阅读说明：本技术 一种青蟹血细胞分群培养的方法 (Blue crab blood cell grouping culture method ) 是由 舒妙安 周忆莲 李博 于 2019-10-15 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种青蟹血细胞分群培养的方法,该方法包括：对青蟹表面进行消毒；吸取青蟹血液,与所述抗凝剂进行混合；再将血细胞悬液加入至装有所述细胞分离液的离心管中,进行密度梯度离心,得到三种细胞亚群的分层液；所述细胞分离液的配制方法为：依次向离心管中加入等体积的质量分数分别为80％、60％和30％的Percoll细胞分离液；分别吸出三种不同细胞亚群的细胞悬液,置于不同细胞培养液中,并在28℃、无CO<Sub>2</Sub>添加的条件下进行原代细胞培养。本发明方法采用了特定的抗凝剂和改良的细胞分离液、细胞培养液,不仅操作简单、重复性强、细胞生长稳定,而且显著提高了三种不同细胞亚群的分离效果。(The invention discloses a method for culturing blue crab blood cell groups, which comprises the following steps: sterilizing the surfaces of the blue crabs; sucking blue crab blood, and mixing with the anticoagulant; adding the blood cell suspension into a centrifuge tube filled with the cell separation liquid, and performing density gradient centrifugation to obtain layering liquid of three cell subsets; the preparation method of the cell separation solution comprises the following steps: sequentially adding 80%, 60% and 30% of Percoll cell separation solution with the same volume in a centrifuge tube; respectively sucking cell suspensions of three different cell subsets, placing in different cell culture solutions, and culturing at 28 deg.C without CO 2 Primary cell culture was performed under the conditions of addition. The method adopts specific anticoagulant and improved cell separating medium and cell culture medium, has simple operation, strong repeatability and stable cell growth, and obviously improves the separation effect of three different cell subsets.)

一种青蟹血细胞分群培养的方法

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种青蟹血细胞分群培养的方法。

背景技术

随着生命科学技术的快速发展，细胞工程已愈来愈受到重视。培养原代细胞作为研究材料，一直是细胞生物学、分子生物学和毒理学等科学领域的重要方面。甲壳动物由于细胞培养相关的研究起步较迟，目前尚无成熟的细胞系，因此建立稳定的原代细胞培养体系是目前甲壳动物细胞培养研究的热点。

甲壳动物血细胞是重要的免疫细胞，参与细胞免疫与体液免疫，包括吞噬作用、包囊作用、黑化作用和溶菌作用，以及抗菌肽、凝集素、酚氧化酶和细胞粘附蛋白等细胞因子的释放，是甲壳动物先天免疫的重要组成部分。甲壳动物血细胞由多种细胞组成，根据细胞质内的颗粒数量以及核质比，通常可以分为透明细胞(Hyalinocyte，HC)，半颗粒细胞(Semigranulocyte，SGC)和颗粒细胞(Granulocyte，GC)。不同的细胞类型具有不同的功能，透明细胞主要起到识别病原和吞噬作用，半颗粒细胞发挥包囊作用、存储和释放酚氧化酶原，颗粒细胞也能存储和释放酚氧化酶原、具有细胞毒性。

青蟹是我国沿海重要的经济海水品种，但过高的养殖密度带来了严重的病害威胁，使青蟹的发病率和死亡率居高不下，因此迫切需要有效的病害防治途径和有效药物。建立青蟹血细胞分群培养的方法，可以为甲壳动物细胞生物学、免疫学等领域的研究奠定基础，同时也能为药物筛选提供体外细胞模型。

发明内容

本发明提供了一种青蟹血细胞分群培养的方法，该方法不仅操作简单、重复性强、细胞生长稳定，而且能够更高效的分离三种不同细胞亚群，为甲壳动物细胞生物学、免疫学等领域的研究奠定基础。

具体技术方案如下：

一种青蟹血细胞分群培养的方法，包括以下步骤：

(1)配制青蟹血液的抗凝剂、细胞分离液和细胞培养液；

(2)用海水清洗青蟹后，再对青蟹表面进行消毒；

(3)吸取青蟹血液，与所述抗凝剂进行混合，得到血细胞悬液；再将血细胞悬液加入至装有所述细胞分离液的离心管中，进行密度梯度离心，得到三种细胞亚群的分层液，从上往下分别为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞；

