阅读说明：本技术 一种树枝状葡糖基纳米颗粒的生物合成方法 (Biosynthesis method of dendritic glucosyl nanoparticles ) 是由 缪铭 袁嘉辉 王艳丽 陈一枚 张涛 金征宇 于 2019-10-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种树枝状葡糖基纳米颗粒的生物合成方法,属于碳水化合物深加工技术领域。本发明以环状糊精为原料,通过基于体外多糖酶制剂协同催化的一锅法合成技术制备得到树枝状葡糖基纳米颗粒。本发明方法不仅工艺简单、反应条件可控和连续化生产,还具有低成本、环境友好等特点,并且所得树枝状葡糖基纳米颗粒的直径尺寸20-100nm,绝对分子量大于1.0×10<Sup>5</Sup>g/mol,多分散系数不超过1.3,分支密度6-12％,可广泛作为载体用于营养食品、药品、化妆品等行业。(The invention discloses a biosynthesis method of dendritic glucosyl nanoparticles, and belongs to the technical field of carbohydrate deep processing. The invention takes cyclodextrin as a raw material, and prepares the dendritic glucosyl nanoparticles by a one-pot synthesis technology based on in vitro polysaccharide enzyme preparation concerted catalysis. The method has the characteristics of simple process, controllable reaction conditions, continuous production, low cost, environmental friendliness and the like, and the diameter size of the obtained dendritic glucosyl nanoparticles is 20-100nm, and the absolute molecular weight is more than 1.0 multiplied by 10 5 g/mol, polydispersion coefficient not more than 1.3, branch density 6-12%, and can be widely used as carrier in the industries of nutritional food, medicine, cosmetics, etc.)

一种树枝状葡糖基纳米颗粒的生物合成方法

技术领域

本发明属于碳水化合物深加工技术领域，具体涉及一种树枝状葡糖基纳米颗粒的生物合成方法。

背景技术

近年来，为了提高活性物质的生物有效性，用以包埋、保护和传递脂溶性生物活性成分的纳米级传输体系应运而生。纳米传输体系凭借其粒度小，相对表面积大，反应活性高，吸附性强的特点，在功能性营养素的传输中极具潜力，其制造和性质研究技术正逐渐成熟。当然，纳米级传输体系的应用也需要满足一定的要求。面对加工、贮存、运输、热处理、干燥、光照、机械外力等，纳米传输体系应具备一定的物理化学稳定性和广泛的适用性。对于传输的生物活性成分，应能抑制其化学降解，提高其口服利用度，实现生物活性成分的控释。现有纳米传递体系采用脂质、蛋白质、表面活性剂、矿物质等单独或组合材料，这些组分决定了载体系统的功能性质，但是也存在生物相容性差、亲水药物包封率不高、机械强度和持久性不足等问题。树枝状聚合物是一种高度支化的聚合物，通常由单体通过化学键连接而成。树枝状聚合物的分子结构并不是完全对称的，其分子形状是椭球形，且在分子的表面分布着大量具有反应活性的基团。树枝状聚合物由于其特殊的结构表现出与线型聚合物不同的性质特征，能够作为载体材料，在制药、化工材料、电子等领域有重要的应用。

目前大部分超支化聚合物主要是由化学法合成，主要的方法有以下几种：缩聚反应，该方法是合成树枝状聚合物最经典的方法，一般是利用具有羧基的单体与具有氨基和羟基的单体发生的聚合；加成反应，一般是发生在不饱和单体上的反应；开环聚合，以杂环化合物为底物，通过中间体开环发生聚合。化学法合成的树枝状聚合物其聚合度和分支度较难控制，其结构具有随机性，且反应的副反应较多，产物需要纯化，制备成本较高，价格昂贵。然而，对葡糖基纳米颗粒聚合物的研究报道较少，至今未见环糊精制备树枝状葡糖基纳米颗粒相关报道。基于上述原因，本发明对一种树枝状葡糖基纳米颗粒的生物合成方法进行了详细研究。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种生物合成方法制备树枝状葡糖基纳米颗粒。

本发明生物合成树枝状葡糖基纳米颗粒的方法具有工艺简单、绿色环保、成本低、安全性高、可连续化生产等特点，其产物应用范围可涉及到食品、医药、日用化学品等多个领域。

本发明的目的通过下述技术方案来实现：

以环状糊精为原料，在体外多糖酶制剂协同催化作用下，一锅法反应得到树枝状葡糖基纳米颗粒；所述体外多糖酶制剂由解聚酶和转苷酶组成。

在本发明的一种实施方式中，所述体外多糖酶制剂中的解聚酶与转苷酶的酶活力配比为10:1-1:10。

在本发明的一种实施方式中，所述解聚酶包括环麦芽糖糊精酶、麦芽糖葡糖基酶、新普鲁兰酶中任意一种或多种组合。

在本发明的一种实施方式中，所述转苷酶为水解糖酶家族13和/或水解糖酶家族57的1,4-α-葡聚糖分支酶。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精包括α-环状糊精、β-环状糊精、γ-环状糊精、大元环糊精中任意一种或多种组合。

在本发明的一种实施方式中，每1g环糊精加入5-20U体外多糖酶制剂进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述反应是以缓冲溶液作为反应介质。所述缓冲溶液为pH7.0磷酸盐缓冲液。所述反应介质的添加量相当于环糊精质量的为5-100倍(mL/g)。

