阅读说明：本技术 胃癌血清检测标志物及其检测方法和应用 (Gastric cancer serum detection marker and detection method and application thereof ) 是由 靖大道 金杰 祝青青 张庆华 徐敏 陆颖影 李继坤 王兴鹏 于 2018-07-13 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种胃癌血清检测标志物,该标志物为序列如SEQ ID NO:1所示的多肽分子。本发明还公开了该标志物的检测方法、包含该标志物的试剂盒以及该标志物的用途。本发明通过筛查获得了在早期胃癌患者血清中呈现特异性高表达的多肽分子片段,该多肽分子片段可作为血清检测标志物,用于早期胃癌的辅助诊断检测,从而为胃癌的早期发现、诊断和治疗提供了可能。(The invention discloses a gastric cancer serum detection marker, which is a polypeptide molecule with a sequence shown as SEQ ID NO. 1. The invention also discloses a detection method of the marker, a kit containing the marker and application of the marker. The polypeptide molecular fragment which shows high specificity expression in the serum of an early gastric cancer patient is obtained by screening, can be used as a serum detection marker for auxiliary diagnosis and detection of early gastric cancer, and thus, the possibility is provided for early discovery, diagnosis and treatment of gastric cancer.)

胃癌血清检测标志物及其检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及胃癌的检测，更具体的说，是涉及与胃癌相关的血清多肽分子及其检测方法和应用。

背景技术

胃癌发病率和死亡率均占我国恶性肿瘤的首位，而当前我国胃癌防治的现状是“二高三低”，即发病率高、死亡率高、早期诊断率低、手术根治率低、5年生存率低。确诊的胃癌病例中，早期胃癌仅占2％-10％，与国际胃癌防治水平先进的日本、韩国比较，中国在胃癌防治方面还有相当大的差距。据统计，2004年以来，在日本早期胃癌检诊协会所属医疗机构中，检出的胃癌中超过70％为早期胃癌，如此高的早期胃癌检出率得益于对无症状的日本人群进行胃癌筛选。迫切需要进行早期胃癌有效的筛查，建立早期胃癌的预警系统，提高胃癌早期诊断率，早期胃癌标志物的筛选及建立有着非常重要的作用。

血清检测是一种微创的检测方式，通过检测血清中的标志物，特别是其中的蛋白标志物，可以评判肿瘤的发生和发展情况，为诊断和治疗提供一种可靠的辅助手段，特别是对照早期诊断和治疗，有重要作用。血清中目前公认的肿瘤标记物如CEA、CA125、AFP等，在肿瘤的筛查中起到了重要作用，但是这几个标志物对胃癌的筛查缺乏敏感性和特异性。

血清多肽组学是临床蛋白质组学的一个重要分支，是对其它功能基因组学方法的补充，多肽组学在疾病诊断方面已有大量的研究，但其关于早期胃癌检测的标志物的研究则刚刚起步。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供一种胃癌血清检测标志物，它在早期胃癌患者血清中呈现特异性高表达，可以辅助检测早期胃癌。

为解决上述技术问题，本发明的胃癌血清检测标志物为一多肽分子，该多肽分子的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明要解决的技术问题之二是提供上述胃癌血清检测标志物在血清中的检测方法。该方法采用间接竞争ELISA法，具体包括以下步骤：

1)按照SEQ ID N0:1所示序列合成多肽，包被到酶标板上；

2)在酶标板的每个孔中加封闭液进行封闭；

3)将稀释后的血清样本加入到上述已封闭的反应孔中；将阳性对照和阴性对照分别加入到阳性对照孔和阴性对照孔中；将稀释的酶标多肽抗体加入到酶标板上相应的孔中；

4)配制TMB显色剂，并加入到酶标板各反应孔中进行反应；

5)向酶标板各反应孔中加入终止液，终止反应；

6)将酶标板置于酶标仪中进行读数，并根据读数值，对检测结果进行评价，判断样本中是否含有SEQ ID N0:1所示序列的多肽分子标志物。

上述步骤1)的包被方法优选为：用包被缓冲液将所述多肽稀释至1μg/ml，向酶标板中加50μl，4℃过夜，次日弃去孔内溶液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次，拍干；所述包被缓冲液成分优选为：NaHCO₃ 2.93g，Na₂CO₃ 1.59g，加去离子水至1L。

