDTA抗原修复液（福州迈新生物技术开发有限公司）用纯水稀释50倍。

3. 片子烘烤完成后，从烘箱内取出，放入全自动染色机中，进行脱蜡；

脱蜡过程：二甲苯三缸，每缸时间分别为4分钟、3分钟和3分钟；无水乙醇1缸，时间为3分钟；95 v/v %酒精两缸，每次2分钟；80 v/v %酒精1缸，2分钟。

4. 从染色机中取出片子，用纯水冲洗3次，一次1分钟。冲洗过程中将柠檬酸修复液放至电磁炉上开始加热。

5. 抗原修复：

柠檬酸高压修复：柠檬酸修复液沸腾后，将片子放入高压锅中，盖上高压锅盖，待持续出气后开始计时，1分钟40秒。时间到后终止加热，置于室温中，冷却1小时后打开盖子；EDTA热修复：加热沸腾后放入片子，计时10分钟，置于室温中，冷却1小时后打开盖子。

6. 配制内源性过氧化物酶阻断剂。38.4ml无水甲醇+12ml 30%浓度的H₂O₂+9.6ml纯水。

7. 用3ml免疫组化笔（福州迈新生物技术开发有限公司）将组织圈定在最小范围内，然后在圈内滴加阻断剂，时间10分钟。

8. 取出片子，用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟。

9. 冰箱中取出一抗，放入离心机里7200转离心30秒。

10. 取出一抗，按照一抗说明书标注的稀释度用DAKO抗体稀释液稀释。

11. 滴加一抗。

12. 甩去多余液体，将芯片置于湿盒内，在圈内滴加一抗，室温孵育3小时。

13. 将片子用PBS缓冲液冲洗3次，一次1分钟。

14. 滴加DAKO公司的EnVision™+/HRP兔工作液或EnVision™+/HRP鼠工作液，滴至能完全覆盖组织，孵育30分钟。

15. 时间到后用PBS冲洗3次，一次1分钟。

16. 从冰箱里取出DAB试剂盒，按1mlDAB稀释液+1滴DAB色原进行配制；（来自DAKO液体DAB+底物系统）。

17. 在片子上滴加步骤16稀释后的DAB，滴至能完全覆盖组织，显色5分钟，到时后自来水冲洗5分钟。

18. 在片子上滴加哈氏苏木素（SIGMA）至能完全覆盖组织40秒，时间到后在0.25%的盐酸酒精(400ml70%酒精+1ml浓盐酸)中浸没2秒，用自来水冲洗2分钟。

19. 将片子放入全自动染色机进行脱水，取出封片。

脱水过程：75%酒精1缸，5分钟；85%酒精1缸，5分钟；95%酒精1缸，5分钟；无水乙醇两缸，每缸7分钟；二甲苯两缸，每缸15分钟。

对比例1

利用一抗来源的兔和鼠，用上海芯超生物科技有限公司提供的食管癌组织芯片的方法进行检测，作为对照试验；产品编号HEso-Squ060CD-01。相同条件下，显色效果及背景清晰度对比图如图1所示，经过技术改良后，改良组对比对照组，相同试验条件下可以看出改良组组织更加不容易脱片，呈现的胞浆染色比对照组效果更加突出，整个组织背景更加清晰，实验组更加有利于保持组织完整性和可以更好地呈现试验的真实结果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。