阅读说明：本技术 一种含肉桂醛的化妆品致敏性的检测方法 (Method for detecting sensitization of cosmetics containing cinnamaldehyde ) 是由 吴熙 王平 郭煜堂 刁璇 王晓炜 李军 秦美蓉 黄泽愉 陈宁 冼静雯 王钢力 于 2019-10-14 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种含肉桂醛的化妆品致敏性的检测方法,所述检测方法包括：将待测化妆品样品溶液和多肽贮备液反应,通过液相色谱测试多肽反应前后的响应值,计算多肽的消耗百分比,从而判断致敏性；该检测方法不仅适用于化妆品用原料肉桂醛潜在的致敏性评价,还适用于成品化妆品(含有不同含量的肉桂醛)潜在致敏性评价,该检测方法具有灵敏度高、准确性好、使用范围广、价格低廉,满足企业生产和实际应用中对快筛快检的需求。(The invention provides a method for detecting sensitization of cosmetics containing cinnamaldehyde, which comprises the following steps: reacting a cosmetic sample solution to be detected with a polypeptide stock solution, testing response values before and after the polypeptide reaction through liquid chromatography, and calculating the consumption percentage of the polypeptide so as to judge the allergenicity; the detection method is suitable for potential sensitization evaluation of the cosmetic raw material cinnamaldehyde, is also suitable for potential sensitization evaluation of finished products (containing cinnamaldehyde with different contents), has the advantages of high sensitivity, good accuracy, wide application range and low price, and meets the requirements of enterprise production and practical application on quick screening and quick detection.)

一种含肉桂醛的化妆品致敏性的检测方法

技术领域

本发明属于化妆品毒理检测领域，涉及一种含肉桂醛的化妆品致敏性的检测方法，尤其涉及一种含肉桂醛的化妆品引起皮肤发生***反应的检测方法。

背景技术

肉桂醛是化妆品成分里较为常用的一种香料，在关于化妆品的规定中指出了26种芳香类化合物过敏原，肉桂醛也属于其中一种。同时，由于肉桂醛具有促进血液循环、防腐杀菌的功能，人们将这一功效应用于按摩液等化妆品产品。然而，目前该方法仅用于单一成分化妆品原料或已知组成且成分简单的化妆品用化学原料潜在致敏性的评价，不能用于复杂未知组成的混合物或化妆品成品的检测。这限制了对化妆品成品***反应的直接预测，拉大了对化妆品引起***反应临床检测应用的距离。

因此，提供一种能够用于复杂未知组成的混合物或化妆品成品中肉桂醛致敏性的检测方法非常有必要。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含肉桂醛的化妆品致敏性的检测方法，该检测方法不仅适用于化妆品用原料肉桂醛潜在的致敏性评价，还适用于成品化妆品(含有不同含量的肉桂醛)潜在致敏性评价，该检测方法具有灵敏度高、准确性好、使用范围广、价格低廉，满足企业生产和实际应用中对快筛快检的需求。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的目的在于提供一种含肉桂醛的化妆品致敏性的检测方法，所述检测方法包括：将待测化妆品样品溶液和多肽贮备液反应，通过液相色谱测试多肽反应前后的响应值，计算多肽的消耗百分比，从而判断致敏性。

本发明提供的检测方法不仅适用于化妆品用原料肉桂醛潜在的致敏性评价，还适用于成品化妆品(含有不同含量的肉桂醛)潜在致敏性评价，且不需要进行系列浓度标准溶液的配制，该检测方法具有灵敏度高、准确性好、使用范围广、价格低廉、分析周期短，对从业人员操作要求低等优点，满足企业生产和实际应用中对快筛快检的需求。

