阅读说明：本技术 一种促进黑麦草耐盐性的方法 (Method for promoting salt tolerance of ryegrass ) 是由 张金林 何傲蕾 牛舒琪 赵祺 李惠茹 邵坤仲 于 2019-10-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种促进黑麦草耐盐性的方法,该发明涉及微生物技术领域,具体包括以下步骤：S1、黑麦草种子消毒处理后,播种在装有蛭石和沙子的花盆中；S2、枯草芽孢杆菌菌株WM13-24和大肠杆菌DH5ɑ均以1％接种量接种于LB液体培养基,分别在28℃和37℃和180r min<Sup>-1</Sup>下避光培养16h,待吸光值OD<Sub>600</Sub>＝0.9时备用,以等体积LB液体培养基为空白对照；S3、待幼苗出土后,将植物材料分为三组,分别接种WM13-24菌液、DH5ɑ菌液和LB液体培养基各600μl于幼苗茎部周围土壤,待幼苗生长一周后进行盐处理,设0、150、300mM NaCl三种盐梯度,两周后取样测定相关生长和生理指标。本发明通过将来自于梭梭根际的枯草芽孢杆菌菌株WM13-24接种于黑麦草根际土壤,能促进黑麦草的耐盐性。(The invention discloses a method for promoting salt tolerance of ryegrass, which relates to the technical field of microorganisms and specifically comprises the following steps: s1, after sterilizing ryegrass seeds, sowing the ryegrass seeds in a flowerpot filled with vermiculite and sand; s2, Bacillus subtilis WM13-24 and Escherichia coli DH5 alpha are inoculated in LB liquid medium at 1% inoculum size at 28 deg.C, 37 deg.C and 180r min respectively ‑1 Culturing in dark for 16h to obtain light absorption value OD 600 When the volume is 0.9, the blank is prepared by using an equal volume of LB liquid culture medium; s3, dividing the plant materials into three groups after the seedlings come out of the earth, respectively inoculating WM13-24 bacterial liquidAnd (2) respectively adding 600 mul of DH5 alpha bacterial liquid and LB liquid culture medium to soil around the stem of the seedling, performing salt treatment after the seedling grows for one week, setting three salt gradients of 0, 150 and 300mM NaCl, and sampling after two weeks to determine related growth and physiological indexes. The invention can promote the salt tolerance of ryegrass by inoculating the bacillus subtilis WM13-24 from the rhizosphere of the haloxylon to the rhizosphere soil of the ryegrass.)

一种促进黑麦草耐盐性的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地说，本发明涉及一种促进黑麦草耐盐性的方法。

背景技术

多年生黑麦草是我国应用最为广泛的一种草坪草和优良牧草，其根系发达，分蘖能力强，成坪速度快，耐磨性好，产量高，茎叶柔嫩，品质优良，是草坪建植的首选品种，也是草食家畜的理想牧草。但是我国土壤盐碱地及受盐碱地危害的中低产田面积逐年增加，使草坪草及优良牧草—黑麦草的生长条件、种植面积均受到了限制。如何提高黑麦草的耐盐性及缓解非生物胁迫对黑麦草造成的危害是本发明拟解决的关键技术问题。

一直以来，盐碱地的土地改良工作是一项复杂的综合工程，要实现真正意义上的盐碱地改良，必须要采取包括工程措施、生物措施、化学措施等在内的综合措施，而这些措施付出的代价大，方法繁琐，效果持续性差等一系列问题。

土壤是农业生产的根本，是生物圈中重要的生命支撑系统，而土壤中的某些微生物有助于土壤能更好的发挥功能，包括营养元素循环，能量流动，植物和土壤动物的营养健康状况，降解残留在土壤中人造化肥和生物制品的毒性等(Norris and Matthews,1994)，这类微生物被称为土壤有益微生物。但是，随着农业现代化技术(如化肥的施用)的发展，化学肥料进入生物圈并引起各种不良的生态反应，造成土壤板结、酸化、有机质含量下降等环境问题，打破了农业生态系统中土壤和植物之间的平衡，这种人为的改变破坏了微生物群落的自然平衡，导致有益微生物丢失及某些病原体进入，从而影响农业生产，使植物生产力下降(吕家珑等，2001)，因此，研发并合理使用新型肥料是非常必要的。复合微生物肥料是一种新型肥料，是将特定的有益微生物与营养物质复合而成，如果有益微生物进入植物生产系统，微生物群落结构的平衡就会被保持，这种群落结构平衡对于提高植物生产力及抗逆性有着重要的意义。因此，在农业生产中，选用本土或者非本土的一些有益微生物来促进植物生长，提高植物逆境适应能力，是一项非常有意义的研究(Antoun andPrévost 2005)。

