确定肿瘤细胞的侵袭潜能的方法
阅读说明：本技术 确定肿瘤细胞的侵袭潜能的方法 (Method for determining the invasive potential of tumor cells ) 是由 玛纽尔·特里 约兰·马格伦 奥黛尔·菲尔霍尔-科切特 于 2018-05-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及用于预测肿瘤细胞的侵袭潜能和预测治疗效率的方法。所述方法基于至少三个参数即核间距离、极化和细胞-细胞连通度的组合。(The present invention relates to methods for predicting the invasive potential of tumor cells and predicting the efficiency of treatment. The method is based on a combination of at least three parameters, namely internuclear distance, polarization and cell-cell connectivity.)
技术领域
本发明涉及医学领域，特别是肿瘤学。更具体地，本发明涉及根据侵袭性对肿瘤进行分类的方法。
背景技术
癌症侵袭是从原发性肿瘤组织转移扩散到远处器官内而局部发生的病理生理过程。
从肿瘤进行癌症诊断实际上主要是从肿瘤活检的组织学检查来实现的。基于对样本组成的定性估计(细胞和细胞核形态，有丝***频率)，临床医生可以通过使用Nottingham组织学评分系统(也称为Scarff-Bloom-Richardson分级系统的Elston-Ellis修改型式)(Elston CW等人,(1991).《组织病理学》(Histopathology).19:403-410)或WHO/IARC分类(Lantuejoul S等人,(2016).《病理学年鉴》(Ann Pathol.)36:5-14)以树形等级对肿瘤进行分类。基于这种分类，这些方法可用于评估癌症侵袭性，并且对于选择最佳治疗方案至关重要。然而，由于这些方法是基于对因手术而受损的组织样本的组织学特征进行主观和定性估计，因此它们无法对肿瘤来源的细胞特征进行可靠地量化，随后也无法准确地对肿瘤的侵袭潜能进行分类。
侵袭的肿瘤细胞最初包括其细胞内组织的整体形态的深度重组，包括其极性的重新取向。实际上，细胞使其内部极性适应外部事件的能力的缺陷是癌症的标志(Wodarz A等人,(2007).《自然—细胞生物学》(Nat Cell Biol.)9:1016-1024；Lee M等人,(2008).《细胞科学杂志》(J Cell Sci.)121:1141-1150)并且细胞极性的调节剂可以充当肿瘤抑制物(Royer C等人,(2011).《细胞死亡与分化》(Cell Death Differ.)18(9):1470-1477)。触发细胞从静止状态侵袭的分子事件的主要程序称为上皮-间充质转化(EMT)。这个多步骤过程(1)涉及上皮极性的反转，(2)部分到完全的细胞个性化，以及(3)细胞散布到周围组织中起始侵袭(Yeung KT等人,(2017).《分子肿瘤学》(Mol Oncol.)11:28-39)。在最近的研究中，Théry及其同事证实了极性反转是EMT的关键事件(BuruteM等人,(2017).《发育细胞》(DevCell.)40,168-184)。
作为细胞极性的先决条件，内部细胞组织的不对称性是由微管的各向异性分布赋予的，所述微管从成核细胞器——中心体发出(BornensM,(2008).《自然综述—分子细胞生物学》(Nat Rev Mol Cell Biol.)9:874-886)。中心体被描述为主要的微管组织中心，其采用与内部细胞极性高度相关的偏心定位。作为细胞极性的标志，中心体与一百多种调节蛋白相关，使其成为细胞器定位和信号传导途径的空间组织者(Doxsey S等人,(2005).《细胞与发育生物学年评》(Annu Rev Cell DevBiol.)21:411-434)。值得注意的是，在上皮细胞中，中心***于顶极处的细胞-细胞连接处附近，但是在细胞解离并铺在皮氏培养皿——传统上用于培养粘附哺乳动物细胞的无限表面上后，这种定位被破坏了。这表明粘附细胞在无限粘着性表面上的经典培养不能捕获中心体定位调节的这一重要特征，并且随后不适合揭示肿瘤侵袭开始期间发生的细微变化。
为了促进细胞在特定和确定的位置上的粘着，EP1664266和EP2180042公开了一种培养装置，其包括具有确定形状的可粘附细胞的粘着性表面，称为粘着性微图案。这些专利申请还公开了一种控制细胞形状和内部组织的方法，以及这种装置在筛选生物活性化合物中的用途。在这种装置中，一旦细胞附着在这样的表面上，它们就会使用提供的粘着性引发物来采用所述表面的整体形状，而细胞的细胞器则被以受控的组织方式安置。然后可以根据采用粘着性表面几何形状的细胞空间配置对细胞进行归一化。