本发明在检测多肽含量过程中，成品的基质不会干扰多肽在液相色谱中的特征峰。

本发明是利用多肽和有致敏性的受试物模拟皮肤蛋白共同孵育，导致多肽量减少，通过测定多肽量，计算多肽的消耗百分比，从而判断受试物的皮肤致敏性。

在本发明中，所述多肽储备液包括半胱氨酸多肽贮备液和赖氨酸多肽贮备液。

在本发明中，所述半胱氨酸多肽贮备液的制备方法包括：将半胱氨酸多肽用pH为7.5±0.5的磷酸盐缓冲液配制成浓度为0.667mmol/L的半胱氨酸多肽贮备液。

在本发明中，所述半胱氨酸多肽的纯度为90-99.9％，例如90％、92％、95％、97％、99.9％等。

在本发明中，所述pH为7.5±0.5的磷酸盐缓冲液的配置方法包括：取浓度为0.1mol/L磷酸二氢钠溶液与浓度为0.1mol/L磷酸氢二钠溶液混合，得到pH为7.5±0.5的磷酸盐缓冲液。

在本发明中，以磷酸二氢钠溶液的添加体积为18mL计，所述磷酸氢二钠溶液的添加体积为82mL。

在本发明中，所述赖氨酸多肽贮备液的制备方法包括：将赖氨酸多肽用pH为10.2的醋酸铵缓冲液配制成浓度为0.667mmol/L的赖氨酸多肽贮备液。

在本发明中，所述赖氨酸多肽的纯度为90-99.9％，例如90％、92％、95％、97％、99.9％等。

在本发明中，所述pH为10.2的醋酸铵缓冲液的配置方法包括：将醋酸铵加水溶解，用氨水调节pH值，得到pH为10.2的醋酸铵缓冲液。

在本发明中，以醋酸铵的添加量为1.542g计，所述水的添加体积为200mL。

在本发明中，所述检测方法包括：

(1)将待测化妆品样品溶液和半胱氨酸多肽储备液反应，用液相色谱测试反应前后半胱氨酸多肽的响应值，计算半胱氨酸多肽的消耗百分比。

(2)将待测化妆品样品溶液和赖氨酸多肽储备液反应，用液相色谱测试反应前后赖氨酸多肽的响应值，计算赖氨酸多肽的消耗百分比。

(3)将步骤(1)得到的半胱氨酸多肽的消耗百分比和步骤(2)得到的赖氨酸多肽的消耗百分比取平均值M，根据平均值M判断含肉桂醛的化妆品的致敏性。

在本发明中，步骤(1)中所述反应包括：取750μL半胱氨酸多肽贮备液、200μL乙腈和50μL待测化妆品样品溶液混合反应。

在本发明中，步骤(2)中所述反应包括：取750μL赖氨酸多肽贮备液和250μL待测化妆品样品溶液混合反应。

在本发明中，所述反应为避光反应。

在本发明中，所述反应的时间为15-24h，例如15h、18h、20h、22h、24h等。

在本发明中，所述检测方法还包括将反应后得到的反应物进行分离。

在本发明中，所述分离的方法包括先进行离心，而后将离心得到的下层清液进行过滤。

在本发明中，所述离心的速率为2000-6000r/min，例如2000r/min、2500r/min、3000r/min、3500r/min、4000r/min、4500r/min、5000r/min、5500r/min、6000r/min等。

在本发明中，所述离心的时间为5-15min。

在本发明中，所述待测化妆品样品溶液为待测化妆品样品的乙腈溶液。

在本发明中，以待测化妆品样品的添加量为0.5-1.5g(例如0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1.0g、1.1g、1.2g、1.3g、1.4g、1.5g等)计，乙腈的添加量为0.75-2.25mL(例如0.75mL、1mL、1.25mL、1.5mL、1.75mL、2mL、2.25mL等)。

在本发明中，所述响应值为液相色谱特征峰的峰面积。

在本发明中，所述液相色谱的检测器为DAD检测器。

在本发明中，所述液相色谱的紫外吸收波长为220nm。

在本发明中，所述液相色谱的流速为0.5-2mL/min，例如0.5mL/min、0.75mL/min、1mL/min、1.25mL/min、1.5mL/min、1.75mL/min、2mL/min等，优选1mL/min。

在本发明中，所述液相色谱的柱温为20-30℃，例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃等，优选25℃。