植物根际促生菌(Plant GrowthPromoting Rhizobacteria,PGPR)属于土壤有益微生物，这类微生物在促进植物生长及提高植物抗逆能力方面发挥着重要的作用。近十年来，我国分离PGPR的来源越来越丰富，其中，假单胞菌属、芽孢杆菌属和肠杆菌属是烟草、苜蓿和小麦根围PGPR的优势菌群，这些菌株可能具有较强的适应逆境的能力和独特的生理生态功能。短小芽孢杆菌、芽孢杆菌和肠杆菌显著提高樱桃根系的生长发育和地上部生物量，简单芽孢杆菌、黄杆菌、嗜冷杆菌和芽孢杆菌对油菜、水稻、玉米具有低温适生特性，促进玉米种子萌发及拟南芥生长，而盐胁迫、干旱和低温条件下，PGPR能更有效地促进植物正常生长发育，提高植物适应逆境的能力。因此，PGPR在解决作物生产中的一些难题和促进农牧业可持续发展具有广阔的应用前景。

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)广泛的分布在自然界中，是PGPR的优势菌种之一，具有拮抗病原菌和促进植物生长的作用，研究表明枯草芽孢杆菌能产生铁载体、抗生素、胞外水解酶和HCN等抑菌代谢产物，有效的保护植物根系免受病原微生物侵害。因此，枯草芽孢杆菌可以作为制备复合微生物肥料的优良菌种。

综上所述，为了更好提高植物抵御盐碱土壤的能力，保障农业生产的发展，复合微生物肥料的研发成为目前创新方法之一。本研究从梭梭根际分离得到根际促生菌枯草芽孢杆菌WM13-24，并将其接种于黑麦草，发现其对提高黑麦草耐盐性具有良好的效果。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供一种促进黑麦草耐盐性的方法，通过将枯草芽孢杆菌WM13-24接种于盐碱地土壤中，能缓解植物受盐胁迫造成的伤害。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种促进黑麦草耐盐性的方法，具体包括以下步骤：

S1、黑麦草种子消毒处理：先用70％乙醇(10min)将黑麦草种子浸泡消毒，接着使用2％NaClO(1min)继续消毒，再用蒸馏水冲洗7-8次，每次3min，洗涤过程中不断搅动，将种子表面的酒精和次氯酸钠冲洗干净；

S2、枯草芽孢杆菌WM13-24和大肠杆菌DH5ɑ菌液制备；

S2.1、先配制LB液体培养基：氯化钠(10g/L)、胰蛋白胨(10g/L)和酵母粉(5g/L)，pH＝7.0；

S2.2、培养基高温121℃灭菌20分钟；

S2.3、待温度冷却为室温后，向LB液体培养基中以1％的接种量将枯草芽孢杆菌WM13-24和大肠杆菌DH5ɑ菌液接种在培养基中，28℃和37℃分别在恒温摇床180rmin^-1避光培养16h，测定菌液浓度为OD₆₀₀＝0.9时，取出备用；

S3、采用盆栽实验种植；

S3.1、将消毒好的黑麦草种子播种(1.0g/盆)在装有蛭石和沙子(1：1)的花盆(直径20cm，深15cm)中，待幼苗露土后，分别接种新鲜枯草芽孢杆菌菌液WM13-24、大肠杆菌DH5ɑ和LB培养基各600μl于幼苗茎部周围，每个处理种植18盆；

S3.2、生长室条件：温度为28℃/23℃(白天/夜间)，相对湿度为70％，光周期为16h/8h(白天/夜间)；

S3.3、接菌后的黑麦草幼苗生长一周后，对幼苗进行盐处理，在1/2Hoagland营养液中分别加入0，150，300mM NaCl进行盐处理；

S3.4、盐处理下的幼苗生长两周后，取样测定相关生理指标。

根据权利要求1所述的一种促进黑麦草耐盐性的方法，其特征在于：所述步骤S1中，70％乙醇将黑麦草种子浸泡消毒时间为10min，再使用2％NaClO继续消毒1min。