通过概括涉及上皮细胞极性启动和维持的高级机制线索，M.Théry团队最近取得的突破公开了一种由在H微图案上培养的MCF10A细胞双联体组成的最小上皮模型，该模型在定位方面完全反映了中心体的体内表型(Burute M等人,(2017).《发育细胞》(DevCell.)40,168-184)。这项研究表明，在H微图案上培养的MCF10A细胞在24小时内***，并且所获得的细胞双联体采用具有高度归一化内部组织的标准化形状：中心体偏离中心，靠近细胞间连接处；并且细胞核-中心体轴朝向该连接处取向。在分别使用中心粒周蛋白抗体和Hoechst对中心体和细胞核进行染色，自动图像采集和处理后，细胞极性描述子的定量显示了非常可靠的结果，将极化的细胞分离到连接处(MCF10A中为72％)。添加EMT诱导剂TGF-β可将极化的MCF10A细胞大大降低至32％，引起极性指数的转换，并增加了核间和中心体间的距离。尽管所公开的描述子可以以黑白方式有效地检测健康细胞类型内的EMT，但该研究的重点并未致力于评估肿瘤侵袭。而且，Burute M等人所采用的方法不适合精细地比较具有渐进侵袭性的癌细胞，这将在实施例部分进行说明。
肿瘤诊断实际上是主观的。实际上，由于组织学检查是基于对因手术而受损的组织样本的特征进行主观和定性估计，因此它无法对肿瘤来源的细胞特征进行可靠地量化，随后也无法准确地对肿瘤的侵袭潜能进行分类。另外，肿瘤诊断与治疗选择不直接相关。因此，仍然强烈需要一种根据肿瘤的侵袭潜能对肿瘤进行分类的方法，特别是用于预后以及作为预测个性化医学中的有效药物的伴随测试。
发明内容
本发明涉及一种根据侵袭性和药物反应对肿瘤进行分类的方法。基于这种分类的方法可用于癌症诊断，其阐明肿瘤细胞的侵袭潜能并概述预后，并且可用作专用于个性化医学以预测来自降低肿瘤侵袭或生长的分子的抗肿瘤作用的伴随测试。
因此，本发明涉及一种用于预测肿瘤细胞的侵袭潜能的方法，所述方法包括：
-提供培养装置，其包括平面基底和所述基底上的用于培养粘附细胞至少两组的两个粘着性图案，
其中所述两个粘着性图案通过基本上非粘着性***区域彼此充分隔开，以防止第一粘着性图案上的细胞到达另一粘着性图案；并且，由所述两个粘着性图案和所述***区域覆盖的面积足以粘附两个动物细胞，并且其中每组的两个粘着性图案被疏细胞性周围区域隔开；
-将至少一个肿瘤细胞接种在所述成组的两个粘着性图案上；
-培养所述肿瘤细胞，以便在所述成组的两个粘着性图案上从一次细胞***获得一个细胞双联体；
-在所述成组的两个粘着性图案上对所述肿瘤细胞测量至少以下三个参数：
-每组的两个粘着性图案的核间距离；
-每组的两个粘着性图案的细胞-细胞连通度；和
-在所述成组的两个粘着性图案上高度极化细胞占总细胞群的百分比；
-基于所述至少三个测量参数来确定所述肿瘤细胞的侵袭潜能。
优选地，两个粘着性图案之间的距离在约2/3D至约4/3D之间，D是在没有任何约束的情况下由支撑物上的细胞所覆盖的表面S的直径，并且由粘着性图案覆盖的面积对于每个细胞而言小于在没有任何约束的情况下由支撑物上的细胞所覆盖的细胞表面S的80％。特别地，所述成组的两个粘着性图案具有H形式。
优选地，高度极化的细胞是具有位于细胞-细胞连接处附近、在如下所定义的三角形区域中的中心体的细胞：
|y|≤(x-0.5)*tan 60
其中0.5≤x≤2
其中x是中心体在指向细胞间连接处的细胞核-细胞核轴上的位置并且y是中心体在垂直于细胞核-细胞核轴的轴上的位置，单位是细胞核的半径。
优选地，细胞-细胞连通度是围绕细胞双联体的凸包络的面积与细胞双联体的面积之差。
优选地，除了所测试的肿瘤细胞之外，还将具有预定侵袭潜能的参考细胞接种在装置上，进行培养并测量参数。特别地，所述参考细胞选自具有极低侵袭潜能或无侵袭潜能的细胞，具有低侵袭潜能的细胞，具有中等侵袭潜能的细胞，具有高侵袭潜能的细胞和具有极高侵袭潜能的细胞。
优选地，通过与参照细胞进行比较来确定肿瘤细胞的侵袭潜能。特别地，进行统计分析以确定与所测试的肿瘤细胞具有最高相似性的参考细胞。更优选地，通过主成分分析进行统计分析。
本发明还涉及一种用于提供对受试者的诊断或预后有用的信息的方法，所述方法包括执行根据本发明的用于预测肿瘤细胞的侵袭潜能的方法。
本发明还涉及一种用于评估分子用于治疗受试者中的肿瘤的效率的方法，所述方法包括使所述分子与来自受试者肿瘤的肿瘤细胞接触，确定用所述分子治疗的肿瘤细胞的侵袭潜能，将所确定的用所述分子处理的肿瘤细胞的侵袭潜能与未处理的肿瘤细胞的侵袭潜能进行比较，以及选择使侵袭潜能降低的分子，其中通过根据本发明的用于预测肿瘤细胞的侵袭潜能的方法来确定所述肿瘤细胞的侵袭潜能。
