阅读说明：本技术 一种检测s100b的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用 (Photoelectrochemical immunosensor for detecting S100B and preparation method and application thereof ) 是由 沈艳飞 周晴 张袁健 于 2019-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种检测S100B的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用,该光电化学免疫传感器由Nb9共价结合到C60@PCN-224修饰后的基底电极上,S100B通过免疫反应特异性结合到Nb9上,Nb82@CNQDs特异性结合到S100B上制得。本发明利用淬灭剂CNQDs对电极基底上的C60@PCN-224有很好淬灭作用的原理构建了双抗夹心型光电化学免疫生物传感器,用于S100B的检测。本发明与传统的光学等方法相比具有操作简便、技术要求低、反应迅速,价格低廉且易于微型化等特点,将在医学诊断方面发挥重要作用。(The invention discloses a photoelectrochemical immunosensor for detecting S100B, and a preparation method and application thereof, wherein the photoelectrochemical immunosensor is prepared by covalently bonding Nb9 to a substrate electrode modified by C60@ PCN-224, specifically bonding S100B to Nb9 through immunoreaction, and specifically bonding Nb82@ CNQDs to S100B. The invention constructs a double-resistance sandwich type photoelectrochemical immunosensor by utilizing the principle that a quencher CNQDs has good quenching effect on C60@ PCN-224 on an electrode substrate, and the double-resistance sandwich type photoelectrochemical immunosensor is used for detecting S100B. Compared with the traditional optical method and the like, the method has the characteristics of simple and convenient operation, low technical requirement, quick response, low price, easy miniaturization and the like, and plays an important role in medical diagnosis.)

一种检测S100B的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医学检测领域，具体涉及一种检测S100B的光电化学免疫传感器及其制备方法和应用。

背景技术

S100B是一种酸性钙结合蛋白，主要由星形胶质细胞表达和分泌。健康人血清S100B水平较低，脑损伤患者血清S100B水平较高。因此，S100B被认为是一种新兴的脑损伤和血脑屏障功能的生物标志物。目前，S100B的检测一般采用酶联免疫吸附法(ELISA)。尽管ELISA试剂盒具有广泛应用和快速开发的优点，但在实际检测中成本昂贵、耗时长。因此，开发更低成本、更实用、更高效的S100B检测策略具有重要意义。然而，到目前为止，S100B检测的创新方法还很有限，包括电化学方法和光学免疫分析法，这些方法的检测性能还需要大幅度提高，以满足临床诊断的日益增长的需求。

C₆₀作为一种无金属半导体，由于其优异的吸光能力、离域共轭结构和良好的电子接受能力，在有机太阳能电池领域引起了广泛的兴趣。然而，其在光电化学生物传感中应用报道有限，主要是由于生理水溶液体系中原始C₆₀的电子离域和积累能力较差，以及C₆₀与生物分子有效结合的界面不相容。为了克服这些缺点，科研工作者提出了一些策略，如合成C₆₀衍生物，与水溶性氨基酸共价修饰，或在C₆₀上沉积金纳米颗粒，显示出C₆₀，在PEC生物传感领域的巨大潜力。然而，同时保持C₆₀独特的光电子特性和赋予其友好的生物界面仍然存在很大的问题，具有挑战性。

发明内容

发明目的：为了实现检测S100B的方法创新，开发性能更优的检测S100B的光电化学免疫传感器，，本发明将C₆₀和PCN-224复合构建了电子供体-受体结构，得到的复合材料C₆₀@PCN-224的光电转换能力明显提高，并且提供了一种C₆₀@PCN-224为光电活性物质的检测S100B的光电化学免疫传感器，该光电化学免疫传感器操作简便，反应迅速，灵敏度高，能够实现对于微量S100B的检测。

本发明的另一个目的是提供所述光电化学免疫传感器的制备方法。

本发明的另一个目的是提供所述光电化学免疫传感器的应用。

本发明中技术术语的缩写如下：

富勒烯：C₆₀；中-四(4-羧基苯基)卟吩：H₂TCPP；氯氧化锆：ZrOCl₄；卟啉基金属有机框架：PCN-224；捕获抗体：Nb9；标记抗体：Nb82；钙结合蛋白B：S100B；牛血清蛋白：BSA；氧化铟锡半导体电极：ITO；戊二醛：GA；磷酸盐缓冲溶液：PBS；N,N-二甲基甲酰：DMF；体相氮化碳：体相CN；碳氮量子点：CNQDs。