在一个优选的实施方式中，所述步骤S2.3中，每100mL的LB液体培养基中添加100μL的枯草芽孢杆菌WM13-24菌液。

根据权利要求1所述的一种促进黑麦草耐盐性的方法，其特征在于：所述步骤S2.3中，培养基在转速为180-250r/min以及温度为28℃的恒温培养摇床上培养过夜。

根据权利要求1所述的一种促进黑麦草耐盐性的方法，其特征在于：所述步骤S2中，枯草芽孢杆菌WM13-24菌株分离自甘肃民勤腾格里沙漠中荒漠植物梭梭根际。

根据权利要求1所述的一种促进黑麦草耐盐性的方法，其特征在于：所述步骤S3.1中，细沙和蛭石的体积比为1：1。

本发明的技术效果和优点：

1、本发明通过将从荒漠植物梭梭根际分离得到的枯草芽孢杆菌WM13-24接种于盐处理后的黑麦草幼苗，能缓解黑麦草盐胁迫下造成的伤害，从而提高其生物量和耐盐性；

2、本发明从梭梭根际分离的枯草芽孢杆菌菌株WM13-24接种在牧草观赏植物—黑麦草幼苗根围，观察黑麦草幼苗在盐胁迫下相关生理指标的变化，以接种体积相同的空白LB液体培养基和大肠杆菌DH5ɑ菌液为对照。发现在盐胁迫下，黑麦草叶绿素含量、根长与根体积以及K⁺/Na⁺含量随着盐浓度的增加逐渐降低，但是接种WM13-24的黑麦草幼苗相关生理指标显著高于两个对照；这说明黑麦草幼苗耐盐能力的提高得益于接种梭梭根际枯草芽孢杆菌WM13-24，从而缓解了盐胁迫对黑麦草幼苗的伤害，进而提高了黑麦草幼苗生物量，使植株长势更好。

附图说明

图1为本发明的在不同盐胁迫下(从上往下分别为：0、150和300mmol·L^-1NaCl)，接种枯草芽孢杆菌WM13-24、大肠杆菌DH5ɑ和空白LB培养基生长两周后的整株黑麦草效果图。

图2为本发明的枯草芽孢杆菌WM13-24对黑麦草叶鲜干重提升的效果图。

图3为本发明的枯草芽孢杆菌WM13-24对黑麦草叶绿素含量提升的效果图。

图4为本发明的枯草芽孢杆菌WM13-24对黑麦草根长、根体积提升的效果图。

图5为本发明的枯草芽孢杆菌WM13-24对黑麦草K⁺/Na⁺含量提升的效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：

一种促进黑麦草耐盐性的方法，具体包括以下步骤：

S1、黑麦草种子消毒处理：先用70％乙醇(10min)将黑麦草种子浸泡消毒，接着使用2％NaClO(1min)继续消毒，再用蒸馏水冲洗7-8次，每次3min，洗涤过程中不断搅动，将种子表面的酒精和次氯酸钠冲洗干净；

S2、枯草芽孢杆菌WM13-24菌液制备；

S2.1、先配制LB液体培养基：氯化钠(10g/L)、胰蛋白胨(10g/L)和酵母粉(5g/L)，pH＝7.0；

S2.2、培养基高温121℃灭菌20分钟；

S2.3、待温度冷却为室温后，向LB液体培养基中以1％的接种量将枯草芽孢杆菌WM13-24菌液接种在LB培养基中，28℃在恒温摇床180r min^-1避光培养16h，测定菌液浓度为OD₆₀₀＝0.8时，取出备用；

S3、采用盆栽实验种植；

S3.1、将消毒好的黑麦草种子播种(1.0g/盆)在装有蛭石和沙子(1：1)的花盆(直径20cm，深15cm)中，待幼苗出土后，接种新鲜菌液WM13-24600μl于幼苗茎部周围，种植18盆；

S3.2、生长室条件：温度为28℃/23℃(白天/夜间)，相对湿度为70％，光周期为16h/8h(白天/夜间)；

S3.3、接菌后的黑麦草幼苗生长一周后，对幼苗进行盐处理，在1/2Hoagland营养液中分别加入0，150，300mM NaCl进行盐处理；

S3.4、盐处理下的幼苗生长两周后，采取植株地上部，测定鲜重和叶绿素含量，80℃烘干至恒重测定干重，然后用干样测定K⁺和Na⁺离子含量，计算K⁺/Na⁺；

得到的实验结果如下：

(1)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种WM13-24菌液的黑麦草叶鲜重分别为：0.144、0.140、0.137g/株；叶干重分别为：24.63、23.72、20.39mg/株，具体见图2。