优选地，所述肿瘤是实体肿瘤。特别地，所述实体肿瘤是癌瘤。优选地，所述肿瘤选自乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌、***癌、肝癌、胰腺癌、头颈癌和卵巢癌，优选地选自乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌和甲状腺癌。
具体实施方式
本发明提供了一种根据肿瘤的侵袭潜能对肿瘤进行准确分类的方法。该方法基于三个参数的组合，这三个参数对于根据肿瘤的侵袭潜能对肿瘤进行分类是必要且充分的。所述三个基本参数是核间距离、细胞-细胞连通度以及在若干组的两个粘着性图案上高度极化细胞占总细胞群的百分比。当然，可以将其它参数与这三个基本参数组合。
本发明的一个优点在于，由这种分类得到的结果不仅符合用于诊断的肿瘤生理病理学，而且还提供了对潜在恶性程度的预测以及随后对患者的预后。
本发明的另一个优点在于，所述分类方法能够从化合物影响从肿瘤培养的细胞的行为的效率外推到所述化合物治疗该特定肿瘤的治愈或缓解效率。
因此，本发明涉及一种用于预测肿瘤细胞的侵袭潜能的方法，其包括：
-提供培养装置，所述培养装置包括用于在所述基底上培养粘附细胞的成组的两个粘着性图案，
-将至少一个肿瘤细胞接种在所述成组的两个粘着性图案上；
-培养所述肿瘤细胞，以便在所述成组的两个粘着性图案上从一次细胞***获得一个细胞双联体；
-在所述成组的两个粘着性图案上测量以下三个参数：
-每组的两个粘着性图案的核间距离；
-每组的两个粘着性图案的细胞-细胞连通度；和
-在所述成组的两个粘着性图案上，高度极化细胞占总细胞群的百分比；
-基于所述三个测量参数来确定所述肿瘤细胞的侵袭性。
培养装置
培养装置是专利申请WO2010/046459中公开的装置。特别地，它包括具有特定几何形状的多组粘着性图案，这些粘着性图案防止细胞的旋转运动并赋予它们空间粘着条件，从而实现机械平衡以及固定和可再现的构象。WO2010/046459提供了这样的规则，所述规则允许设计用于以机械稳定且可再现的构象粘附多细胞排列中的两个细胞的装置。所述规则如下：多细胞排列的每个细胞都有一个粘着性图案。两个粘着性图案之间的区域称为***区域。粘着性图案通过基本上非粘着性的***区域彼此充分隔开，以防止第一粘着性图案上的细胞到达另一粘着性图案。当然，粘着性图案还必须足够接近以允许细胞之间的相互作用。已确定，***区域为细胞表面直径(D)的约一倍。粘着性图案优选小于细胞的表面积(S)。这些小的粘着性图案很重要，因为它们为细胞提供了足够的自由度(通过非粘着性区域)，以允许它们彼此楔合。这两个约束条件(粘着性图案和另一个相互作用的细胞)之间的平衡使相互作用的细胞稳定，并使它们处于自然位置，因此稳定且可再现。为了给细胞提供足够的自由度，***区域基本上是非粘着性的。然而，***区域可包括粘着性区域，更优选地为单个粘着性区域，从而帮助细胞彼此相遇并建立相互作用接触。***区域的此粘着性区域的宽度必须较窄(小于细胞直径的1/2)。事实上，如果该区域太大，则可以使细胞到达另一个粘着性图案。具有***区域的两个粘着性图案的面积足以粘附两个动物细胞。当然，为了避免周围细胞(不参与多细胞排列)对多细胞排列的干扰，每组图案都被疏细胞性区域包围。
本发明的装置包括：限定表面的板；以及至少两组的两个粘着性图案，所述两个粘着性图案通过基本上非粘着性的***区域彼此充分隔开，以防止第一粘着性图案上的细胞到达另一粘着性图案，并且具有***区域的两个粘着性图案的面积足以粘附两个动物细胞。换句话说，由两个粘着性图案和***区域覆盖的面积足以粘附两个动物细胞，并且每个细胞粘附至一个单独的粘着性图案。特别地，该板限定平面表面。特别地，由两个粘着性图案和***区域覆盖的面积太大而不能被单个细胞覆盖。因此，该面积远大于1S。例如，对于2个细胞的多细胞排列，此面积将为约2S。
由每个粘着性图案的凸包络限定的面积在约1/2S至约3/2S之间，S是在没有任何约束的情况下由细胞覆盖的面积。在一个优选的实施方案中，由每个粘着性图案的凸包络所限定的面积在约3/4S至约5/4S之间，更优选为约S。例如，S可以在1-2,500μm2之间，更优选在1-1,000μm2之间，还更优选在1-500μm2或500-900μm2之间。S可能取决于细胞类型。然而，由每个粘着性图案的凸包络限定的面积包括高百分比的非粘着性区域，例如至少20％、30％、40％或50％，优选地在20-70％、30-60％或40-50％之间的非粘着性区域。或者，每个细胞的被粘着性图案覆盖的面积小于细胞表面S的80％、70％、60％或50％。例如，每个粘着性图案的面积在细胞表面S的30-80％、40-70％或50-60％之间。一旦达到机械平衡，该面积也可以定义为被一个细胞覆盖的表面。