本发明中的原料中捕获抗体：Nb9和标记抗体：Nb82按照文献Highly Selectiveand Sensitive Electrochemical Immunoassay of Cry1C Using Nanobody andπ-πStacked Graphene Oxide/Thionine Assembly(Anal.Chem.2016,88,9830-9836)合成；体相CN按照文献Photocurrent Generation by Polymeric Carbon Nitride Solids:AnInitial Step towards a Novel Photovoltaic System(Chem.Asian J.2010,5,1307–1311)合成。此外，其他原料均由市售可得。其中，H₂TCPP购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司(TCI Development Co.,Ltd)，S100B购于北京义翘神州科技有限公司(SinoBiological Inc.)。

技术方案：为了实现上述目的，如本发明所述一种检测S100B的光电化学免疫传感器，由Nb9共价结合到C₆₀@PCN-224修饰后的基底电极上，S100B通过免疫反应特异性结合到Nb9上，[email protected]特异性结合到S100B上制得。

作为优选，所述基底电极为氧化铟锡半导体电极。

其中，所述C₆₀@PCN-224由PCN-224与C₆₀混合超声，搅拌，即得，所述PCN-224与C₆₀的质量比为1：(0.1-10)。其中C₆₀浓度为0.1-10mg/mL，优选为1mg/mL，溶剂为乙醇。优选PCN-224和C₆₀的质量比为1:1。

所述PCN-224由H₂TCPP、ZrOCl₄、苯甲酸溶解到DMF中，加热反应，洗涤干燥，即得PCN-224。优选的，所述的PCN-224由以下方法制备而成：称取30mg ZrOCl₄,20mg H₂TCPP,1080mg苯甲酸溶于3.2mL DMF，后将上述溶液120℃加热反应6h，洗涤干燥，即得。

其中，所述[email protected]由CNQDs分散液中加入戊二醛搅拌反应，洗涤后重新分散，加入Nb82搅拌孵育，即得[email protected]。优选的，在1mL CNQDs中加入10μL质量分数50％的GA溶液，超声1h，后洗涤，重新分散。在上述溶液中加入100μL 100μg/mL Nb82，在4℃搅拌12h.然后，加入质量分数1％BSA溶液封闭非特异性位点，即得。

进一步地，所述CNQDs由体相CN高温煅烧裂解，用水收集煅烧产生的CN纳米碎片的蒸汽混合物，CNQDs分散在水中，既得CNQDs。所述CNQDs按照文献Hot-Tailoring of CarbonNitride Dots with Red-Shifted Photoluminescence for Visual Double TextEncrypt and Bioimaging(Chem.Eur.J.2019,25,10188-10196)制备。

本发明所述的检测S100B的光电化学免疫传感器的制备方法，包括以下步骤：

(1)信号层固定：将C₆₀@PCN-224分散溶液滴加在基底电极表面，干燥的室温下晾干，用去离子水清洗，晾干；

(2)锚定识别分子：向步骤(1)得到的基底电极表面滴加EDC/NHS混合溶液，室温放置1-2h，用PBS溶液清洗，清洗后将捕获抗体Nb9滴加到基底电极上，4℃孵育8-12h，然后用PBS溶液清洗；

(3)非特异性位点封闭：向步骤(2)得到的基底电极表面滴加BSA溶液，封闭0.5-1h，然后用PBS溶液清洗；

(4)目标分子S100B的结合：将待测S100B抗原溶液滴到步骤(3)得到的基底电极表面，25-37℃孵育1-2h进行特异性反应，然后用PBS溶液清洗；

(5)光电化学免疫传感器的构建：向步骤(4)得到的电极表面滴加[email protected]溶液进行特异性反应，25–37℃孵育1-2h，然后用PBS溶液清洗，晾干，即得光电化学免疫传感器。

其中，步骤(1)中，C₆₀浓度为0.1-10mg/mL，优选为1mg/mL，溶剂为乙醇。C₆₀@PCN-224分散液是过量的，所述过量为滴加的量比实际起作用的量要多，所以反应完要清洗。