在本发明中，所述液相色谱的进样量为5-20μL，例如5μL、8μL、10μL、12μL、15μL、17μL、20μL等，优选10μL。

在本发明中，所述液相色谱的色谱柱的内径为4.6mm，长度为150mm，粒径为3.5μm。

在本发明中，所述液相色谱的色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18。

在本发明中，所述液相色谱的色谱柱保护柱为Phenomenon C-18。

在本发明中，所述液相色谱的流动相包括水和乙腈。

本发明中流动相采用的水为含0.1％三氟乙酸的水溶液；乙腈为含0.085％三氟乙酸的乙腈溶液。

在本发明中，所述液相色谱采用的洗脱方式为梯度洗脱。

在本发明中，所述梯度洗脱的流程为：以水和乙腈的体积加和为100％计，在第0-10min内，水的体积百分含量由87％连续降低至64％，乙腈的体积百分含量由13％连续增大至36％。第10-11min内，水的体积百分含量由64％连续降低至10％，乙腈的体积百分含量由36％连续增大至90％。第11-14min内，水的体积百分含量恒定为10％，乙腈的体积百分含量恒定为90％。第14-14.5min内，水的体积百分含量由10％连续增加至87％，乙腈的体积百分含量由90％连续降低至13％。第14.5-22min内，水的体积百分含量恒定为87％，乙腈的体积百分含量恒定为13％。

本发明通过外标法确认试验条件有效，相较于系列标准溶液法，步骤简单，分析周期缩短，对从业人员要求低。选用特定的色谱柱以及配合使用特定的洗脱方式，便于混合物的液相色谱图中的峰能够有效的分开，且其他峰以及基质均不会干扰多肽的特征峰；若换用其他色谱柱或者其他的洗脱条件，则液相谱图中的其他干扰峰不能和多肽的特征峰有效的分离开来，且基质也会对多肽的特征峰产生干扰，从而会影响测试的准确性以及灵敏度。

在本发明中，所述检测方法还包括空白对照、溶剂对照、样品对照以及阳性对照。

本发明中，对照试验包括对照试验A、对照试验B和对照试验C及样品对照，对照试验A是为了说明检测仪器的稳定性，对照试验B是为了说明检测过程中多肽的稳定性，对照试验C是为了说明溶剂对反应没有干扰，样品对照用来确定受试物中的峰与半胱氨酸多肽或赖氨酸多肽峰是否存在叠加。

在本发明中，化妆品样品和与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽均不发生共洗脱，所述步骤(3)中判断标准为：0％≤平均值M≤6.38％，反应等级为1级，致敏性为阴性。6.38％<平均值M≤22.62％，反应等级为2级，致敏性为阳性。22.62％<平均值M≤42.47％，反应等级为3级，致敏性为阳性。42.47％<平均值M≤100％，反应等级为4级，致敏性为阳性。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的含肉桂醛的化妆品致敏性的检测方法，该检测方法不仅适用于化妆品用原料肉桂醛潜在的致敏性评价，还适用于成品化妆品(含有不同含量的肉桂醛)潜在致敏性评价，该检测方法具有灵敏度高、准确性好、使用范围广、价格低廉、分析周期短，对从业人员操作要求较低等优点，满足企业生产和实际应用中对快筛快检的需求。

附图说明

图1为对照组A中半胱氨酸多肽空白对照样的液相色谱图；

图2为对照组A中赖氨酸多肽空白对照样的液相色谱图；

图3为对照组C中半胱氨酸多肽空白对照样的液相色谱图；

图4为对照组C中赖氨酸多肽空白对照样的液相色谱图；

图5为样品对照(对照组D)的半胱氨酸多肽液相色谱图；

图6为样品对照(对照组D)的赖氨酸多肽液相色谱图；

图7为对照组E中半胱氨酸多肽阳性对照样的液相色谱图；

图8为对照组E中赖氨酸多肽阳性对照样的液相色谱图；

图9为化妆品样品测试溶液对半胱氨酸多肽消耗的液相色谱图；

图10为化妆品样品测试溶液对赖氨酸多肽消耗的液相色谱图；

图11为对比例1中半胱氨酸多肽标准溶液(浓度为0.58mM)的液相色谱图；

图12为对比例1中赖氨酸多肽标准溶液(浓度为0.58mM)的液相色谱图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例1