每个粘着性图案的凸包络可以具有任何种类的形式(例如，圆盘、正方形、矩形、梯形、圆盘碎片、椭圆形等)。在此凸包络上，可以定义长轴和短轴。
粘着性图案可以由单个连接的粘着性表面和/或几个非连接的粘着性表面形成。“单个连接的粘着性表面”优选是指实线或曲线。优选地，“非连接的粘着性表面”优选是指点线或虚线或曲线，或离散的点或区域。在一个优选的实施方案中，粘着性图案由选自线、曲线和点的粘着性元素的组合组成。粘着性点、线、曲线或边缘的宽度优选为0.1至100μm，更优选为1至50μm，还更优选为约8μm。
在一个优选的实施方案中，一组内的两个粘着性图案之间的距离在约2/3D至约4/3D之间。在一个优选的实施方案中，一组内的两个粘着性图案由约3/4D至约5/4D、更优选约D的距离隔开。
在一个优选的实施方案中，基本上非粘着性的***区域包括单个粘着性区。所述单个粘着性区适合于不允许细胞到达另一个粘着性图案。也就是说，该单个粘着性区必须很窄。实际上，平行于粘着性图案的大轴的长而细的粘着性线是不适当的，因为它可以使细胞到达另一个粘着性图案。例如，所述粘着性区是位于一组的两个粘着性图案之间并且宽度小于D，优选小于1/2D，优选小于1/3D，更优选小于1/4D的区域。在一个实施方案中，所述粘着性区可以连接两个粘着性图案，例如作为一条线或一条曲线。在另一个实施方案中，所述粘着性区可以在两个粘着性图案之间而与它们没有任何连接。尽管不希望受到理论的束缚，但认为该粘着性区有助于两个细胞建立细胞-细胞相互作用。在一个优选的实施方案中，基本上非粘着性的***区域的50％是非粘着性的，更优选为60％、75％、80％、85％或90％。单个粘着性区可以包括单个连接的粘着性表面和/或形成粘着性区的几个非连接的粘着性表面。
在一个最优选的实施方案中，本发明的装置使得成组的两个粘着性图案之间的距离在约2/3D至约4/3D之间，优选在约3/4D至约5/4D之间，更优选约D；基本上非粘着性的***区域包括单个粘着性区，所述单个粘着性区位于两个粘着性图案之间，并且宽度小于D，优选小于1/2D，优选小于1/3D，更优选小于1/4D；并且，每个细胞的粘着性图案所覆盖的面积小于细胞表面S的80％、70％、60％或50％。
在一个特定的实施方案中，成组的两个粘着性图案可以采用以下形式：C、X、H、Z和Π。在一个最优选的实施方案中，成组的两个粘着性图案具有H形式。
优选地，所述装置包括多组的两个粘着性图案，所述两个粘着性图案通过细胞不粘附于其上的疏细胞性区域彼此隔开。更特别地，所述装置包括至少两组的两个粘着性图案，优选至少5、10、100、1 000、10 000或100 000组的两个粘着性图案。在一个优选的实施方案中，所述装置包括5至25 000组的两个粘着性图案/cm2，更优选5000至10000组的两个粘着性图案/cm2，还更优选为约7500组的两个粘着性图案/cm2。
粘着性图案或区域包括促进细胞附着的分子。这些分子可以是非特异性的，就像在组织培养处理过的聚苯乙烯皿中的氧化聚苯乙烯一样。所述分子也可以是特定的粘附分子，例如本领域普通技术人员众所周知的分子，并且包括抗原，抗体，细胞粘附分子，细胞外基质分子如I型胶原、IV型胶原，层粘连蛋白，纤连蛋白，合成肽，碳水化合物等。优选地，所述粘着性图案包括细胞外基质分子，更优选地纤连蛋白。
非粘着性表面是惰性表面。适当的惰性表面是被聚乙二醇衍生物覆盖的表面。
所述板是适宜用于共焦、光学和/或荧光显微镜的支撑物。在更优选的实施方案中，所述板是玻璃，可能覆盖有氧化聚苯乙烯薄层。例如，根据本发明的适宜的板是盖玻片或载玻片。支撑物也可以是改性用于细胞培养的塑料。它也可以是热成型的塑料板或经组织培养处理的皮氏培养皿。在本发明中应理解，所述板优选是指没有任何孔的平面表面。或者，所述板可以是杨氏模量为5至100kPa之间的柔软物质。
根据本发明的装置可以包括在同一板上彼此隔开的若干群组的成组粘着性图案，使得每个群组可以在不同的培养基中温育。例如，一个群组的成组粘着性图案可以与一种测试化合物接触，而另一群组可以与另一测试化合物接触或不与任何测试化合物接触。这种隔离可以通过诸如特氟龙密封的物理屏障来提供。例如，参见SPI Supplies的SPI
具有粘着性图案和区域的根据本发明的装置以及疏细胞性区域通过微图案化形成。可以使用微接触印刷或UV图案化。标准方法是本领域技术人员众所周知的。对于综述，参见Whitesides等(Annu.Rev.Biomed.Eng.,2001,第335-373页，更特别是第341-345页)。
肿瘤细胞
所测试的肿瘤细胞可以是任何肿瘤细胞。优选地，肿瘤细胞可以获自具有肿瘤的受试者。肿瘤细胞可以从含有肿瘤细胞的受试者的生物样本中获得。这种生物样本的实例包括活检、器官、组织或细胞样本。优选地，所述生物样本是活检样本。