其中，步骤(2)中，NHS浓度为20-100mM，优选为50mM，溶剂为0.01M，pH＝6PBS。EDC浓度为50-200mM，优选为100mM，溶剂为0.01M，pH＝6PBS。Nb9的浓度为5-50μg/mL，优选为10μg/mL，溶剂为0.01M，pH＝7.4PBS。清洗用PBS溶液的浓度为0.01M，pH＝7.4。EDC/NHS和Nb9是过量的。

步骤(3)中，BSA的质量分数为0.5-5％，优选为1％，溶剂为0.01M，pH＝7.4PBS。BSA溶液是过量的。

步骤(4)中，S100B的浓度为0.1-100ng/mL,优选为10ng/mL，溶剂为0.01M，pH＝7.4PBS。。

步骤(5)中，Nb82的浓度为5-50μg/mL，优选为10μg/mL，溶剂为0.01M，pH＝7.4PBS。[email protected]是过量的。

本发明所述的检测S100B的光电化学免疫传感器在制备定量检测S100B工具中的应用。

设计原理：C₆₀具有超强的吸光性能，非定域共轭结构和优越的电子接受能力，特别是在激发态下的电子接受能力，是一种有潜力的光电活性物质。C₆₀与PCN-224复合后，构成电子供体-受体体系，不仅增强了光电转换能力，而且可以连接生物分子。本发明基于C₆₀@PCN-224与CNQDs之间竞争利用电解液中的氧气和抗坏血酸，开发了一种夹心型“signal-off”PEC生物传感器用于S100B的灵敏检测。

本发明将C₆₀@PCN-224复合物作为PEC传感器的基底。一方面，C₆₀@PCN-224具有更优异的光电转换能力。另一方面，PCN-224的端基羧基可以共价偶联生物分子，通过酰胺键共价结合大量捕获抗体Nb9，用BSA封闭非特异性位点后，通过特异性反应结合S100B，然后通过特异性反应与[email protected]结合。

本发明提供了一种利用淬灭剂CNQDs对S100B检测的光电免疫生物传感器的方法。[email protected]可以与S100B特异性结合，CNQDs与C₆₀@PCN-224竞争消耗电解液中的氧气和多巴胺，从而有效地淬灭C₆₀@PCN-224信号，进而降低了光电流。此外，由于杂交形成的免疫复合物增加了空间位阻，可以进一步降低了光电流。构建的“signal-off”PEC免疫传感器具有良好的稳定性与灵敏性，将为疾病的早期诊断与治疗提供了新的平台。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明利用淬灭剂CNQDs对电极基底上的[email protected]有很好淬灭作用的原理构建了双抗夹心型光电化学免疫生物传感器，用于S100B的检测。本发明与传统的光学等方法相比具有操作简便、技术要求低、反应迅速，价格低廉且易于微型化等特点，将在医学诊断方面发挥重要作用。

本发明的光电化学免疫传感器以[email protected]作为基底材料，其中C60与PCN-244通过非共价作用复合形成长程有序的电子供体-受体结构，不仅能够提高C60的光电转换能力，而且可以利用PCN-224中配体的羧基与纳米抗体Nb9结合，S100B特异性结合到Nb9上，[email protected]结合到S100B上，CNQDs与[email protected]竞争利用电解液中的氧气和多巴胺，从而降低了光电流。此外，由于免疫反应形成的免疫复合物增加了空间位阻，可以进一步降低了光电流。构建的“signal-off”PEC免疫传感器具有良好的稳定性与灵敏性，检测范围宽，检测限低，误差小、重复率高，与传统的光学等方法相比具有操作简便、技术要求低、反应迅速，价格低廉且易于微型化等特点，将为疾病的早期诊断与治疗提供了新的平台。

附图说明

图1为本发明光电化学免疫传感器组装的示意图。

图2为[email protected]纳米复合材料增强信号的光电流-时间图；

图3为本发明光电化学免疫传感器的组装过程中电极表面光电流-时间图；

图4为抗原浓度对数与光电流降低变化值之间的线性关系图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明进一步进行说明。

实施例1

光电活性物质C₆₀@PCN-224的制备

(1)PCN-224的合成：用分析天平准确称取30mg ZrOCl₄,20mg H₂TCPP,1080mg苯甲酸溶于3.2mL DMF，后将上述溶液在圆底烧瓶中120℃加热反应6h，最后依次用DMF，乙醇多次洗涤，干燥得到。