本实施例提供一种含肉桂醛的化妆品致敏性的检测方法，包括如下步骤：

(1)多肽标准溶液的配置

1-1、半胱氨酸多肽标准溶液的配置：

第一步、取浓度为0.1mol/L磷酸二氢钠溶液18mL与浓度为0.1mol/L磷酸氢二钠溶液82mL混合，得到pH为7.5的磷酸盐缓冲液；

第二步、称取质量m1＝12.87mg和m2＝13.02mg的半胱氨酸多肽(Ac-RFAACAA-COOH，型号p15224-1，厂家上海生工)两份，分别置于两个25mL的棕色容量瓶中，用pH为7.5的磷酸盐缓冲液进行稀释，得到C1(浓度)＝0.686mM的半胱氨酸多肽贮备液和C2(浓度)＝0.694mM的半胱氨酸多肽贮备液；

第三步、将C1(浓度)＝0.686mM和C2(浓度)＝0.694mM的半胱氨酸多肽贮备液分别用乙腈稀释得到STD1(浓度)＝0.5831mM的半胱氨酸多肽标准溶液和STD1(浓度)＝0.5899mM的半胱氨酸多肽标准溶液。

1-2、赖氨酸多肽标准溶液的配置：

第一步、将1.542g醋酸铵加200mL水溶解，用氨水调节pH值，得到pH为10.2的醋酸铵缓冲液；

第二步、称取质量m3＝13.07mg和m4＝13.08mg的赖氨酸多肽(Ac-RFAAKAA-COOH，型号p15224-2，厂家上海生工)两份，分别置于两个25mL的棕色容量瓶中，用pH为10.2的醋酸铵缓冲液进行稀释，得到C3(浓度)＝0.674mM的赖氨酸多肽贮备液和C4(浓度)＝0.674mM的赖氨酸多肽贮备液；

第三步、将C3(浓度)＝0.674mM和C4(浓度)＝0.674mM的赖氨酸多肽贮备液分别用乙腈稀释得到STD3(浓度)＝0.5729mM的赖氨酸多肽标准溶液和STD4(浓度)＝0.5729mM的赖氨酸多肽标准溶液。

本实施方式中为保证测试结果的准确性，半胱氨酸多肽标准溶液和赖氨酸多肽标准溶液均采用现配现用的方式，半胱氨酸多肽贮备液和赖氨酸多肽贮备液的保存期限为24h。

本实施方式中采用外标法确认试验条件准确有效，相对于系列标准溶液法，具有步骤简单、分析周期缩短，对从业人员的要求较低。

(2)化妆品样品的预处理：

第一步：分别取1g不同型号的受试化妆品样品(受试化妆品样品中肉桂醛的含量见表1)溶于1.5mL乙腈(色谱纯，厂家默克公司)中，混合均匀，得到相对应的受试物化妆品溶液；

表1

第二步：配置液相测试溶液M组和N组(M组和N组的配置方法见表2)，室温条件下避光反应24h，得到反应后的待测溶液M组和N组；

表2

第三步：将第二步得到的反应后的待测溶液M组和N组用离心机(型号centrifuge5810R，厂家eppendorf)离心，离心机设置的转速为4000r/min，离心时间为5min，离心结束后取下层清液，用尺寸为0.45μm的滤膜进行过滤，得到预处理后的样品。