受试者优选是哺乳动物。它可以是人类或动物。所述动物可以是宠物。例如，受试者可以是狗、猫、马、牛、猪、绵羊和非人灵长类动物等。
任何种类的肿瘤细胞均可用于本发明。细胞可以是例如成纤维细胞、内皮细胞和上皮细胞。在一个优选的实施方案中，所述细胞是上皮细胞。
例如，所述肿瘤细胞可以来自实体或造血肿瘤。优选地，所述肿瘤细胞来自实体肿瘤。实体肿瘤的实例是肉瘤、癌瘤和淋巴瘤。在一个优选的实施方案中，所述实体肿瘤是癌瘤。
所述肿瘤可以选自乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、甲状腺癌、***癌、肝癌、胰腺癌、头颈癌和卵巢癌，优选地选自乳腺癌、结肠癌、肺癌、肾癌和甲状腺癌。
因此，所述方法可以包括提供来自受试者的肿瘤细胞的在先步骤。
参考细胞
除了要测试的肿瘤细胞外，还可以在培养装置上并行使用参考细胞。
参考细胞是先前已经对其确立/确定了侵袭潜能的细胞。这些细胞用于确定侵袭性水平。例如，一个第一参考细胞可以具有低侵袭潜能，而一个第二参考细胞可以具有高侵袭潜能。任选地，可以使用若干种参考细胞，例如选自以下的细胞：具有极低侵袭潜能或无侵袭潜能的细胞，具有低侵袭潜能的细胞，具有中等侵袭潜能的细胞，具有高侵袭潜能的细胞和具有极高侵袭潜能的细胞。在一个优选的实施方案中，在所述方法中使用至少四个参考细胞：具有极低侵袭潜能或无侵袭潜能的细胞，具有低侵袭潜能的细胞，具有中等侵袭潜能的细胞，具有高或极高侵袭潜能的细胞。
例如，不具有侵袭潜能或具有极低的侵袭潜能的细胞可以是非肿瘤细胞(例如，MCF10A或RPE1)。具有低侵袭潜能的细胞可以是例如HCC1143、Hs578T、MDA-MB-468、HCC38、HCC70。具有中等侵袭潜能的细胞可以是例如BT-549、MDA-MB-157、BT-20、HCC1937。具有高侵袭潜能的细胞可以是MDA-MB-231或MDA-MB-436。特别地，MDA-MB-231细胞系被称为极高侵袭性细胞。
参考细胞的侵袭潜能可以通过本领域技术人员可用的任何方法和分类来确定。可根据Nottingham组织学评分系统(Scarff-Bloom-Richardson分级系统的Elston-Ellis修改型式)或WHO/IARC分类确定侵袭潜能。侵袭潜能是指细胞侵袭邻近或远处组织的能力。细胞的运动性可以根据例如金胶体法测量。金胶体法是这样的方法，其中将细胞接种到粘附有胶体金的盖玻片上，并计算在其运动轨迹上形成的缺金部分的面积，从而测量细胞的运动性。细胞的运动性和侵袭潜能可以通过Boyden室测定法等进行评估。在Boyden室测定法中，首先根据通过未涂覆的多孔PET膜的细胞数量评估运动性，然后使用涂有基底膜的PET膜，测量已降解基底膜、穿过孔并迁移到膜下方的细胞数量，并测定已迁移的细胞数的比率，从而评估细胞的侵袭潜能。
或者，可以通过在2D或3D矩阵上迁移细胞的延时显微镜观察，刮痕/伤口愈合测定法或软琼脂侵袭测定法来测量细胞的侵袭潜能。
培养，固定，染色以及图像采集和处理
所述方法包括：将至少一个肿瘤细胞接种在所述成组的两个粘着性图案上的步骤；以及培养所述肿瘤细胞以便在所述成组的两个粘着性图案上从一次细胞***获得一个细胞双联体的步骤。更特别地，将肿瘤细胞在装置上培养足够长的时间，以使肿瘤细胞在所述成组的粘着性图案上***成两个细胞，以粘附至每个所述粘着性图案并达到机械平衡。所述时间段可以取决于肿瘤细胞，并且是本领域技术人员众所周知的。该温育时间通常为1至2天。通常，24小时的周期是足够的。
在一个优选的实施方案中，还接种若干种具有不同侵袭潜能水平的参考细胞并与待测试的细胞肿瘤同时在培养装置上培养。
例如，可以每平方毫米芯片10,000至100,000个细胞的密度接种细胞，例如每平方毫米芯片约25,000个细胞。所述方法可包括漂洗步骤以去除未附着的细胞。
在该温育时间结束时，可以通过本领域已知的任何方法固定细胞，例如通过使用冷甲醇。然后，将细胞染色以可视化中心体和细胞核。例如，用针对中心体蛋白(centrin)、中心粒周蛋白、γ-微管蛋白、ninein、Cep164、Cep192、Odf1、cenexin、centriolin和/或PLK4，优选中心粒周蛋白的抗体对中心体进行免疫染色。例如，可以通过Hoechst标记或DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行染色。
然后，用任何合适的显微镜采集所述成组的两个粘着性图案上的细胞图像。图像采集可以自动实现。
图像分析从一个双联体监测细胞的内部组织。其优选包括细胞核和中心体二值化，计算所述细胞核和中心体的质心，计算所述双联体的细胞核-细胞核向量的长度和取向以及所述双联体的单个细胞内的细胞核-中心体向量，以及整个细胞双联体及其凸包络的面积。