(2)C₆₀@PCN-224复合物的合成：称取1mg PCN-224，配制1mg/mL分散液，溶剂为乙醇；称取1mg C₆₀，配制1mg/mL分散液，溶剂为DMF。量取PCN-224分散液、C₆₀分散液各1mL，混合超声1h，搅拌12h，即可制得C₆₀@PCN-224复合物,C₆₀@PCN-224分散在乙醇中，浓度为1mg/mL，保存待用。

实施例2

[email protected]的制备

(1)CNQDs按照Hot-Tailoring of Carbon Nitride Dots with Red-ShiftedPhotoluminescence for Visual Double Text Encrypt and Bioimaging(Chem.Eur.J.2019,25,10188-10196)合成。

(2)900μL CNQDs水溶液(1mg/mL)中加入10μL质量分数50％的戊二醛水溶液，避光超声2小时。然后加入100μL Nb82(100μg/mL)PBS(0.01M，pH＝7.4)溶液，在4℃孵育12h，使得Nb82与CNQDs充分反应。最后，在上述溶液中加入10μL质量分数1％BSA0.01M PBS(pH＝7.4)溶液，37℃封闭30min，将制得的[email protected]保存在4℃冰箱中备用。

实施例3

光电免疫传感器的制备方法

按照图1所示步骤组装传感器：

(1)信号层固定

向0.25cm²的ITO上滴加10μL 1mg/mL C₆₀@PCN-224分散液(实施例1)，室温下过夜，干燥后用去离子水清洗，晾干，得C₆₀@PCN-224/ITO基底电极。

(2)锚定识别分子

滴加10μL EDC(100mM)与NHS(50mM)的混合溶液于步骤(1)得到的C₆₀@PCN-224/ITO基底电极，室温放置1-2h，以活化C₆₀@PCN-224表面的羧基，用PBS清洗后向上述电极上滴加10μL 10μg/mL Nb9，4℃孵育12h，使其充分锚定负载在电极材料表面，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液清洗未结合的Nb9。

(3)非特异性位点封闭

为了覆盖电极表面除抗体以外与Nb9结合的非特异性位点，向步骤(2)得到的基底电极表面滴加10μL质量分数1％BSA0.01M PBS(pH＝7.4)溶液，37℃封闭30min，后用0.01MPBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的BSA溶液。

(4)目标分子S100B的结合

滴加10μL S100B PBS(pH＝7.4)溶液(10ng/mL)于步骤(3)得到的基底电极，37℃孵育1h，与Nb9进行免疫反应，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的S100B溶液。

(5)光电化学免疫传感器的构建

向步骤(4)所得的基底电极滴加10μL [email protected] PBS溶液(其中Nb82浓度为10μg/mL，CNQDs浓度为1mg/mL)，37℃孵育2h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去未结合的[email protected]，即得到光电化学免疫传感器。

后将制备好的电极放入1mM多巴胺的磷酸盐缓冲液中检测电极后两步的光电流变化，分析结果。

实施例4

C₆₀@PCN-224的光电活性检测

(1)仪器：上海辰华电化学工作站(chi660e软件)，氙灯光源，万用电表

(2)材料及试剂

ITO：氧化铟锡半导体电极，规格为0.5cm×0.5cm

电解液：1mM多巴胺的磷酸盐缓冲液

试剂：C₆₀,PCN-224,C₆₀@PCN-224

(3)方法：电极处理：ITO电极置于依次分别丙酮，乙醇，超纯水中各超声20min，氮气吹干，用万用电表测试正反并做标记待用。

滴样：向处理过的ITO电极上滴涂10μL 1mg/mL PCN-224的乙醇分散液，在室温下自然晾干，得到由PCN-224修饰的ITO电极；向处理过的ITO电极上滴涂10μL 1mg/mL C₆₀的DMF分散液，在室温下自然晾干，得到由C₆₀修饰的ITO电极；向处理过的ITO电极上滴涂10μL1mg/mL C₆₀@PCN-224的乙醇分散液，在室温下自然晾干，得到由C₆₀@PCN-224修饰的ITO电极。