(2)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种WM13-24菌液的黑麦草叶片叶绿素含量分别为：1.89、1.35、1.97mg^-1g FW具体见图3。

(3)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种WM13-24菌液的黑麦草根体积分别为：2.1、2.0、1.42cm³；根长分别为：16.37、20.7、17.7cm/株，具体见图4。

(4)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种WM13-24菌液的黑麦草植株K⁺/Na⁺分别为：3.46、1.35、0.83，具体见图5。

实施例2：

一种促进黑麦草耐盐性盐的方法，具体包括以下步骤：

S1、黑麦草种子消毒处理：先用70％乙醇(10min)将黑麦草种子浸泡消毒，接着使用2％NaClO(1min)继续消毒，再用蒸馏水冲洗7-8次，每次3min，洗涤过程中不断搅动，将种子表面的酒精和次氯酸钠冲洗干净；

S2、大肠杆菌DH5ɑ菌液制备；

S2.1、先配制LB液体培养基：氯化钠(10g/L)、胰蛋白胨(10g/L)和酵母粉(5g/L)，pH＝7.0；

S2.2、培养基高温121℃灭菌20分钟；

S2.3、待温度冷却为室温后，向LB液体培养基中以1％的接种量将大肠杆菌DH5α菌液接种在LB液体培养基中，37℃在恒温摇床180rmin^-1避光培养16h，测定菌液浓度为OD₆₀₀＝0.8时，取出备用；

S3、采用盆栽实验种植；

S3.1、将消毒好的黑麦草种子播种(1.0g/盆)在装有蛭石和沙子(1：1)的花盆(直径20cm，深15cm)中，待幼苗出土后，接种新鲜菌液大肠杆菌DH5α600μl于幼苗茎部周围，种植18盆；

S3.2、生长室条件：温度为28℃/23℃(白天/夜间)，相对湿度为70％，光周期为16h/8h(白天/夜间)；

S3.3、接菌后的黑麦草幼苗生长一周后，对幼苗进行盐处理，在1/2Hoagland营养液中分别加入0，150，300mM NaCl进行盐处理；

S3.4、盐处理下的幼苗生长两周后，取样测定相关生理指标。

根据权利要求1所述的一种促进黑麦草耐盐性的方法，其特征在于：所述步骤S1中，70％乙醇将黑麦草种子浸泡消毒时间为10min，再使用2％NaClO继续消毒1min。

得到的实验结果如下：

(1)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种DH5ɑ菌液的黑麦草叶鲜重分别为：0.123、0.111、0.098g/株；叶干重分别为：19.55、18.22、17.01mg/株，具体见图2。

(2)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种DH5ɑ菌液的黑麦草叶片叶绿素含量分别为：1.57、1.29、1.57mg^-1g FW具体见图3。

(3)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种DH5ɑ菌液的黑麦草根体积分别为：1.9、1.77、1.04cm³；根长分别为：15.06、13.36、14.41cm/株，具体见图4。

(4)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种DH5ɑ菌液的黑麦草植株K⁺/Na⁺分别为：3.46、1.35、0.83，具体见图5。

实施例3：

一种促进黑麦草耐盐性的方法，具体包括以下步骤：

S1、黑麦草种子消毒处理：先用70％乙醇(10min)将黑麦草种子浸泡消毒，接着使用2％NaClO(1min)继续消毒，再用蒸馏水冲洗7-8次，每次3min，洗涤过程中不断搅动，将种子表面的酒精和次氯酸钠冲洗干净；

S2、LB液体培养基制备；

S2.1、LB液体培养基：氯化钠(10g/L)、胰蛋白胨(10g/L)和酵母粉(5g/L)，pH＝7.0；

S2.2、培养基高温121℃灭菌20分钟冷却至室温备用；

S3、采用盆栽实验种植；

S3.1、将消毒好的黑麦草种子播种(1.0g/盆)在装有蛭石和沙子(1：1)的花盆(直径20cm，深15cm)中，待幼苗出土后，接种LB液体培养基600μl于幼苗茎部周围，种植18盆；