在一个优选的实施方案中，图像处理包括所述成组的两个粘着性图案的个性化，例如使用模板匹配方法；细胞核和中心体的检测，例如基于双联体的每个细胞内的阈值和尺寸过滤；对于每个双联体，计算中心体和细胞核质心的坐标，以及整个细胞双联体及其凸包络的面积。
在一个优选的实施方案中，每种细胞类型需要至少50个细胞双联体来进行分析。但是，所述方法可以完成，对于每种类型的细胞使用50至1000个细胞双联体，优选约100个细胞双联体。
然后，测量将肿瘤细胞根据其侵袭潜能进行分类的必要且充分的三个参数，即核间距离、细胞-细胞连通度和高度极化细胞占总细胞群的百分比。针对待测试的肿瘤细胞和参考细胞测量这些参数。
核间距离
核间距离是所述成组的两个粘着性图案上的两个细胞的细胞核之间的长度。更具体地，核间距离是双联体的两个细胞的核质心之间的长度。
细胞-细胞连通度
细胞-细胞连通度定义为围绕细胞双联体的凸包络的面积与细胞双联体的面积之差。图1A中示出了细胞-细胞连通度。虚线是围绕细胞双联体的凸包络。灰线限定细胞双联体的面积，并且划斜线的区域是围绕细胞双联体的凸包络的面积与细胞双联体的面积之差。细胞双联体的平均面积通常为1100μm2。
高度极化细胞的百分比
如图1A所示，根据中心体相对于细胞核-细胞核轴和垂直轴的位置确定细胞极化。优选地，相对于指向细胞间连接处的细胞核-细胞核轴测量细胞核-中心体向量的取向。相对于细胞核半径将细胞核-中心体距离归一化。因此，正坐标对应于指向相邻细胞的细胞核-中心体轴，而较大的值对应于高度偏离中心的中心***置。
将高度极化的细胞量化为中心体在细胞核-细胞核参考轴上相对于其细胞核的相对坐标，其中细胞核的最大半径是任意单位。
然后将高度极化的细胞定义为具有位于细胞-细胞连接处附近、在如下所定义的三角形区域中的中心体的细胞：
|y|≤(x-0.5)*tan 60
其中0.5≤x≤2
其中，x是中心体在指向细胞间连接处的细胞核-细胞核轴上的位置并且y是中心体在垂直于细胞核-细胞核轴的轴上的位置，单位是任意的细胞核半径。因此，1对应于细胞核半径的长度。
例如，在图1A中，虚线限定了与高度极化的细胞相对应的区域。
高度极化细胞占总细胞群的百分比是如上文所定义的具有高度极化的细胞数除以对于每种细胞所测试的细胞总数(例如，所测试的肿瘤细胞，参考细胞)。更具体地，它是如上文所定义的具有高度极化的细胞数除以细胞总数之比×100。
高度极化细胞的百分比说明了肿瘤中侵袭能力弱的细胞的比例。它与肿瘤的侵袭潜能成反比。
额外描述子
为了确定细胞肿瘤的侵袭潜能，可以进一步考虑额外描述子或参数。例如，可以在由以下组成的群组中选择这样的额外参数：细胞核-中心体距离，细胞核直径，细胞核-中心体距离与细胞核直径之比，细胞双联体面积，细胞核-中心体与细胞核-细胞核轴之间的夹角，细胞双联体的密实性(凸包络与细胞双联体的面积之比)，细胞双联体的密实性变异系数，细胞双联体内的中心体-中心体距离，极性指数(特别是如Burute等人,2017中所定义；也参见图1A)，以及具有完全极性反转的细胞相对于总群体的百分比。
确定侵袭性
基于所述至少三个参数，可以确定所测试的肿瘤细胞的侵袭潜能，特别是通过与具有预定侵袭潜能的参考细胞进行比较来确定。
在第一方面，如图1B和图2A所示，可以基于所述至少三个参数在特征向量表示中分别绘制每个细胞。
在第二方面，进行统计分析以确定与所测试肿瘤细胞具有最高相似性的参考细胞。优选地，通过主成分分析来进行统计分析。在该分析中，可以对每个参数或描述子进行加权以调整其重要性。
统计分析允许确定评分。统计分析导致了不同类别的侵袭潜能的分类。在一个特定的实施方案中，所述方法允许将肿瘤细胞分类为四个类别之一，所述类别为1)无侵袭潜能或极低侵袭潜能，2)低侵袭潜能，3)中等侵袭潜能，和4)高侵袭潜能。
诊断用途
细胞肿瘤的侵袭潜能的确定可用于诊断目的，特别是在肿瘤学领域。因此，根据本发明的方法可以用于诊断或预后目的。特别地，它可以用于对受试者的肿瘤进行分类。
预测药物效率的用途
根据本发明的方法可以用于评估分子在受试者中***的效率。实际上，它可用于测量分子降低肿瘤细胞侵袭潜能的能力。分子也被认为是不同分子的组合。
然后，当执行用于评估分子改变肿瘤细胞的侵袭潜能的效率的方法时，可以在接种在所述成组的两个粘着性图案上之前，在接种在所述成组的两个粘着性图案上之后或者在接种之前及之后，使肿瘤细胞与分子接触。另外，在这种情况下，一个群组的肿瘤细胞与所述分子接触，而另一群组则不与所述分子接触(对照组)。任选地，可以使另一群组的肿瘤细胞与已知降低肿瘤细胞的侵袭潜能的分子接触(作为阳性对照)。任选地，可使肿瘤细胞与分子的组合或与不同分子(每个分子一个群组的肿瘤细胞)接触。
所述方法还可包括以下步骤：如果所述分子降低了来自所述受试者的肿瘤细胞的侵袭潜能，则选择所述分子作为对于治疗受试者是有效的。