测试：氙灯光源系统提供光照，利用电化学工作站三电极体系，观察电极表面电流在光照下的强度与其无光照时的差异，比较分别修饰C₆₀,PCN-224,C₆₀@PCN-224三种电极光电流大小。

(4)结果

如图2所示，其中a曲线为PCN-224修饰的ITO电极的光电流信号；b曲线为C₆₀修饰的ITO电极的光电流信号；c曲线为C₆₀@PCN-224修饰的ITO电极的光电流信号。如图2所示，C₆₀/ITO和PCN-224/ITO的光电流都很小，而C₆₀@PCN-224/ITO的光电流约为9.17μA，大约是C₆₀/ITO的8倍。由此证实C₆₀@PCN-224具有更强的光电转换能力，因此以C₆₀@PCN-224作为光电活性物质构建光电化学传感器具有非常优异的信号放大作用。

实施例5

光电化学免疫传感器组装过程中电极表面光电流监测

(1)仪器：同实施例4

(2)材料及试剂：

ITO：同实施例4

电解液：同实施例4

试剂：[email protected]，[email protected]，S100B，Nb9(实施例1-3中制备提供)

(3)方法：

电极处理：同实施例4

传感器组装：按照实施例3进行光电免疫传感器的组装。

测试：氙灯光源系统提供光照，利用电化学工作站三电极体系，依次于0.1M抗坏血酸的磷酸盐缓冲液中检测观察电极表面电流在光照下的强度与其无光照时的差异，探究所构建的免疫传感器的可行性。

(4)结果：

图3为光电化学免疫传感器的组装过程中电极表面光电流-时间图(a为基底电极C₆₀@PCN-224/ITO(实施例2步骤1)，b为Nb9/C₆₀@PCN-224/ITO(实施例3步骤2)，c为S100B/Nb9/C₆₀@PCN-224/ITO(实施例3步骤4)，d为[email protected]/S100B/Nb9/C₆₀@PCN-224/ITO(实施例3步骤5即本发明的光电化学免疫传感器)。从图3可以看出，当C₆₀@PCN-224固定在ITO电极上后，显示出明显的光电流，表明C₆₀@PCN-224是用于构建PEC传感器优异的光电活性材料。然后继续向电极上固定Nb9，发现光电流明显降低，由于Nb9属于生物大分子，阻碍了DA与电极之间电子之间的传递。当进一步组装S100B和BSA后，光电流进一步降低。当修饰[email protected]后，发现光电流显著降低，因为[email protected]特异性结合到电极表面后，CNQDs与C₆₀@PCN-224竞争利用电解液中的氧气和多巴胺，再加上空间位阻的增加，传感器的光电流大大降低。由此，说明光电化学传感器已经成功组装。

实施例6

S100B浓度对数与光电流降低变化值之间的线性关系

(1)仪器：上海辰华电化学工作站(chi660e软件)，氙灯光源，万用电表

(2)材料及试剂

ITO：氧化铟锡半导体电极，规格为0.5cm×0.5cm

电解液：1mM多巴胺的磷酸盐缓冲液

试剂：C₆₀@PCN-224,Nb9,S100B,[email protected],1％BSA

(3)方法：

电极处理：ITO电极处理同实施例4

传感器组装：按照实施例3进行光电免疫传感器的组装。

按照实施例3的(1-3)步骤组装得到捕获抗体Nb9修饰的基底ITO电极后，分别滴加10μL S100B PBS溶液(1pg·mL^-1～100ng·mL^-1，如0.001，0.01，0.1，1，10，100ng/mL)于电极表面，37℃孵育1h,与Nb9进行免疫反应，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的S100B溶液，进行光电化学测试。然后在测试过的电极表面滴加10μL [email protected] PBS溶液，37℃孵育2h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去未结合的[email protected]，再次进行光电流测试。测试：氙灯光源系统提供光照，利用电化学工作站三电极体系，观察电极表面电流在光照下的强度，比较[email protected]组装前后光电流降低的变化值，根据此光电流变化值与S100B浓度的关系定量S100B的浓度。

(4)结果：

通过数据处理和分析，抗原浓度的对数值与对应的光电流值降低值呈相关系数较高的线性关系(如图4所示)，随着抗原浓度的不断增大，对应的光电流值不断降低，经过数据分析，本方法的线性范围为1pg·mL^-1～100ng·mL^-1，最低检测下限为0.41pg·mL^-1。其中1ng·mL^-1S100B的6次平行重复实验检测结果的相对标准偏差为2.54％。