上述步骤3)，所述酶标多肽抗体优选为标记有HRP的多肽抗体。

上述步骤4)，所述TMB显色剂由显色液A和显色液B在临用前混合而成，显色液A和显色液B的体积比优选为1:1。所述显色液A的成分优选为：0.2M Na₂HPO₄ 25.7ml、0.1M柠檬酸24.3ml、H₂O₂ 0.1％、H₂O 50ml；所述显色液B的成分优选为：TMB 3.9g、柠檬酸10.52g、EDTA 1.86g、甘油2000ml、DMSO 300ml，加H₂O至10000ml。

上述步骤6)的判断方法优选为：将检测结果的阈值设置为阴性对照孔检测数值的1/3，如样本孔的检测数值低于此阈值，则判断所检测样本中含有SEQ ID N0:1所示序列的多肽分子标志物。

本发明要解决的技术问题之三是提供一种包含有上述胃癌血清检测标志物的试剂盒，该试剂盒可用于胃癌血清的ELISA法检测。

进一步的，本发明的试剂盒，还可以包含有：封闭液、样本稀释液、显色液A、显色液B、终止液、酶标抗体、洗液、显色剂、阳性对照、阴性对照、酶标板。

所述样本稀释液优选为0.5-5.0％的BSA溶液。

所述阳性对照优选为按1:500稀释的合成多肽。所述阴性对照优选为1％BSA。

本发明要解决的技术问题之四是提供上述胃癌血清检测标志物的用途。该胃癌血清检测标志物可应用于早期胃癌的血清辅助检测和诊断。

本发明通过筛查获得了在早期胃癌患者血清中呈现特异性高表达的多肽分子片段，该多肽分子片段可作为血清检测标志物，用于早期胃癌的辅助诊断检测，从而为胃癌的早期发现、早期诊断和早期治疗提供了可能。

附图说明

图1是不同组别的血清样本中SEQ ID NO:1所示多肽片段的LC-MS/MS图谱。

图2是不同样本中检测得到的多肽分布韦恩图。

图3是本发明实施例2所用的用于SEQ ID NO:1所示多肽片段检测的ELISA试剂盒的示意图。

图4是图3的试剂盒中的96孔酶标板的结构示意图。

图5是本发明实施例2的间接竞争ELISA法的原理示意图。

附图标记说明如下：

1：封闭液

2：样本稀释液

3：显色液A

4：显色液B

5：终止液

6：HRP标记抗体

7：洗液

8：TMB显色剂

9：阳性对照

10：阴性对照

11：酶标板

111：反应孔

112：拆分线

13：样本多肽

14：多肽抗体

15：包被在酶标板上的多肽

具体实施方式

为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图及具体实施例，对本发明的技术方案做进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1胃癌血清标志物筛选

1.样本采集

取胃癌患者和正常对照人群各10例，采集全血5ml，室温静置30min，室温离心5min(3000g)，收集上层血清200μl/管，保存于-80℃，避免反复冻融。

2.血清样本预处理

取200μl血清，分别加入3倍体积(600μl)的25％乙腈，4℃放置40min；继续加入2.5倍体积的100％乙腈，-20℃沉淀2h后，在4℃下，12000rpm离心30min，分别收集上清和沉淀。上清离心浓缩干燥后得到的沉淀，用300μl 50mM NH₄HCO₃重溶。

3.超滤

在4℃下，12000rpm离心10min后，取上清，加入10kD超滤管进行超滤，收集滤液。

4.还原烷基化，脱盐，干燥。

5.上机分析

干燥后的样品加入10μl上样缓冲液(99.9％水，0.1％甲酸)，震荡10min重溶，离心，取5μl样品加入样品瓶上样分析。每份样品采用纳升流速HPLC液相系统EASY-nLC 1000

(Thermo Scientific，USA)进行分离，经Trap柱，再经C18分析柱分离，流速为300nl/min。经高效液相色谱脱盐及分离后用Orbitrap Elite质谱仪进行分析，质谱结果如图1所示。

6.多肽筛选

对质谱所得到的结果采用Proteome Discoverer1.4库(Thermo Scientific，USA)进行检索分析(参数如表1所示)，鉴定得到如表2所示的多肽列表。

表1 Proteome Discoverer1.4库分析参数

表2多肽列表

统一合并后，正常组得到的unique peptide为147条，胃癌病例组得到的uniquepeptide为119条。unique peptide的分布如图2所示。

对得到的多肽进行统计分析，找出差异多肽，其中，排在第1位的差异多肽如表3所示。

表3显著差异多肽

表3中的多肽分子(氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示)，具有显著性差异。用LC-MS/MS检测该序列所示的多肽在病例组和正常组外周血清中的表达水平，发现该多肽在胃癌病例组中的信号强度远大于正常组(N18)中的信号强度，如表4所示。