因此，用于评估分子在受试者中***的效率的方法包括使所述分子与来自受试者肿瘤的肿瘤细胞接触，确定用所述分子处理的肿瘤细胞的侵袭潜能，比较所确定的用所述分子处理的肿瘤细胞的侵袭潜能与未处理的肿瘤细胞的侵袭潜能，以及选择使侵袭潜能降低的分子。
在另一方面，本发明还涉及一种用于评估分子用于治疗受试者中的肿瘤的效率的方法，其中所述方法包括通过根据本发明的方法确定所述患者的肿瘤细胞的侵袭潜能，以及选择一种已知对在与所述患者的肿瘤细胞具有相同类别的侵袭潜能中分类的肿瘤细胞有效的分子。
定义
“侵袭潜能”意指细胞侵袭邻近或远处组织的能力。
“凸包络”意指包含所述成组的两个粘着性图案的最小凸多边形。
“由凸包络限定的面积”意指由包含在凸包络中的区域覆盖的面积。
“S”意在是指在没有任何约束的情况下被支撑物上的真核细胞(例如，皮氏培养皿、塑料或玻璃盖玻片上的细胞)覆盖的表面。
“D”意在是指具有所述表面S的圆盘的直径。
“两个粘着性图案之间的距离”意指两个粘着性图案的两个较近点之间的距离。
“约”意指大于或小于5％的值。
“双联体”意指固定在成组的两个粘着性图案上的两个细胞。
“描述子”意指量化所分析细胞的特征的参数。
附图说明
图1-图1A和图1B呈现了相关的形态描述子和根据本发明用于区分肿瘤细胞的侵袭潜能的统计程序。图1A。作为结构描述子，高度极化细胞的百分比在单个细胞中被量化为中心体相对于细胞核质心的相对坐标。去除未极化的中心体(灰色点)，然后计算面向连接处的经过滤中心体(黑色点)占中心体总数的百分比。根据本发明使用的其它描述子是核间距离和细胞-细胞连通度，其定义为围绕细胞双联体的凸包络的面积(虚线)与细胞双联体的面积之差。示出了具有渐进侵袭潜能的13种乳腺癌的描述子的结果。图1B。从结果的主成分分析确定的描述子的特征向量表示，显示了根据本发明的描述子之间的相关性。
图2–图2A至图2D示出了根据本发明实现的研究的结果。图2A。每个细胞系重复样本的平均值的中心数据的散点图，并覆盖特征向量。图2B。研究得出的树状图显示了使用根据本发明的三个描述子对13种细胞系的聚类。每个重复样本均单独分类。皮尔逊相关系数，n>300个分析细胞。图2C。根据重复样本的分类对它们进行评分。MCF10A和MDA-MB-231分别任意设置为低侵袭性(评分＝1)和高侵袭性(评分＝4)参考。图2D。随后根据重复样本评分的平均值对13种细胞系的侵袭潜能进行最终分类。
图3–比较数据-图3A至图3C说明了Burute M等人((2017).《发育细胞》(DevCell.)40,168-184)使用的方法，以及为什么这种方法不适合根据肿瘤的侵袭能力对肿瘤进行分类。图3A，Burute M等人((2017).《发育细胞》(Dev Cell.)40,168-184)用于评估MCF10A细胞中的EMT的描述子：极化细胞的百分比，极性指数，核间距离和中心体间距离。图3B，研究的树状图结果显示了使用Burute M等人((2017).《发育细胞》(Dev Cell.)40,168-184)中显示的描述子对13种细胞系进行聚类。皮尔逊相关系数，n>300个分析细胞，一式三份。图3C。随后对13种细胞系的侵袭潜能进行分类。
图4-比较数据-图4A和图4C说明了高度极化细胞的百分比描述子对于有效区分肿瘤细胞的侵袭潜能的重要性。图4A，极化细胞的百分比和核间距离是根据Burute M等人((2017).《发育细胞》(Dev Cell.)40,168-184)的方法定量的，并且如本发明中所定义来确定细胞-细胞连通度描述子。图4B，生成的树状图显示了根据此方法的重复样本的聚类。图4C，根据此方法对13种细胞系的侵袭潜能进行最终分类。MCF10A和MDA-MB-231分别被任意设置为低侵袭性参考和高侵袭性参考。
实施例
一式三份地完成了涉及具有渐进侵袭潜能的13种细胞系的研究。对于每个细胞系，如图1A所示量化核间距离、细胞-细胞连通度和高度极化细胞的百分比，并通过其各自的平均值进行归一化。对这些值进行主成分分析后，特征向量在图1B中表示。这种表示使我们能够直观观察“细胞-细胞连通度”和“高度极化细胞的百分比”描述子之间的反相关性。此外，发现“核间距离”与其它描述子不相关。