本实施例的得出各种浓度的S100B所对应的光电流值变化，进而做出符合该传感器体系的用于该种S100B检测的标准曲线图，以达到通过测定未知浓度抗原在该传感器体系下所显示出的光电流的变化，通过标准曲线推算出未知浓度抗原的具体浓度的目的。通过上述本方法的线性范围为1pg·mL^-1～100ng·mL^-1，最低检测下限为0.41pg·mL^-1。其中1ng·mL^-1S100B的6次平行重复实验检测结果的相对标准偏差为2.54％。本发明的传感器，可以定量检测S100B，并且效果好，该免疫传感器具有良好的稳定性与灵敏性，检测范围宽，检测限低，误差小、重复率高。

实施例7

实施例7与实施例1制备相同，[email protected]复合物的合成不同之处在于：：PCN-224与C₆₀的质量比为1：10。

实施例8

实施例7与实施例1制备相同，[email protected]复合物的合成不同之处在于：PCN-224与C₆₀的质量比为1：0.1。

实施例9

(1)信号层固定

向0.25cm²的ITO上滴加10μL 1mg/mL C₆₀@PCN-224分散液(实施例1)，室温下过夜，干燥后用去离子水清洗，晾干，得C₆₀@PCN-224/ITO基底电极。

(2)锚定识别分子

滴加10μL EDC(50mM)与NHS(20mM)的混合溶液于步骤(1)得到的C₆₀@PCN-224/ITO基底电极，室温放置1h，以活化C₆₀@PCN-224表面的羧基，用PBS清洗后向上述电极上滴加10μL 5μg/mL Nb9，4℃孵育8h，使其充分锚定负载在电极材料表面，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液清洗未结合的Nb9。

(3)非特异性位点封闭

为了覆盖电极表面除抗体以外与Nb9结合的非特异性位点，向步骤(2)得到的基底电极表面滴加10μL质量分数0.5％BSA0.01M PBS(pH＝7.4)溶液，37℃封闭30min，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的BSA溶液。

(4)目标分子S100B的结合

滴加10μL S100B PBS(pH＝7.4)溶液(10ng/mL)于步骤(3)得到的基底电极，25℃孵育1h，与Nb9进行免疫反应，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的S100B溶液。

(5)光电化学免疫传感器的构建

向步骤(4)所得的基底电极滴加10μL [email protected] PBS溶液(其中Nb82浓度为10μg/mL，CNQDs浓度为1mg/mL)，25℃孵育1h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去未结合的[email protected]，即得到光电化学免疫传感器。

实施例10

(1)信号层固定

向0.25cm²的ITO上滴加10μL 1mg/mL C₆₀@PCN-224分散液(实施例1)，室温下过夜，干燥后用去离子水清洗，晾干，得C₆₀@PCN-224/ITO基底电极。

(2)锚定识别分子

滴加10μL EDC(200mM)与NHS(100mM)的混合溶液于步骤(1)得到的C₆₀@PCN-224/ITO基底电极，室温放置2h，以活化C₆₀@PCN-224表面的羧基，用PBS清洗后向上述电极上滴加10μL 50μg/mL Nb9，4℃孵育12h，使其充分锚定负载在电极材料表面，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液清洗未结合的Nb9。

(3)非特异性位点封闭

为了覆盖电极表面除抗体以外与Nb9结合的非特异性位点，向步骤(2)得到的基底电极表面滴加10μL质量分数5％BSA0.01M PBS(pH＝7.4)溶液，37℃封闭60min，后用0.01MPBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的BSA溶液。

(4)目标分子S100B的结合

滴加10μL S100B PBS(pH＝7.4)溶液(10ng/mL)于步骤(3)得到的基底电极，37℃孵育2h，与Nb9进行免疫反应，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去多余的S100B溶液。

(5)光电化学免疫传感器的构建

向步骤(4)所得的基底电极滴加10μL [email protected] PBS溶液(其中Nb82浓度为10μg/mL，CNQDs浓度为1mg/mL)，37℃孵育2h，后用0.01M PBS(pH＝7.4)溶液洗涤除去未结合的[email protected]，即得到光电化学免疫传感器。