在本发明的一种实施方式中，所述反应的温度为50-70℃。

在本发明的一种实施方式中，所述反应是在50-70℃下保温30-60min，然后加入体外多糖酶制剂恒温反应1-24h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：

每称取10g环糊精溶于50-1000mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，置于50-70℃水浴保温30min后，然后加入50-200U体外多糖酶制剂恒温反应1-24h，反应结束后加热灭酶活、离心处理，将所获得上清液进行真空干燥处理即得目标产物。

本发明有以下优点：

1)本发明充分利用大宗环状糊精为原料，通过现代生物技术开发本产品，提高了其附加值，为其综和开发利用提供一定的依据。所得树枝状葡糖基纳米颗粒的直径尺寸20-100nm，绝对分子量大于1.0×10⁵g/mol，多分散系数不超过1.2，分支密度6-12％，可广泛作为载体用于营养食品、药品、化妆品等行业。

2)本发明步骤简便，易于操作，反应条件可控，同时采用特定的酶催化工艺，成本相对较低，而且采用清洁生产工艺，对环境基本无污染。

附图说明

图1树枝状葡糖基纳米颗粒TEM图；

图2树枝状葡糖基纳米颗粒粒径分布图；

图3树枝状葡糖基纳米颗粒NMR图。

具体实施方式

下面结合实例进一步阐明本发明的内容，但本发明所保护的内容不仅仅局限于下面的实例。

分支密度的测定：利用AVANCEⅢ-400MHz核磁共振谱仪进行¹H谱和¹³C谱分析，测试温度为70℃，5mm PABBO-BB探针，zg30的脉冲序列。¹H谱的测试条件为：8223Hz的扫描宽度，弛豫时间1s，记录16次扫描；¹³C谱的测试条件为：24038Hz的扫描宽度，弛豫时间2s，记录1401次扫描。同时，以潘糖作为参照。利用¹H谱图谱中5.4ppm和5.0ppm处的峰面积可以定量计算α-1,6糖苷键比例，即为分支密度。

环麦芽糖糊精酶、麦芽糖葡糖基酶、新普鲁兰酶的来源：商业化的酶制剂，可购置于Novo Nordisk、DuPont、AB Enzymes、Handary、Magazyme、Sigma等公司。

水解糖酶家族13和/或水解糖酶家族57的1,4-α-葡聚糖分支酶的来源：古生菌、细菌、植物等中任意一种或多种，包括大麦、玉米、稻米、小麦、高粱、红藻、莱茵衣藻、极端嗜热菌A.aeolicus,嗜热脂肪芽孢杆菌B.stearothermophilus，嗜热古生菌T.kodakaraensis，嗜热栖热菌Thermus thermophiles中任意一种，采用生长期籽粒胚乳提取获得或者经过活化培养、发酵产酶获得。可由参照文献(Microbial Starch-Converting Enzymes:RecentInsights and Perspectives.Ming Miao,ComprehensiveReviewsinFoodScienceandFoodSafety.2018)获得。

实施例1：

称取10gβ-环糊精溶于1000mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，置于70℃水浴保温30min后，然后加入100U体外多糖酶制剂(新普鲁兰酶：水解糖酶家族13的1,4-α-葡聚糖分支酶＝1:1)恒温反应6h，反应结束后加热灭酶活、离心处理，将所获得上清液进行真空干燥处理即得目标产物。树枝状葡糖基纳米颗粒的平均尺寸35nm，绝对分子量4.2×10⁶g/mol、多分散系数1.0，分支密度7.3％。

实施例2：

称取10g大元环糊精溶于50mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，置于70℃水浴保温30min后，然后加入200U体外多糖酶制剂(环麦芽糖糊精酶:水解糖酶家族13的1,4-α-葡聚糖分支酶＝10:1)恒温反应24h，反应结束后加热灭酶活、离心处理，将所获得上清液进行真空干燥处理即得目标产物。树枝状葡糖基纳米颗粒的平均尺寸78nm，绝对分子量1.9×10⁷g/mol、多分散系数1.2，分支密度6.7％。

实施例3：

称取10gγ-环糊精溶于250mL磷酸盐缓冲液(pH 7.0)，置于70℃水浴保温30min后，然后加入50U体外多糖酶制剂(麦芽糖葡糖基酶:水解糖酶家族57的1,4-α-葡聚糖分支酶＝1:10)恒温反应2h，反应结束后加热灭酶活、离心处理，将所获得上清液进行真空干燥处理即得目标产物。树枝状葡糖基纳米颗粒的平均尺寸41nm，绝对分子量8.9×10⁵g/mol、多分散系数1.1，分支密度6.1％。

对比例1

参照实施例1，将体外多糖酶制剂的用量分布替换为30U，其他条件不变，制备得到目标产物。所得产物的结果如表1所示。

对比例2

参照实施例1，将体外多糖酶制剂的用量分布替换为300U，其他条件不变，制备得到目标产物。所得产物的结果如表1所示。

对比例3

参照实施例1，将β-环糊精替换为蜡质玉米淀粉，其他条件不变，制备得到目标产物。所得产物的结果如表1所示。

表1对比例1-3所得产物的性能结果

对比例	分布系数	分支密度(％)
			1	1.8	5.8
2	2.1	5.2
			3	2.5	4.3

本申请所描述的具体实施案例仅作为对本发明精神和部分实验做举例说明。本发明所述领域的技术人员可以对所描述的具体实施案例做出各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。