S3.2、生长室条件：温度为28℃/23℃(白天/夜间)，相对湿度为70％，光周期为16h/8h(白天/夜间)；

S3.3、接菌后的黑麦草幼苗生长一周后，对幼苗进行盐处理，在1/2Hoagland营养液中分别加入0，150，300mM NaCl进行盐处理；

S3.4、盐处理下的幼苗生长两周后，取样测定相关生理指标。

得到的实验结果如下：

(1)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种液体LB培养基的黑麦草叶鲜重分别为：0.129、0.113、0.095g/株；叶干重分别为：19.82、17.43、17.75mg/株，具体见图2。

(2)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种液体LB培养基的黑麦草叶片叶绿素含量分别为：1.62、1.26、1.45mg^-1g FW，具体见图3。

(3)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种液体LB培养基的黑麦草根体积分别为：1.99、1.62、1.08cm³；根长分别为：15.6、12.2、14.2cm/株，具体见图4。

(4)在0、150、300mmol·L^-1NaCl的处理下，接种液体LB培养基的黑麦草植株K⁺/Na⁺分别为：3.64、0.94、0.47，具体见图5。

根据上述实施例1、2、3中，将300mM NaCl盐处理下的各接种处理的指标数据提取出来，制得下表，加以比较：

由上表可知，实施例1的接种处理(接种WM13-24菌液)在300mM NaCl盐处理下更能促进黑麦草的生长，种植黑麦草长势更好，叶鲜干重更多，叶绿素含量更高，植株的K⁺/Na⁺显著高于另外两个实施例。

盐碱地的改良一直是世界性难题，很多国家都致力于盐碱地治理和利用。我国耕地受荒漠化、沙化、盐碱化的影响而日益减少，因此，盐碱地改良与治理显得越来越重要。从环保的角度出发，无污染无害的微生物菌肥成了研究者关注的热点。因此，进一步挖掘荒漠植物根际促生菌菌，开发添加耐盐性强的菌肥制剂有助于可持续农业的健康发展。本研究发现，从荒漠植物梭梭根际分离得到的枯草芽孢杆菌WM13-24能缓解植物受盐胁迫造成的伤害；

形态变化是植物受到逆境胁迫最直接的反映。植物在受到盐胁迫时，生理指标会随之变化。叶绿素含量是反映植物光合强度的重要指标。盐胁迫下植物叶绿素含量不仅直接关系到植物光合同化过程，而且也是衡量植物在盐胁迫下耐盐性的重要生理指标之一。叶片鲜干重、根体积、根长、K⁺/Na⁺离子含量等生理指标均能反映植物对盐胁迫耐受程度。

土壤有益微生物可以活化土壤养分、改善土壤理化特性、增加土壤肥力、拮抗病原物、降低植物病害、提高抗病性、增强耐盐性、耐寒性、耐重金属毒性、促进作物生长发育、增加作物产量和改善品质等。PGPR不仅可以在正常环境条件下促进植物生长发育，而且在逆境下也能帮助植物生长。例如，给薄荷接种三种耐盐促生细菌：短小芽孢杆菌SRT2，盐单胞菌(Halomomas desiderata)和微小杆菌(Exiguobacterium oxidotolerans STR36)增加了薄荷的耐盐性。随着盐浓度的提高，使薄荷的鲜重、叶茎比、产油量下降，接种PGPR后，植物受胁迫现象逐渐得到缓解，在中低盐度胁迫下，植物产量有所提高。

植物耐盐能力取决于两个关键因素：植物自身的耐盐能力和促生菌的促生能力。本实验从梭梭根际分离的枯草芽孢杆菌菌株WM13-24接种在牧草观赏植物—黑麦草幼苗根围，观察黑麦草幼苗在盐胁迫下，接种与不接种菌液WM13-24时黑麦草幼苗相关生理指标的变化。发现在盐胁迫下，其叶绿素含量、根长和根体积，K⁺/Na⁺含量随着盐浓度的增加逐渐降低，但是接种WM13-24的黑麦草幼苗各项指标显著高于对照。这说明黑麦草幼苗耐盐能力的提高得益于枯草芽孢杆菌WM13-24的调节作用，从而缓解了盐胁迫对黑麦草幼苗的伤害，进而提高了黑麦草幼苗干物质量、叶绿素含量、根长和根体积、K⁺/Na⁺比，植株长势更良好。

最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。