(3)对照组的配置(见表3)：

表3

其中，对照组A进样当天配置即可，无需放置24h，其作用是为了验证高效液相色谱的稳定性；对照组B需要和样品同样的处理方法，即需要反应24h，并进行离心和过滤，其在后续液相色谱测试时在进样序列的开始和结束时均需测定，用于确保测试过程中多肽的稳定性；对照组C进样当天配置即可，无需放置24h，其作用是为了考察溶剂对于多肽是否有干扰；对照组D需要和样品同样的处理方法，即需要反应24h，并进行离心和过滤，用于确认样品中的峰与半胱氨酸多肽峰或赖氨酸多肽峰是否存在叠加；对照组E需要和样品同样的处理方法，即需要反应24h，并进行离心和过滤，当阳性对照平均多肽消耗百分比：半胱氨酸多肽60.8％-100％，SD＜14.9％。赖氨酸多肽40.2％-69.4％，SD＜11.6％，符合试验成立条件之一。

(4)高效液相色谱检测：

检测对象：多肽标准溶液、预处理后的样品、对照组(对照组A-E)；

高效液相色谱仪：型号LC-20AT，厂家岛津；

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18，4.6mm×150mm，3.5μm；

色谱柱保护柱：Phenomenon C-18，4×2.0mm；

检测器：DAD检测器；

紫外吸收波长：220nm；

柱温：25℃；

进样量：10μL；

流动相：水(含0.1％三氟乙酸的纯净水)和乙腈(含0.085％三氟乙酸的乙腈溶液，其中乙腈为色谱纯，购自默克公司)

洗脱方式：梯度洗脱(见表4)，具体为：以水和乙腈的体积加和为100％计，在第0-10min内，水的体积百分含量由87％连续降低至64％，乙腈的体积百分含量由13％连续增大至36％；第10-11min内，水的体积百分含量由64％连续降低至10％，乙腈的体积百分含量由36％连续增大至90％；第11-14min内，水的体积百分含量恒定为10％，乙腈的体积百分含量恒定为90％；第14-14.5min内，水的体积百分含量由10％连续增加至87％，乙腈的体积百分含量由90％连续降低至13％；第14.5-22min内，水的体积百分含量恒定为87％，乙腈的体积百分含量恒定为13％。

表4

在检测过程中，液相进样序列包括：标准溶液、对照A、样品对照、对照B、对照C、阳性对照、受试物，具体顺序见表5、表6所示。

表5液相进样序列(半胱氨酸多肽)

表6液相进样序列(赖氨酸多肽)

图1为对照组A中半胱氨酸多肽空白对照样的液相色谱图，验证高效液相的系统稳定性；；

图2为对照组A中赖氨酸多肽空白对照样的液相色谱图，验证高效液相的系统稳定性；

图3为对照组C中半胱氨酸多肽空白对照样的液相色谱图，其作用是为了考察溶剂对于多肽是否有干扰；

图4为对照组C中赖氨酸多肽空白对照样的液相色谱图，其作用是为了考察溶剂对于多肽是否有干扰；

图5为样品对照(对照D)的半胱氨酸多肽液相色谱图，该图表明样品中无峰与半胱氨酸多肽峰叠加；

图6为样品对照(对照D)的赖氨酸多肽液相色谱图，该图表明样品中无峰与赖氨酸多肽峰叠加；

图7为对照组E中半胱氨酸多肽阳性对照样的液相色谱图，当阳性对照平均多肽消耗百分比：半胱氨酸多肽60.8％-100％，SD＜14.9％,符合试验成立条件之一；

图8为对照组E中赖氨酸多肽阳性对照样的液相色谱图，当阳性对照平均多肽消耗百分比：赖氨酸多肽40.2％-69.4％，SD＜11.6％,符合试验成立条件之一；

(5)检测结果分析：

第一步：取STD1连续进样5次，得RSD＝0.224％(如下表7所示)，满足系统适应性要求。根据外标法测定对照组A平均肽浓度，结合对照组B、C峰面积CV值及对照组E(阳性对照)平均多肽消耗百分比以确认试验条件有效(如下表8所示)；

表7

表8

第二步：根据第一步外标法得到的数据为依据，对预处理后的样品的图谱进行分析，可知预处理后的样品中半胱氨酸多肽峰及赖氨酸多肽峰呈现尖锐的峰形，且该峰形附近基本无基质干扰，从而得出预处理后的样品中半胱氨酸多肽及赖氨酸多肽的浓度消耗百分比(结果见表9)，计算公式如下：