所述抗凝剂的配方为：4.5-5.0g/L柠檬酸，13.0-13.5g/L柠檬酸钠，14.5-15.0g/L葡萄糖，1.0-1.5g/L氯化钠；

所述细胞分离液的配制方法为：依次向离心管中加入等体积的质量分数分别为80％、60％和30％的Percoll细胞分离液；

(4)分别吸出三种不同细胞亚群的细胞悬液，置于不同细胞培养液中，并在28℃、无CO₂添加的条件下进行原代细胞培养；

所述细胞培养液的配方为：以L15培养基为基础培养基，添加0.2mM氯化钠，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和体积分数5-10％的胎牛血清，pH 7.4-7.6。

本发明采用了特定的抗凝剂和改良的细胞分离液、细胞培养液，不仅操作简单、重复性强、细胞生长稳定，而且显著提高了三种不同细胞亚群的分离效果。

作为优选，步骤(2)中，所述海水经过灭菌处理，且盐度为25～35ppt。

作为优选，，步骤(2)中，采用体积分数为70～80％的乙醇水溶液对青蟹表面进行消毒。

作为优选，，步骤(3)中，青蟹血液与抗凝剂混合的体积比为1:1。

作为优选，步骤(3)中，所述密度梯度离心的条件为1200～1500g离心25～35分钟。

作为优选，步骤(4)中，每两天更换一半体积的细胞培养液，并且每6个小时将细胞培养液移至倒置相差显微镜下观察细胞状态。

作为优选，所述的青蟹为拟穴青蟹(Scylla paramamosain)。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明方法采用了特定的抗凝剂和改良的细胞分离液、细胞培养液，不仅操作简单、重复性强、细胞生长稳定，而且显著提高了三种不同细胞亚群的分离效果。

(2)本发明建立了一种稳定的青蟹血细胞原代培养体系，为甲壳动物细胞生物学、免疫学等领域的研究奠定了基础。

(3)本发明有助于在离体条件下研究青蟹先天免疫，为青蟹病害防治途径和药物开发提供帮助。

附图说明

图1为实施例1中分离不同细胞亚群过程中的图片；

其中，A为密度梯度离心以后的分层结果，从上往下分别是细胞碎片(Debris)、透明细胞(HC)、半颗粒细胞(SGC)和颗粒细胞(GC)；hemolymph表示血淋巴；Percoll为细胞分离液的名称；

B为用DAPI染色后在荧光显微镜下鉴定不同细胞亚群的结果图。

图2为实施例1中不同细胞亚群原代细胞培养过程中的显微照片；

其中，A为透明细胞培养24h以后的结果；B为半颗粒细胞培养24h以后的结果；C为颗粒细胞培养24h以后的结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

实施例1

一种拟穴青蟹血细胞分群培养的方法，具体步骤如下：

(1)配制拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血液的抗凝剂、细胞分离液和细胞培养液；

(2)用无菌、盐度为30ppt的海水清洗拟穴青蟹后，再用体积分数为75％的乙醇水溶液对拟穴青蟹表面进行消毒；

(3)用注射器吸取拟穴青蟹血液，与所述抗凝剂进行混合，得到血细胞悬液；再将血细胞悬液加入至装有所述细胞分离液的离心管中，进行密度梯度离心，1400g离心30分钟后，得到三种细胞亚群的分层液，从上往下分别为透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞；

所述抗凝剂的配方为：4.8g/L柠檬酸，13.2g/L柠檬酸钠，14.7g/L葡萄糖，1.2g/L氯化钠；拟穴青蟹血液与抗凝剂混合的体积比为1:1；

所述细胞分离液的配制方法为：依次向离心管中加入等体积的质量分数分别为80％、60％和30％的Percoll细胞分离液；

(4)分别吸出三种不同细胞亚群的细胞悬液，置于不同细胞培养液中，并在28℃、无CO₂添加的条件下进行原代细胞培养；

所述细胞培养液的配方为：以L15培养基为基础培养基，添加0.2mM氯化钠，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素和体积分数5-10％的胎牛血清，pH 7.4-7.6；每两天更换一半体积的细胞培养液，并且每6个小时将细胞培养液移至倒置相差显微镜下观察细胞状态。

结果如图1和图2所示。

实施例2

在试验过程中，针对于不同条件的分离液对分离效果的影响进行过研究；在除采用不同分离液进行密度梯度离心外，其他条件与实施例1相同，结果如表1所示。

表1