然后，如图2A所示，以特征向量表示形式分别绘制每个细胞系重复样本。然后使用皮尔逊相关性计算出绘图坐标，以便分别区分每个细胞系重复样本与其它细胞系。生成的树状图显示在图2B中。因此，可以准确地区分两个主要家族，每个家族包含两个亚家族。因为已知MCF10A和RPE1细胞系是非肿瘤性的，所以它们被用作非侵袭性对照。由于MDA-MB-231是已知具有极高侵袭性的三阴性乳腺癌细胞系，因此它被用作高侵袭性对照。如图2C所示，通过对细胞系和重复样本进行单独评分，平均评分使我们能够忠实地对4个亚家族内的细胞系进行分类。基于该分类，如图2D所示确定每个细胞系的侵袭潜能。此分类的整体研究指出，它能够使非癌细胞系(MCF10A、RPE1)与癌细胞系分别聚类，并能够将低侵袭性上皮细胞与转移灶(MDA-MB-468)至高侵袭性间充质细胞(MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-157)区别开来。此外，根据本发明的方法显示出与每种细胞系的组织学分类具有92％的相关性，与它们的TNBC分类具有84％的相关性以及与其Taub等人的签名(Taube等人,2010,PNAS,107,15449-15454)具有84％的相关性。总而言之，这些结果表明，根据本发明的方法成功地将13种乳腺癌细胞系的侵袭潜能进行了有效分类。
为了证明在Burute M等人((2017).《发育细胞》(Dev Cell.)40,168-184)中使用的方法不适合精细比较癌细胞的渐进侵袭性，本发明人直接尝试通过使用本研究中公开的描述子对13种乳腺癌细胞系进行分类，如图3A中所示。如图3B和图3C所示，皮尔逊相关性分析的结果仅允许对2个家族的细胞系进行分类，从而避免了对癌细胞和非癌细胞的区分，随后也未能对所测试的细胞系进行相关分类。
此外，为了说明“高度极化细胞百分比”描述子对于有效区分肿瘤细胞的侵袭潜能的重要性，发明人通过用“极化细胞百分比”代替所述描述子来重新测试了根据本发明的方法，根据Burute M等人((2017).《发育细胞》(Dev Cell.)40,168-184)进行量化，如图4A中所示。图4B中显示了根据皮尔逊相关性的散点图和由此得到的树状图，它使我们可以将13种乳腺癌细胞系聚类为三个家族。但是，关于图4C的最终分类，因为无法将非癌细胞(MCF10A、RPE1)与癌细胞分别聚类，并且因为非癌细胞系(RPE1)和转移性高侵袭性细胞系(MDA-MB-231)被分类在一起，这种方法未能成功地区分细胞的侵袭潜能。
总而言之，这些结果表明，仅根据本发明的方法能够有效地对13种乳腺癌细胞系的侵袭潜能进行分类。
材料和方法
细胞培养
将BT20、Hs578T、RPE1、MDA-MB-157、MDA-MB-231、MDA-MB-436和MDA-MB-468细胞系在补充有10％FBS(biowest)和1％抗生素-抗霉菌剂(Gibco)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco)中培养。将BT-549、HCC38、HCC70、HCC1143、HCC1937在具有10％FBS和1％抗生素-抗霉菌剂的RPMI 1640(Gibco)中培养。根据ATCC方案，在MEGM生长培养基(Lonza)中培养MCF10A。
细胞微图案化
细胞粘着性图案是从CYTOO(www.cytoo.com)获得的，H 1100μm2，20mm2芯片格式。将细胞以每芯片500,000个细胞的密度接种在培养基中温育24小时。
免疫染色
使用冷甲醇(-20℃)固定细胞10分钟，并在3次PBS(Euromedex)洗涤步骤后，使用0.2％triton X100(Sigma)进行免疫染色15分钟，使用3％BSA(Sigma)进行免疫染色10分钟。以3％BSA添加中心粒周蛋白靶向初级抗体(Abcam)45分钟，然后添加山羊抗兔Alexa488二级抗体(LifeTech)30分钟。PBS洗涤3次后，使用带有DAPI(LifeTech)的ProLong Gold防褪色试剂将芯片固定在显微镜载玻片上。
图像采集
使用具有40倍物镜(Nikon)的Eclipse-Ti旋转圆盘显微镜采集图像。使用以MetaMorph软件(Molecular Devices)编写的自制日志自动完成采集。
图像处理
使用ImageJ(NIH)宏执行图像处理。使用模板匹配方法将第一个荧光细胞粘着性图案个性化。其次，基于双联体的每个细胞内的阈值和尺寸过滤，实现了细胞核和中心体的检测。考虑到仅考虑细胞双联体进行进一步分析，因此仅保留了涵盖两个细胞核和两个中心体的细胞群组。计算细胞核的质心，并将每个中心体分配给最接近的细胞核。第三，计算细胞核-中心体和细胞核-细胞核向量。
然后实现了一个后处理步骤，以便量化双联体内每个细胞的取向和连通度。
核间距离被测量为细胞核-细胞核向量的长度。
细胞-细胞连通度定义为围绕细胞双联体的凸包络面积与细胞双联体的面积之差。
将高度极化细胞占总群体的百分比量化为中心体在细胞核-细胞核参考轴上距其细胞核的相对坐标，其中最大细胞核半径是任意单位。然后将高度极化的细胞定义为具有位于细胞-细胞连接处附近、在如下所定义的三角形区域中的中心体的细胞：
|y|≤(x-0.5)*tan 60
其中0.5≤x≤2
统计分析
为了增加措施的相关性，使用称为主成分分析的统计程序对结构描述子进行加权，并使用XLSTAT软件进行计算。