多肽的消耗值＝(1-预处理后的样品中多肽峰面积均值/溶剂对照中多肽峰面积均值)×100％

表9

图9为化妆品样品测试溶液对半胱氨酸多肽消耗的液相色谱图，该图9.110min的色谱峰为样品溶液与半胱氨酸多肽混合反应24小时后剩余半胱氨酸多肽的峰；

图10为化妆品样品测试溶液对赖氨酸多肽消耗的液相色谱图，该图6.912min的色谱峰为样品溶液与赖氨酸多肽混合反应24小时后剩余赖氨酸多肽的峰；

(6)致敏性的判断：

第一步：化妆品样品与半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽均不发生共洗脱，采用1:10半胱氨酸多肽和1:50赖氨酸多肽模型进行判定(见表10)。

表10

表10中，反应等级为1级，说明不发生反应或发生轻微反应；反应等级为2级，说明发生弱反应；反应等级为3级，说明发生中度反应；反应等级为4级，说明发生强反应。

对比例1

与实施例1的区别在于将色谱柱换为Agilent ZORBAX SB-C18，2.1mm×100mm，3.5μm，流速为0.5mL/min，洗脱方式不同，其余定量方法均与实施例1相同。其中洗脱程序如表11所示，具体为：以水(含0.1％三氟乙酸)和乙腈(含0.085％三氟乙酸)的体积加和为100％计，在第0-10min内，水的体积百分含量由90％连续降低至80％，乙腈的体积百分含量由10％连续增大至20％；第10-12min内，水的体积百分含量由80％连续降低至10％，乙腈的体积百分含量由20％连续增大至90％；第12-14min内，水的体积百分含量恒定为10％，乙腈的体积百分含量恒定为90％；第14-15min内，水的体积百分含量由10％连续增加至90％，乙腈的体积百分含量由90％连续降低至10％；第15-22min内，水的体积百分含量恒定为90％，乙腈的体积百分含量恒定为10％。

图11和图12分别为本对比例中半胱氨酸多肽和赖氨酸多肽标准品溶液色谱图，从图11和图12可知，若将色谱柱更换为Agilent ZORBAX SB-C18，2.1mm×100mm，3.5μm，且更改洗脱方式和流速，会导致流动相梯度洗脱峰和多肽的峰不能分离，且出峰时间延后，从而影响检测的准确性。

表11

时间(min)	流速(mL/min)	水(％)	乙醇(％)
				0	0.5	90	10
10	0.5	80	20
				12	0.5	10	90
14	0.5	10	90
				15	0.5	90	10
22	0.5	90	10

对比例2

取0.2g与实施例1相同的化妆品样品进行小鼠局部***试验(LLNA:DA)致敏性试验。

结果表明，当化妆品样品中肉桂醛的浓度为3％、5％时，SI＞1.8，致敏性试验呈现致敏阳性，浓度为0.25％、0.5％、0.7％、1.0％、1.5％，则呈现致敏阴性。

通过实施例1和对比例2的对比可知，采用本实施例提供的方法具有较高的灵敏性以及较低的检测限，当肉桂醛的浓度为0.25％即可以检出，而对比例2提供的方法在肉桂醛的浓度不低于3％，才能有所检出。

对比例3

取0.2g与实施例1相同的化妆品样品进行小鼠局部***试验(LLNA:BrdU-ELISA)致敏性试验。

结果表明，当化妆品样品中肉桂醛的浓度为3％时，SI＝1.6，肉桂醛的浓度为5％时，SI＞1.6，致敏性试验呈现致敏阳性，浓度为0.25％、0.5％、0.7％、1.0％、1.5％，则呈现致敏阴性。

通过实施例1和对比例3的对比可知，采用本实施例提供的方法具有较高的灵敏性以及较低的检测限，当肉桂醛的浓度为0.25％即可以检出，而对比例3提供的方法在肉桂醛的浓度不低于3％，才能有所检出。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。