表4

上述SEQ ID N0:1所示序列的显著差异多肽是人间α胰蛋白酶抑制因子重链H4(Inter-Alpha-Trypsin Inhibitor Heavy Chain H4，ITIH4)蛋白的一个片段，其精确分子量为2581.3道尔顿。通过对该多肽在样本中出现的频率以及检测到的信号强度的分析，可知，该多肽在早期胃癌患者的外周血清中呈现特异性高表达：健康组血清中检出率为10％(1/10)，早期胃癌组血清中检出率为80％(8/10)，特异性显著(p<0.001)，可以作为潜在血清标志物，用于早期胃癌的辅助诊断。

实施例2间接竞争ELISA法检测血清中胃癌相关多肽分子标志物

本实施例的间接竞争ELISA(酶联免疫吸附测定法)的原理如图5所示，样本中的多肽与包被在酶标板上的多肽共同竞争与标记有HRP(辣根过氧化物酶)的抗体进行反应，即只有与检测样本中的多肽结合剩余的抗体才能与酶标板上包被的多肽结合，未与包被在酶标板上的多肽反应的抗体以及与检测样本中的多肽结合的抗体在清洗过程中被清洗掉，只有与包被在酶标板上的多肽结合的抗体才会与TMB显色剂反应，产生检测信号，检测信号的强度与样本中多肽的含量成反比。

具体的操作步骤如下：

1.包被96孔板

配置包被缓冲液：NaHCO₃ 2.93g，Na₂CO₃ 1.59g，加去离子水至1L，4℃贮存。

用包被缓冲液将按照SEQ ID N0:1所示序列合成的多肽稀释至1μg/ml，ELSIA板的96孔板中加50μl，4℃过夜，次日弃去孔内溶液，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗1次，拍干。

将包被好的96孔板置于-20℃保存，备用。

2.配置显色液

显色液A：0.2M Na₂HPO₄ 25.7ml，0.1M柠檬酸24.3ml，H₂O₂ 0.1％，H₂O 50ml

显色液B：TMB 3.9g，柠檬酸10.52g，EDTA 1.86g，甘油2000ml，DMSO 300ml。以上组分溶解后(注意TMB先用DMSO溶解)，加H₂O至10000ml。

TMB显色液：显色液A与显色液B按体积比1:1于临用前混合。

3.样本检测

1)从试剂盒中取出96孔酶标板，拆分下一条8孔板，每孔加60μl封闭液进行封闭，置于37℃下孵育1小时，之后弃封闭液。

2)血清样本预处理：取50μl血清，加入50μl稀释液进行稀释；

3)取稀释后的血清样本50μl，加入到上述已封闭的反应孔。同时设置好阳性对照孔(加阳性对照——按1:500稀释的合成多肽)和阴性对照孔(加阴性对照——1％BSA)。置于37℃下孵育30min，拍干，用1xTBST洗涤缓冲液以每孔180μl洗2次，拍干。

4)加酶标抗体：将稀释的多肽抗体-HRP(用稀释液按1:3000的比例稀释)以50μl/孔加入8孔酶标板的孔中，置于37℃下孵育30min，之后弃液，用洗涤缓冲液以每孔180μl洗3次，拍干。

5)加TMB显色剂显色：将显色液A与显色液B各取50μl混合，配制成TMB显色剂，现配现用，于各反应孔中加入配制的TMB显色剂100μl，置于37℃下反应5min，终止反应。

6)将8孔酶标板置于预热过的酶标仪中进行读数，并根据读数值，对检测结果进行评价。将检测结果的阈值设置为阴性对照孔检测数值的1/3，如样本孔的检测数值低于此阈值，则判断所检测样本中含有SEQ ID N0:1所示的序列。

对6个血清样本的检测结果如表5所示，其中，样本6的检测数值低于阈值，判定为含有所检测的SEQ ID N0:1所示的多肽序列。

表5

样本1	样本2	样本3	样本4	样本5	样本6	阳性对照孔	阴性对照孔
								1.326	1.287	1.276	0.996	0.969	0.301	0.287	1.287

序列表

<110> 上海市第一人民医院

上海华盈生物医药科技有限公司

<120> 胃癌血清检测标志物及其检测方法和应用

<130> LHJ-NP-18-100023

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Asn Val His Ser Gly Ser Thr Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Gln Gly Ala

1 5 10 15

Lys Ile Pro Lys Pro Glu Ala

20